氢氧化铝在制备治疗肝癌药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及化学药物领域，涉及氢氧化铝[Al(OH)3]化合物在制备抗肝癌药物中的用途。本发明提供了氢氧化铝作为单独成分在制备肝癌治疗药物中的应用。通过小鼠体内肿瘤接种实验、免疫学分析、增殖、凋亡好免疫组化检测等多种实验手段证明：给予氢氧化铝干预后可明显抑制肝癌细胞的体内增殖，诱导中性粒细胞浸润肿瘤、肿瘤细胞凋亡，进而抑制皮下肿瘤的体内生长并提高荷瘤小鼠的生存率，表明氢氧化铝作为单独唯一成分能够有效抑制肝癌细胞的生长，可制备治疗肝癌的药物，还可作为单独成分与其他有效的肝癌干预方法或抗肝癌药物用于肝癌的综合干预措施。
【专利说明】氢氧化铝在制备治疗肝癌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学药物领域，涉及氢氧化铝[A1(0H)3]化合物在制药中的新的用途，具体涉及氢氧化铝[Al (OH) 3]化合物在制备治疗肝癌药物中的应用。
[0002]背景材料
[0003]据报道，原发性肝癌(简称肝癌)是世界范围内第六位的最常见恶性肿瘤，每年新增病例约70余万，其中肝细胞癌约占80%。调查显示肝癌是中国最常见的恶性肿瘤，我国每年新发肝癌病例约占全球发病总数的55%，肝癌已成为我国第二大肿瘤致死原因。至今，临床治疗中手术切除仍是治疗肝癌的最佳治疗方法，也是早期肝癌的首选治疗措施。但由于原发性肝癌发病隐匿，发展快速，导致确诊时能手术切除者仅为10%左右，而且，即使施行手术，仍有许多病例无法完全切除或肿瘤难以避免术后复发。此外，由于手术对人体的创伤较大，常会使患者的免疫力降低，并且导致一系列并发症，因此，临床实践中对于晚期肝癌患者，多因其肝功能不全而无法手术。这一部分病人，需通过各种非手术切除的方法进行治疗，或者先行非手术治疗，使肿块缩小局限，再行手术切除治疗，即二期切除，以使患者获得较好的益处。因此，寻找有效的肝癌非手术治疗方式对于提高肝癌患者，尤其是中晚期肝癌患者的生存率是至关重要的。
[0004]目前,肝癌的非手术治疗措施包括针对肿瘤的化学治疗、放射治疗、免疫治疗和基因治疗等。肿瘤的免疫治疗是近年来兴起的最有前景的新疗法，该疗法能增强免疫系统的自我调节能力，激发特异性免疫反应，从而达到治疗肿瘤并延缓和降低肿瘤复发转移的目的。通常，肝癌的免疫治疗分为以下几类:(I)非特异性免疫治疗，指应用一些免疫调节剂通过非特异性地增强机体的免疫功能，激活机体的抗肿瘤免疫应答，以达到治疗肿瘤的目的；目前应用于肿瘤治疗的有:细胞因子(1L-2、IFN、TNF等)、微生物及其产物、维生素K、热休克蛋白(HSP)等。(2)主动免疫治疗，指利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体产生特异性免疫，进而主动杀伤肿瘤细胞，阻止肿瘤的生长扩散和复发以治疗肿瘤的方法；目前常用的括扩DC疫苗、肿瘤细胞疫苗及异种重组甲胎蛋白疫苗等。(3)过继免疫治疗，指向肝癌患者输入具有抗瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤或激发机体抗瘤免疫效应，从而达到治疗肝癌的目的。
[0005] 氢氧化铝[A1(0H)3]作为美国FDA和中国食品药品监督局批准的唯一人用疫苗佐剂，在疫苗中使用不仅可以提高机体的免疫应答而且具有较好的安全性。氢氧化铝佐剂经80余年的使用，其有效性和安全性已得到了实践的验证和人们的公认，并已获得批准应用于商业性的疫苗，如白百破三联疫苗(DTP)、型流感嗜血杆菌疫苗、乙肝疫苗(HBV)等。有关商品化的氢氧化铝佐剂，其实质是Al (OH) 3的不完全脱水产物，即纤维状结晶形态的粒子，大小4.5nmX2.2nmX 1nm,等电点11.4。这种粒子聚集后以松散的I~10 μ m大小的形式存在。在化学上，氢氧化铝佐剂是以铝羟基形式存在的，其羟基可以提供或接受质子，从而表现为两性化合物。商业产品的佐剂氢氧化铝为近乎透明的溶胶，黏附疫苗抗原后，抗原被限定在胶体形成的特定网格结构中，可通过“储存库效应”和“免疫刺激效应”两种机制增强机体对抗原的免疫应答。储存库效应是指抗原提呈细胞(APC)在对抗原摄取、加工、处理过程中，抗原与免疫细胞作用时间越长，就越有利于后续的免疫应答。氢氧化铝黏附疫苗抗原后，在其表面和内部高度浓聚着许多抗原，物理性的呈递给免疫细胞，而不改变其化学结构，以便于免疫细胞能充分地、高水平地、长时间地与疫苗抗原接触作用，从而使有意义的免疫应答被诱导。免疫刺激效应主要是指氢氧化铝后可激活B细胞母细胞化，进而促进抗体产生。近来随着研究的深入，人们发现氢氧化铝还可通过多种方式刺激机体的免疫效应，包括I)促进炎性细胞的聚集，如中性粒细胞、炎性单核细胞和树突状细胞(DC) ；2)作用于人的外周血单核细胞，诱导单核细胞分化为成熟的CD40+、CD83+DC ；3)诱导动物模型的Th2型免疫应答；4)介导炎性因子的分泌，如通过Nlrp3炎症小体介导IL-1 β分泌；5)通过细胞表面脂类的活化促使DC摄入抗原；6)体外诱导T细胞显著增殖，增强记忆性CD8+T细胞，诱导杀伤性T细胞的分化。
[0006]目前，有关氢氧化铝作为疫苗佐剂的作用机制已在体内外进行了大量的实验研究，但迄今尚未见氢氧化铝单独用于抗肿瘤及其相关机制研究的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供氢氧化铝[Al(OH)3]化合物的新的药用用途。
[0008]本发明提供了氢氧化铝[Al(OH)3]在制备抗肿瘤药物中的用途，尤其涉及氢氧化铝作为单独成分在制备治疗肝癌的药物中的应用。
[0009]本发明的氢氧化铝[Al (OH)3]是指广泛用于多种疫苗的氢氧化铝佐剂。
[0010]本发明提供了氢氧化铝作为单独成分在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明中，进行了荷瘤实验小鼠体内肿瘤接种实验、免疫学分析、增殖、凋亡和免疫组化检测等多种实验手段，结果显示:给予氢氧化铝干预可明显抑制肝癌细胞的体内增殖，诱导中性粒细胞浸润肿瘤、肿瘤细胞凋亡，进而抑制皮下肿瘤的体内生长并提高荷瘤小鼠的生存率,表明本发明采用氢氧化铝作为单独唯一成分能够有效抑制肝癌细胞的生长，具有抗肝癌作用。
[0011]本发明利用氢氧化铝[Al(OH)3]化合物(通过市购渠道获得，本发明的实施例中由复旦大学上海医学院医学分子病毒学实验室提供，)作为单独成分在小鼠肝癌荷瘤模型中进行了实验。通过皮下注射小鼠来源的肝癌细胞系(Hepal-6细胞，本发明的实施例中由第二军医大学王红阳教授实验室提供)，建立小鼠肝癌荷瘤模型，观察小鼠皮下肿瘤的生长情况和小鼠的生存情况，结果显示，空白组和给予生理盐水组皮下肿瘤体积明显增大并有多只实验小鼠死亡，而实验组给药氢氧化铝[Al(OH)3]后仅有一只小鼠死亡，小鼠皮下肿瘤生长速率明显减慢，并有数只小鼠的皮下肿瘤明显缩小，几不可见。通过对小鼠器官的H&E染色，显示给药Al (OH)3后，与空白组和给予生理盐水组相同，小鼠主要脏器未见明显损伤。通过对小鼠皮下肿瘤的免疫组化染色，显示给药Al (OH)3后，肿瘤细胞的增殖明显减慢、细胞凋亡明显增多。
[0012]本发明经实验表明，给予Al (OH)3干预后，可明显抑制肝癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，进而抑制皮下肿瘤的体内生长并提高荷瘤小鼠的生存率，表明本发明的Al (OH)3作为单独唯一成分能够安全、有效地抑制肝癌细胞的生长，具有抗肝癌作用。
[0013]进一步的，本发明所述的Al (OH)3可作为单独活性成分制备治疗肝癌的药物，还可作为单独成分与其他有效的肝癌干预方法或抗肝癌药物用于肝癌的综合干预措施。如，将Al (OH)3作为单独活性成分与手术或放射干预方法或其他抗肝癌药物联合用于肝癌的综合干预。
[0014]本发明为肝癌干预措施的选择和Al (OH)3的临床应用提供了新的思路。
[0015]为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是建立的小鼠肝癌荷瘤模型。
[0017]图2是空白组、生理盐水组和Al (OH)3组小鼠肿瘤生长关系图，
[0018]其中，图2-1是各组小鼠肿瘤的生长曲线；图2-2是给予处理6周后，各组小鼠皮下肿瘤的代表性图片。
[0019]图3是空白组、生理盐水组和Al (OH)3组小鼠的生存曲线。
[0020]图4是空白组、生理盐水组和Al (OH)3组小鼠脏器情况图，
[0021]其中，图4-1是给予处理6周后，各组小鼠脏器的代表性图片；图4-2是各组小鼠脏器的H&E染色图。
[0022]图5是空白组、生理盐水组和Al (OH)3组小鼠皮下肿瘤的Ki67免疫组化染色图。
[0023]图6是空白组、生理盐水组和Al (OH)3组小鼠皮下肿瘤的TUNEL细胞凋亡检测图。
[0024]图7是生理盐水组、Al (OH) 37天和11天开始治疗组的小鼠皮下肿瘤生长曲线图，体内免疫细胞检测及统计图和皮下肿瘤切片的H&E染色图，
[0025]其中图7-1是生理盐水组、Al (OH) 37天和11天开始治疗组的小鼠皮下肿瘤生长曲线图；
[0026]图7-2是生理盐水组、Al (OH) 37天和11天开始治疗组的小鼠脾脏和肿瘤中中性粒细胞的流式检测图及数据统计图；
[0027]图7-3是生理盐水组、Al (OH) 37天和11天开始治疗组的小鼠皮下肿瘤切片的H&E染色图。
【具体实施方式】
[0028]实施例1:小鼠肝癌荷瘤模型的建立
[0029]选取4-6周龄、雄性C57BL/6J小鼠40只，采用皮下注射方式每只接种IX 17个Hepal-6细胞，两周后观察成瘤情况。共有29只小鼠成瘤，随即分为空白组(9只)、对照组给予生理盐水(10只)和实验组给予Al (OH) 3 (10只)。
[0030]实施例2:空白组、生理盐水组和Al (OH) 3组小鼠肿瘤生长情况
[0031]空白组小鼠不予处理、实验组小鼠给予Al (OH) 3溶液(溶于生理盐水)，0.25mg/只，每隔3天一次，腹腔注射。对照组给予等量的生理盐水(0.9% NaCl液体)，每隔3天一次，腹腔注射。给药后每周测量各组小鼠皮下肿瘤大小，计算肿瘤体积(肿瘤体积=肿瘤长径X肿瘤短径2/2)。给予处理6周后，处死各组小鼠，取出皮下肿瘤并绘制肿瘤生长曲线。
[0032]如图2-1和2-2所示，空白组与生理盐水组小鼠的皮下肿瘤生长较迅速，体积明显增大，两组间肿瘤体积和生长曲线无明显差异。给予Al (OH) 3后，小鼠皮下肿瘤生长速度明显减慢，体积明显缩小，实验证实注射Al (OH) 3可明显抑制小鼠体内肝癌细胞的生长。
[0033]实施例3:空白组、生理盐水组和Al (OH) 3组小鼠的生存曲线
[0034]空白组、生理盐水组和Al (OH) 3组小鼠按实施例2所述方法给予处理，每日观察小鼠的生存情况并绘制生存曲线。如图3结果所示，截止至实验结束时，空白组共有4只小鼠死亡，生理盐水组有5只小鼠死亡，而Al (OH) 3组仅有一只小鼠死亡。结果表明注射Al (OH) 3能明显提高荷瘤小鼠的生存率。
[0035]实施例4:空白组、生理盐水组和Al (OH) 3组小鼠脏器情况
[0036]空白组、生理盐水组和Al (OH) 3组小鼠按实施例2所述方法给予处理，6周后处死小鼠，收取各组小鼠脏器(心、肝、脾、肺和肾)，以福尔马林液固定，石蜡包埋，制作切片并进行H&E染色。H&E染色方法:1)脏器组织石蜡切片脱蜡至水；2)苏木精液染色5min，水洗；3)1%盐酸乙醇l_3s,水洗；4)0.5%伊红液染色Imin,水洗；5)脱水封片。
[0037]如图4-1和4-2所示，各组小鼠脏器的形态、体积和组成细胞均未见明显异常，表明注射Al (OH)3对小鼠主要脏器没有明显的损伤作用。
[0038]实施例5:空白组、生理盐水组和Al (OH) 3组小鼠皮下肿瘤的Ki67免疫组化染色
[0039]空白组、生理盐水组和Al (OH) 3组小鼠按实施例2所述方法给予处理，6周后处死小鼠，取出皮下肿瘤组织，以福尔马林液固定，石蜡包埋，制作切片并进行Ki67免疫组化染色。Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中是不可缺少。Ki67作为标记细胞增殖状态的抗原，其阳性染色说明细胞增殖活跃。Ki67染色方法:1)肿瘤组织石蜡切片脱蜡至水；2)3% H202室温lOmin，水洗；3)抗原修复；4)山羊血清封闭 30min ；5)滴加 Κ?67 抗体(1: 100,购自 Cell Signaling Technology 公司),4°C过夜；6)滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(购自上海长岛生物公司)37°C 30min ;7)DAB显色(购自DAKO公司)；8)苏木素复染，盐酸酒精分化；9)脱水封片。
[0040]如图5所示，与空白组和生理盐水组相比，Al (0H)3组小鼠皮下肿瘤中Ki67染色阳性细胞明显减少，证明注射Al (OH)3明显抑制小鼠体内肝癌细胞的增殖。
[0041]实施例6:空白组、生理盐水组和Al (OH) 3组小鼠皮下肿瘤的TUNEL细胞凋亡检测
[0042]空白组、生理盐水组和Al (OH) 3组小鼠按实施例2所述方法给予处理，6周后处死小鼠，取出皮下肿瘤组织，以福尔马林液固定，石蜡包埋，制作切片并进行TUNEL细胞凋亡检测(TUNEL FITC染色试剂盒购自上海睿安生物，实验步骤参见试剂盒说明书)。TUNEL法是应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶的作用在凋亡细胞断裂DNA的末端催化掺入荧光素FITC标记的脱氧三磷酸尿苷，进而在荧光显微镜下直接观察FITC标记细胞，即为凋亡细胞。
[0043]如图6所示，与空白组和生理盐水组相比，Al (OH) 3组小鼠皮下肿瘤中TUNEL FITC染色阳性细胞明显增多，证明注射Al (OH)3明显诱导小鼠体内肝癌细胞的凋亡。
[0044]实施例7:铝佐剂治疗方案的确立及机制研究
[0045] 选取5-6周龄、雄性C57BL/6J小鼠21只，随机分为3组，每组7只，采用皮下注射方式每只小鼠分别接种I X 17个Hepal-6细胞，两组实验组小鼠分别于接种后7，11天开始给予Al (OH) 3溶液(溶于生理盐水)，0.25mg/0.25mL/只，每隔3天一次，腹腔注射。对照组于接种后7天给予等量的生理盐水(0.9% NaCl液体)，每隔3天一次，腹腔注射。给药后每周测量各组小鼠皮下肿瘤大小两次，并计算肿瘤体积(肿瘤体积=肿瘤长径X肿瘤短径2/2)。最后一次免疫后3天，处死所有小鼠，取其脾脏经研磨，裂红等处理，获得单细胞悬疑，进行中性粒细胞，巨噬细胞，N K,C D4，C D8T，T r e g等细胞流式检测。肿瘤组织经剪切，胶原酶和DNA酶消化处理后获单细胞悬液，进行中性粒细胞和巨噬细胞的流式检测。并取部分肿瘤组织进行病理切片，参照实例2进行HE染色。
[0046]如图7-1所示，当接种后7天开始给予Al (OH) 3后，小鼠皮下肿瘤生长速度明显减慢，体积明显缩小。而生理盐水组和Al(OH)3Il天治疗组小鼠的皮下肿瘤生长较迅速，体积明显增大。实验证实接种后7天开始给予Al (OH) 3治疗可明显抑制小鼠体内肝癌细胞的生长。
[0047]经过对小鼠脾脏和肿瘤中细胞进行流式分析，结果显示，小鼠脾脏中中性粒细胞(CDllb+Grl+)随肿瘤的增大而增多，而肿瘤中的中性粒细胞则随肿瘤的增大而减少，(如图7-2)对切片进行HE染色可见Al (OH) 37天治疗组肿瘤内有大量的中性粒细胞，其形态为具典型的分叶核的细胞(如图7-4)。在显微镜下观察肿瘤的切片结果可见:1) 100倍下发现注射铝佐剂会引起肿瘤内细胞的坏死，Al (OH) 37天治疗组的坏死比11天治疗组的程度严重，生理盐水组未见任何坏死；2)400倍下可见Al (OH) 37天治疗组的肿瘤内有大量的中性粒细胞的侵润，而在生理盐水组和Al (OH) 311天治疗组的小鼠肿瘤内少有中性粒细胞的侵润，几乎全是肿瘤细胞；3) Al (OH) 37天治疗组的肿瘤内除了坏死，还见有坏死后的纤维化修复，而在其他两组则见到大量的肿瘤细胞处于核分裂相，表明肿瘤细胞生长旺盛(如图7-4)。鉴于中性细胞具有抗肿瘤的作用，据文献报道肿瘤微环境内的TGF-β可诱导中性粒细胞的功能发生变化 ，发挥促肿瘤生长的功能，当阻断TGF-β后，中性粒细胞则具有抑制肿瘤生长的功能；从本实验7天和11天治疗组的效果差异可能也是因为肿瘤微环境的变化所致。
【权利要求】
1.氢氧化铝[Al(OH) 3]化合物作为单独唯一成分在制备治疗肝癌药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的氢氧化铝抑制肝癌细胞的体内增殖。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的氢氧化铝诱导中性粒细胞浸润肿瘤和诱导肿瘤细胞凋亡。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，氢氧化铝作为单独成分联合其他有效的抗肝癌药物在制备治疗肝癌药物中的应用。
5.根据 权利要求1所述的用途，其特征在于，氢氧化铝作为单独成分联合其他有效的肝癌干预方法在制备肝癌综合治疗措施中的应用。
6.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的其他有效的肝癌干预方法选自手术或放射干预方法。
【文档编号】A61P35/00GK104042628SQ201310084217
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2013年3月15日
【发明者】王红阳, 闻玉梅, 王宾, 付静, 王波, 任一彬, 朱俊杰, 汪萱怡 申请人:复旦大学, 中国人民解放军第二军医大学