本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种基于crispr的dna检测和分型方法，具体为一种crispr分型pcr的方法(简称ctpcr方法)及其应用。
背景技术：
：对于基础研究、各种检测及诊断应用，dna检测和基因分型一直很重要。因此，dna检测和基因分型技术一直受到广泛关注，从而促进了该类技术发展。简而言之，主要有三类dna检测和基因分型技术被广泛应用。第一种是基于聚合酶链反应(pcr)的各种技术。pcr是最常用的dna检测和基因分型技术。基于pcr的dna检测和基因分型主要依赖于特异性引物的设计和多重pcr扩增。pcr检测可以通过传统pcr(tpcr)，定量pcr(qpcr)和最近开发的数字pcr来实现。因为具有明显的优点，如实时检测和高灵敏度，q-pcr在几乎所有的研究、检测和诊断实验室中得到高度普及。现在已经开发出更准确的数字pcr，作为临床检测工具，具有很大的潜力和优势。然而，pcr技术在用于区分高度相关的基因型时，要受到多重扩增和高度特异性引物的限制。除pcr技术外，dna微阵列等多种dna杂交技术也被广泛用于检测和分型dna。然而，由于其昂贵的设备，复杂的检测流程和不可避免的非特异性杂交，dna微阵列技术不能像pcr一样成为常规dna检测和基因分型工具。dna测序是另一种有效的dna检测和基因分型技术。特别是随着下一代测序(ngs)技术的出现，诸如illuminanovaseq等ngs平台的dna测序工具越来越多。然而，由于需要昂贵的设备和化学试剂，它们仍然不能像pcr一样用于常规研究，检测和诊断。因此，相比之下，如果克服了引物设计的限制，pcr仍然是最方便、经济高效的dna检测和基因分型的平台。ishino等人于1987年首次在大肠杆菌(e.coli)的基因组中发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列，并由jansen等人在2002年定义为crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)。crispr系统有三种不同类型(i，ii和iii型)。i型和iii型系统需要多种cas蛋白互相作用才能发挥正常功能，因此要比ii型复杂很多。在ii型系统中，只需要一种蛋白(cas9)，cas9与引导rna(grna)结合后能够特异地识别和切割双链dna(dsdna)。cas9是ii型系统的标志蛋白，在反式激活crrna(tracrrna)和crisprrna(crrna)的引导下发挥作用。tracrrna能够激活cas9核酸酶，crrna特异地与靶dna的20个核苷酸序列互补。因此crrna决定了crispr-cas9系统的特异性。将tracrrna和crrna整合成一个rna即单导向rna(sgrna)后，极大地简化了ii型crispr系统的应用。cas9介导的位点特异性切割依赖于sgrna和pam(protospaceradjacentmotif)。如果目标dna中有pam，在sgrna的引导下，cas9在pam上游三个碱基处切割靶dna。目前，由于简便和高效，crispr-cas9系统已被许多研究者广泛应用于基因组编辑领域。另外,dcas9(deadcas9)是由cas9改造而成，其失去了核酸酶活性，但保留基因转录激活结构域(ad)或抑制结构域(id)，dcas9(deadcas9)作为一种新的人工转录因子已被广泛应用于内源性基因表达调控。尽管cas9/sgrna已广泛应用于基因编辑和调控，但很少应用于核酸检测。凭借高特异性的dna切割能力(能够区分单碱基)，cas9/sgrna在dna检测和分型上有具有很大的潜力。例如，crispr-cas9系统已被用于检测zika病毒并且能够对美国和非洲zika病毒进行分型(scitranslmed.2017,9(388).pii:eaag0538.doi:10.1126/scitranslmed.aag0538)。基于crispr的高特异性，crispr-cas9在区分病毒株时可以达到单碱基的分辨率，可以在单碱基水平上对直系同源的细菌和病毒进行分型检测。目前，随着cas9蛋白的商业化生产，基于cas9的dna检测技术逐渐迎来新的发展。例如有报道将cas9/sgrna用于处理血液游离dna(cfdna)，用以消除野生型基因型，便于富集ctdna中的疾病相关突变型基因型，使突变型基因型可用pcr扩增进行检测(oncogene，2017，36：6823-6829)。此外，我们将pcr技术与cas9/sgrna系统项结合，已经发展了两种新的dna检测及分型技术，被命名为“crispr-分型pcr(crispr-typingpcr，ctpcr)”；这些技术已经申报了国家发明专利(201711146674.2、201711156103.7)，并发表了学术论文(analbioanalchem,2018,doi:10.1007/s00216-018-0873-5；biorxiv:doi:https://doi.org/10.1101/236588)。为了便于区分和反映技术间的差异和改进，将上述两项研究发明的ctpcr称为ctpcr1.0(biorxiv:doi:https://doi.org/10.1101/236588)和ctpcr2.0(analbioanalchem,2018,doi:10.1007/s00216-018-0873-5)。基于crispr系统对核酸分子的序列特异性切割功能，crispr系统在核酸检测领域的应用正在逐步被开发。除了上述cas9酶之外，其他cas蛋白的应用也已经展现了在crispr系统在核酸检测领域的应用价值。例如，最近iii型crispr系统的cas13a(也称c2c2)已经应用于zika病毒的检测并且具有超高灵敏度(病毒颗粒的量低至2am)(该方法被命名为sherlock)(science.2017；356(6336):438-442.doi:10.1126/science.aam9321；science，2018，eaaq0179；doi:10.1126/science.aaq0179)。但sherlock技术由于依赖只能切割rna的cas13a酶，只能用于检测rna；若要检测dna，需要运用重组酶扩增(rpa)技术先对dna进行等温扩增，扩增期间通过引物在扩增产物末端引入t7启动子序列，再进行体外转录，产生rna，之后对rna进行cas13a特异切割，进而激活cas13a对单链rna的非特异性切割活性，达到检测dna的目的。该检测技术依赖于重组酶扩增及体外转录，虽有利于提高检测额灵敏度，但检测过程繁琐，成本高。此外，基于cas12a(也称为cpf1)特异性切割靶双链dna(dsdna)后会非特异性单链dna(ssdna)的特性，发展了用于检测靶dna分子的新技术(该方法被命名为detectr)(science，2018，doi.10.1126/science.aar6245)。detectr技术可检测amole级的分子，具有很高的灵明度，但detectr像sherlock一样，也依赖于一个核酸等温扩增过程，成本高且费时。这些研究表明，crispr系统用于开发核酸检测技术时具有很大的潜力和优势。hpv是双链dna病毒，与子宫颈癌，肛门癌和其他癌症的发病机制密切相关。大约有100种不同变异类型的hpv。根据致癌能力的不同，hpv分为高危型hpv(hrhpv)和低危型hpv(lrhpv)。世界上最常见的hrhpv是hpv16和hpv18，它们导致了大约70％的宫颈癌。其他hrhpv包括hpv31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、82等。lrhpv包括hpv6、11、40、42、43、44、61、81等。因其丰富的dna多态性，hpv是研究dna检测及分型技术良好的实验材料。因此，本发明以hpvdna为材料，进行本发明方法的论证。此外，本发明提出的ctpcr技术以及设计、筛选和开发的一套靶向高危型hpv的sgrna，已经基本上发展了一种即用型hpv临床样品检测新技术。聚合酶链反应(pcr)作为最常用的核酸检测方法之一，被几乎所有的生物学、检测和诊断相关的实验室作为基本的核酸检测工具。在传统pcr(tpcr)的基础上，衍生了定量pcr(qpcr)，并被广泛应用于dna检测和诊断。另外，最近开发出的数字pcr(dpcr)已经显示出其作为临床检测工具的巨大潜力和优势。在应用中，pcr技术面临的主要问题是特异性pcr引物的设计以及引物特异性不强产生的非特异性扩增；这些问题造成pcr检测易发生假阳性。如上所述，crispr系统，特别是cas9系统，具有靶dna序列的特异性识别并切割能力，甚至具有单碱基区分能力。因此，crispr和pcr技术的结合为开发出新的核酸检测和分型技术提供了新的机会。这些技术同时具备了crispr技术的高特异性和pcr技术的高灵敏度，在dna检测和基因分型上更有优势。技术实现要素：发明目的：针对现有技术存在的问题，同时为了便于区分现有技术中的ctpcr1.0(biorxiv:doi:https://doi.org/10.1101/236588)和ctpcr2.0(analbioanalchem,2018,doi:10.1007/s00216-018-0873-5)以及反映技术间的差异和改进。本发明提供一种基于crispr的dna检测和分型方法，即一种crispr分型pcr的新方法，该方法被命名为ctpcr3.0，即crispr分型pcr方法3.0(ctpcr3.0)，该方法为一种快速、均相(homogeneous)、低成本和灵敏的基于crispr的pcr方法，可以有效地对目标dna进行特异性检测和分型。本发明的ctpcr3.0是一种均相检测技术，即只需一个pcr扩增步骤即可完成检测，本发明利用了crispr技术对dna的特异性识别切割特性，可以简单、均相、快速、灵敏地对目标dna进行特异性检测和分型，是一种具有高特异性和灵敏度的dna检测新方法，通过运用本发明的方法成功检测临床样品中人hpvdna。本发明还提供了crispr分型pcr的方法的应用。技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种crispr分型pcr(crispr-typingpcr，ctpcr)的方法，包括如下步骤：(1)建立crispr分型pcr反应：将crispr相关核酸酶及靶向目标dna的sgrna及常规pcr反应试剂加入pcr反应体系中建立crispr分型pcr反应体系；(2)运行crispr分型pcr程序：建立crispr分型pcr反应体系后在pcr反应程序前加入一个短时间恒温孵育程序，之后启动pcr扩增程序。其中，步骤(1)所述crispr相关核酸酶包括cas9蛋白，以及与cas9类似的其他crispr相关核酸酶；本发明主要以cas9蛋白进行实例研究，cas9可以替换成与cas9类似的其他crispr相关核酸酶，如cpf1，或者其他crispr相关核酸酶。其中，步骤(1)所述靶向目标dna的sgrna为crispr相关核酸酶匹配的引导rna，靶向目标dna的sgrna既可以是一条sgrna，也可以是多条sgrna。sgrna为引导cas9蛋白靶向目标dna的sgrna，也可以替换成与其他crispr相关核酸酶匹配的引导rna，如cpf1匹配的引导rna。其中加入ctpcr反应中的sgrna的条数要保证如cas9/sgrna对靶dna的有效切割。其中，步骤(1)所述常规pcr反应试剂包括普通pcr反应试剂、荧光定量pcr反应试剂及数字pcr反应试剂。作为优选，步骤(1)所述常规pcr反应试剂为定量pcr反应试剂。使用定量pcr实现ctpcr检测时，其优点为检测过程实时、快速、廉价。更进一步地，定量pcr中可使用价格便宜的荧光染料法(如含有sybrgreen的定量pcr预混液)。本发明实施例中证明，常规普通pcr反应预混液与定量pcr预混液能够与cas9/sgrna对dna的切割反应良好兼容，即cas9/sgrna可在pcr预混液实现组装和对靶dna的切割，也就是说pcr预混液并不影响cas9/sgrna的组装和其对靶dna的切割，这是本发明的重要发现和创新点。其中，步骤(1)所述常规pcr反应试剂中的pcr引物既可以是单一序列引物，也可以是简并序列引物；crispr分型pcr的方法中使用的引物为可将含有靶dna序列的dna片段从待检测dna样品中pcr扩增出来的一对引物。其中，步骤(2)所述运行crispr分型pcr程序：包括一个在常规pcr反应程序前增加的短时间恒温孵育程序和之后的常规pcr反应程序。其中在常规pcr反应程序前增加的短时间恒温孵育程序，是指将步骤(1)组建完成的ctpcr反应体系先再某一恒定温度先保持一定时间，如在37℃下保持30分钟；也可以是其他温度和时间，某一恒定温度先保持一定时间的该程序的目的是让crispr分型pcr反应中crispr相关核酸酶与sgrna组装成复合物并切割靶dna，只要是能完成上述目的的时间和温度即可，如cas9与sgrna组装成cas9/sgrna复合物并切割靶dna。这种切割会造成pcr模板分子的减少，体现在定量pcr检测中ct值的增大。这种cas9/sgrna切割靶dna造成ctpcr检测中ct值的增大，是ctpcr检测靶dna的判定依据。本发明所述的crispr分型pcr的方法在dna检测和分型中的应用。其中，所述crispr分型pcr的方法可以在hpv双链dna生物检测和分型中的应用。本发明ctpcr方法在dna相关生物检测中的应用，如检测dna样品中某型病毒dna的存在与否、检测血液游离dna(cfdna)中某种疾病相关突变的存在与否等。本发明ctpcr方法在人乳头状瘤病毒双链dna生物检测中的应用；如人类乳头状瘤病毒(hpv)dna的检测及分型。其中，所述hpv病毒包括各种高危型hpv病毒，特别是hpv16和hpv18两种。尤其是，人类乳头状瘤病毒(hpv)的l1和e6-e7基因的各种基因型等。本发明只是用hpv作为一种实验材料来验证ctpcr3.0方法的可行性。该方法也可用于检测其他dna。本发明采用hpvdna作为ctpcr3.0检测的dna靶标。结果表明ctpcr3.0可以检测和分型hpvdna；发现ctpcr3.0可以检测宫颈癌细胞基因组dna(gdna)中的hpv16和hpv18dna；发现ctpcr3.0可以检测宫颈癌检测临床样品中的10种hpv亚型(16、18、33、35、45、51、52、56、58和59)。本发明所述的crispr分型pcr的方法在检测hpv中加入的靶向各种高危型hpvdna的sgrna，其特征在于，所述各种高危型hpvdna的sgrna的核酸序列如seqidno.1-24所示。在本发明ctpcr3.0检测hpv的应用中，针对每种hpv亚型的l1基因设计并使用两种sgrna，seqidno.1-24分别为：16l1a：ttaaggagtacctacgacat；16l1b：gtatcttctagtgtgcctcc；18l1a：tgctgcaccggctgaaaata；18l1b：gcatcatattgcccaggtac；33l1a：ctgagaggtaacaaacctat；33l1b：aaggaaaaggaagacccctt；35l1a：acacagacatatttgtacta；35l1b：tctttaggttttggtgcact；45l1a：gggtcatatgtacttggcac；45l1b：acgatatgtatccaccaaac；51l1a：atcctaccattcttgaacag；51l1b：acaggctaagccagatcctt；52l1a：ggaataccttcgtcatggcg；52l1b：cagttgttttgtcacagttg；56l1a：tattgggttatccccgccag；56l1b：catattcctccacatgtcta；58l1a：gctacgagtggtatcaacca；58l1b：aatgacatatatacatacta；59l1a：taagggtcctgtttaactgg；59l1b：ctggtaggtgtgtatacatt；16e6a：gattccataatataaggggt；16e7b：gaggaggaggatgaaataga；18e6a：gtgctgcaaccgagcacgac；18e7b：cgagcaattaagcgactcag。上述序列方向均为5′到3′。由于人类乳头状瘤病毒(hpv)的l1基因已广泛用于检测和鉴别hpv亚型。在本发明中，首先针对有10种高危型hpv，即hpv16、18、33、35、45、51、52、56、58和59，各设计了一对sgrna，用于检测10种高危型hpv的l1基因。用这些sgrna和已经报道的用于扩增hpvl1区域的通用引物seqidno.25-26，即my09(5′-cgtccmarrggawactgatc-3′)与my11(5′-gcmcagggwcataayaatgg-3′)(其中m为a或c；r为a或g；w为a或t；y为c或t)，通过基于荧光定量pcr的ctpcr3.0方法检测了10种高危型hpv的l1基因。结果表明，ctpcr3.0可以有效检测10种高危型；显示了ctpcr3.0用于dna检测和分型的可行性和应用价值。由于hpv基因在整合到宿主细胞基因组的过程中，l1dna有时会有缺失，可能导致hpv检测的遗漏。因此，hpv检测越来越重视致癌基因e6/e7的检测，因为e6-e7在hpv整合到人基因组dna中时不会缺失，而l1基因可能发生部分缺失。因此，检测e6-e7基因可防止漏测。因此，本发明中，针对两种高危型hpv，即hpv16和hpv18，还各设计并使用了一对靶向e6-e7基因的sgrna；运用这些sgrna，用本发明提出的方法检测了三种人宫颈癌细胞系hela、siha和c-33a中的hpv16和hpv18dna。结果表明，分别在hela和siha细胞中成功检测到hpv18和16；然而，在c-33a细胞中没有检测到两种hpv。这与hela是hpv18阳性细胞，siha是hpv16阳性细胞和c-33a是hpv阴性细胞的事实相符合。本发明中，检测hpv16和18的e6-e7基因时，使用了本发明设计的一对简并引物seqidno.27-28，即e67-6f(5′-aagggmgtaaccgaaawcggt-3′)与e67-7r(5′-gtacctkcwggatcagccat-3′)，其中m为a或c；w为a或t；k为g或t。由于cas9核酸内切酶具有大量的脱靶结合位点，能够在一些错配的位置进行切割。脱靶是crispr-cas9系统应用于全基因组范围内的一个瓶颈，特别是用于基因治疗和临床应用。虽然cas9在全基因组范围内有许多脱靶点，但在小dna片段上应该具有非常少或没有脱靶位点。本发明为了确保ctpcr3.0方法的特异性，针对每种hpv亚种设计和使用了一对sgrna。结果表明，发现ctpcr3.0可以检测：(1)克隆在质粒中的10种hpv亚型(16、18、33、35、45、51、52、56、58和59)的l1基因；(2)宫颈癌细胞基因组dna(gdna)中的hpv16和hpv18的l1基因及e6-e7基因；(3)宫颈癌检测临床样品中的10种hpv亚型(16、18、33、35、45、51、52、56、58和59)的l1基因。有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明开发了一种新的基于crispr的dna检测和分型方法——crispr分型pcr(crispr-typingpcr，ctpcr)，该方法被命名为ctpcr3.0，代表3.0版本的cas9/sgrna分型pcr。该方法为一种快速、均相、便宜和灵敏的基于crispr的pcr方法，可以有效地对目标dna进行特异性检测和分型。本发明通过运用ctpcr3.0的方法成功检测了hpv的基因，(1)克隆在质粒中的10种hpv亚型(16、18、33、35、45、51、52、56、58和59)的l1基因，(2)宫颈癌细胞基因组dna(gdna)中的hpv16和hpv18的l1基因及e6-e7基因，以及(3)宫颈癌检测临床样品中的10种hpv亚型(16、18、33、35、45、51、52、56、58和59)的l1基因，充分验证了该方法。总之，本发明开发了一种具有高特异性且快速、均相检测及分型dna的新方法——ctpcr3.0。在具备dna检测样品的情况下，依靠已经普及的荧光定量pcr仪，ctpcr3.0的全部检测过程可以在2小时内完成。本发明利用了crispr技术对dna的特异性识别切割特性，可以简单、快速、灵敏地对目标dna进行特异性检测和分型，成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和特异性pcr引物设计等关键瓶颈问题，ctpcr3.0最显著的优点是均相检测。附图说明图1为ctpcr3.0检测及分型dna分子的原理及流程示意图；图1中指出了ctpcr3.0用于检测hpv时，所用sgrna和pcr引物所处的位置；用荧光定量pcr实现ctpcr3.0检测时，两个程序所需要的反应时间，整个ctpcr3.0检测包括如下步骤：(1)建立ctpcr反应；(2)运行ctpcr程序；ctpcr反应包含cas9蛋白、靶向目标dna的sgrna及常规pcr反应试剂；ctpcr程序包括一个在常规pcr反应程序前增加的短时间恒温孵育程序和之后的常规pcr反应程序；图2为cas9/sgrna复合体切割10种hpv亚型hpvl1质粒dna和ctpcr3.0检测hpv16和hpv18l1质粒dna的示意图；(a)cas9/sgrna切割10种hpvl1质粒dna，针对10种亚型的hpvl1基因分别设计了10对特异的sgrna，这些sgrna分别与cas9结合后切割相对应的hpvl1质粒dna；阴性对照：(1)hpv16的sgrna与cas9复合，用于切割hpv18l1质粒dna；(2)hpv18的sgrna与cas9复合，用于切割hpv16l1质粒dna；(3)未被切割的hpv16和hpv18l1质粒dna；(b)ctpcr3.0检测hpv16质粒dna；(c)ctpcr3.0检测hpv18l1dna；图3为用ctpcr3.0检测10种hpv亚型l1质粒dna的示意图；图3中有10种亚型hpv(高危型：16、18、33、35、45、51、52、56、58和59)l1质粒dna，10种亚型hpv的sgrna与cas9复合后分别切割10种亚型的hpv质粒dna；图4为用ctpcr3.0检测细胞中hpv18和16的l1和e6-e7基因的示意图；图4中检测hela或sihagdna，并将c-33agdna用作阴性对照(a)用ctpcr3.0检测hela细胞中的hpv18l1基因；(b)用ctpcr3.0检测siha细胞中的hpv16l1基因；(c)用ctpcr3.0在hela细胞中检测hpv18e6-e7基因；(d)用ctpcr3.0在siha细胞中检测hpv16e6-e7基因的；图5为用ctpcr3.0检测八个临床样本中的hpv(第一批)的示意图；在第一批临床样品中，六种临床样品(编号：1～6)中发现了hpv，而在其他两种临床样品中未发现hpv，样品1-6分别是hpv16、16、18、33、51和59；图6为用ctpcr3.0(第二批)检测8个临床样本中的hpv的示意图；在第二批临床样本中，在6个临床样本(编号：1～6)中发现了hpv，在另外两个临床样品中未发现hpv，样品1-6分别是hpv16、16、35、52、56和58；图7为用ctpcr3.0检测10个临床样本中的hpv(第三批)的示意图；在第三批临床样品中，在8个临床样品(编号：1～8)中发现hpv，其他两个临床样品中未发现hpv，样品1-8分别是hpv16、18、18、33、45、52、56和58。具体实施方式以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例1ctpcr3.0检测及分型dna分子的原理及流程示意图如图1所示。ctpcr3.0检测dna分子的示意图(图1)。该方法通过一步均相检测目标dna：检测到的dna样品首先被一对cas9/sgrna复合物切割，然后用一对通用引物进行qpcr。所有检测组分(待检测的dna、cas9蛋白、sgrna和qpcr试剂)都在一个pcr管中预先混匀。整个检测过程是在普通pcr程序之前加入一段恒温孵育时间(37℃，30分钟)。在恒温孵育步骤中，cas9核酸酶分别与一对sgrna(sgrnaa和b)复合后同时切割dna样品。cas9/sgrna特异切割靶dna将导致qpcr扩增中的ct值增加。本发明中各实施例检测的目标dnahpv16和hpv18的l1和e6/e7基因，以及针对这些基因设计和使用的pcr引物、sgrna的位置如图1所示。该示意图有助于理解本发明实施例2～5中的实验。实施例2用cas9/sgrna切割hpv质粒并用ctpcr3.0鉴别hpv16和18实验方法：sgrna的制备：sgrna体外转录模板制备：pcr1：根据sgrna的骨架部分，首先设计一对引物(如表1所示f1和r)进行pcr。pcr反应体系(30μl)：2μlf1(表1)、2μlr(表1)、15μl2×primestar(takara)，用h2o将体积补充至30μl。pca反应程序：95℃2分钟；7个循环：95℃15秒、72℃1分钟。然后用1.5％琼脂糖凝胶100v电泳40分钟，用胶回收试剂盒(axygen)回收纯化，溶于25μl洗脱液中，并用nanodrop2000分光光度计检测其dna浓度和纯度，将该片段命名为片段1，置于-20℃保存备用。pcr2：以片段1为模板，f2和sg-r为引物进行pcr扩增。pcr反应体系(50μl)：2μl片段1、1μlf2、1μlsg-r、25μl2×primestar(takara)、20μlh2o。pca反应程序：95℃2分钟；30个循环：95℃15秒、60℃30秒、72℃1分钟；72℃2分钟。pcr结束后直接用pcrcleaning试剂盒(axygen)回收该片段，溶于25μl洗脱液中，将该片段命名为片段2，用nanodrop2000分光光度计检测其dna浓度和纯度，置于-20℃保存备用。pcr3：以片段2为模板，f3(表1)和sg-r(表1)为引物进行pcr扩增。pcr反应体系(50μl)：2μl片段2、1μlf3(表1)、1μlsg-r(表1)、25μl2×primestar(takara)、20μlh2o。pca反应程序：95℃2分钟；进入30个循环：95℃15秒、60℃30秒、72℃1分钟；72℃2分钟。pcr结束后直接用pcrcleaning试剂盒(axygen)回收该片段，溶于25μl洗脱液中，将该片段命名为t7-sgrna转录模板，用nanodrop2000分光光度计检测其dna浓度和纯度，置于-20℃保存备用。本实施例用于制备sgrna的体外转录模板的寡核苷酸序列包括f1、r、sg-r以及各f2和f3如seqidno.29-79所示。sgrna体外转录制备：根据所购买的t7rna聚合酶(t7rnapol；neb)说明书中的参考体系和用量，进行体外转录(此过程使用到的h2o、ep管、枪头等均须经过rnase处理)，相应的体系(20μl)如下表所示：0.2～1μgt7-sgrna转录模板、2μlt7rnapol、2μlt7rnapolbuffer、1μlrntp(neb)，用h2o将体积补充至20μl。将以上混合好的体系置于37℃恒温水浴锅中，过夜反应。sgrna抽提纯化：采用trizol(invitrogen公司)试剂提取rna。首先将体外转录反应过夜的体系加入1mltrizol，用枪头吹打几次。将裂解液转移至1.5ml的离心管中，室温放置5分钟。按0.2ml氯仿/mltrizol的量加入氯仿，盖好管盖，剧烈振摇15秒，室温放置5分钟，4℃，12000g离心15分钟。将上层液相转移至一干净的离心管中，加入异丙醇(0.5ml/mltrizol)，轻轻颠倒混匀数次，室温放置10分钟，4℃，12000g离心10分钟。倒掉上清，加入75％的乙醇(1ml/mltrizol)充分混匀，4℃，7500g离心5分钟。去掉上清，沉淀置室温放置5～10分钟，使其自然凉干(不要完全干燥)，加入30μl的depc水溶解rna；用紫外分光光度计测定260/280比值并测定rna浓度，并取1μg进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。实施例2制备的sgrna还用于本发明中的实施例3～5的实验。表1用于制备sgrna的体外转录模板的寡核苷酸序列(从上至下依次为seqidno29-79)10种亚型的hpv一共有10对相应的sgrnas(sgrnaa和sgrnab)(表2)。分别用每一对sgrna结合cas9后去切割10种亚型hpv(16、18、33、35、45、51、52、56、58和59)的质粒dna(200ng)。重组cas9蛋白购自newenglandbiolabs(neb)。cas9切割反应体系(30μl)：15μl2×sybrgreenmastermix(yeasen)、1μmcas9核酸酶(neb)、300nmsgrnaa(表2)和300nmsgrnab(表2)。首先将cas9反应液在25℃温育10分钟。然后向cas9反应液中加入200ng底物dna(质粒dna)，并在37℃下孵育20分钟。最后，cas9在65℃灭活10分钟。用2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。hpv质粒dna(2ng)被sgrnas/cas9核酸酶切割后，直接进入qpcr反应。ctpcr3.0反应(30μl)：15μl2×sybrgreenmastermix(yeasen)、1μmcas9核酸酶(neb)、300nmsgrnaa(表2)、300nmsgrnab(表2)、500nml1-my09(表3)、500nml1-my11(表3)和2nghpv质粒dna。运行方案：37℃30分钟，95℃10分钟，40个循环的95℃15秒，58.5℃30秒和72℃45秒。反应在实时pcr装置steponeplus(abi)上进行。实验结果：经过上述sgrna转录模板的pcr扩增和体外转录可制备出用于本发明实验的各种sgrna，这些sgrna序列以及对应的hpv亚型及基因如表2所示。这些sgrna用于本发明实验实施例2～5中的实验。注意表2中sgrna并未写成rna序列形式，而是dna序列形式，这是为了便于与dna序列比对，将表中序列中的t换为u，则成为rna序列。表2sgrna序列以及对应的hpv亚型及基因(从上至下依次为seqidno1-24)表3用于ctpcr检测hpv的pcr引物(从上至下依次为seqidno.25-28)引物名称序列(5'到3')l1-my09cgtccmarrggawactgatcl1-my11gcmcagggwcataayaatgge67-6faagggmgtaaccgaaawcggte67-7rgtacctkcwggatcagccat10种hpvl1质粒dna各有一对特异的sgrna(sgrnaa和sgrnab)(表2)，这10对sgrna与cas9结合后，分别用于切割10种hpvl1质粒dna。阴性对照：(1)hpv16的sgrna与cas9结合，用于切割hpv18l1质粒dna；(2)hpv18的sgrna与cas9结合，用于切割hpv16l1质粒dna；(3)未被切割的hpv16和hpv18l1质粒dna。切割30分钟后，原始dna在琼脂糖凝胶中完全不可见(图2a)，这表明cas9的切割效率很高并足以进行下一步实验。然后用ctpcr3.0区分hpv16和18的l1基因。用ctpcr3.0首先尝试性检测了克隆在质粒中的hpv16和18l1基因。hpv16和18l1基因作为qpcr扩增底物，如果它们被切割，qpcr的ct值就会增加。为了初步验证ctpcr3.0检测的特异性，在ctpcr3.0检测中将hpv16和18的l1基因与hpv16和18的sgrna交叉作用。结果显示用ctpcr3.0能够很好的检测两种hpv亚型的li基因，且能很好地区分hpv16和18的l1基因(图2b和2c)。实施例3用ctpcr3.0检测hpv亚型质粒中的l1基因实验方法：hpv质粒dna(2ng)被sgrnas/cas9核酸酶切割后，直接进入qpcr反应。ctpcr3.0反应(30μl)：15μl2×sybrgreenmastermix(yeasen)、1μmcas9核酸酶(neb)、300nmsgrnaa(表2)、300nmsgrnab(表2)、500nml1-my09(表3)、500nml1-my11(表3)和2nghpv质粒dna。运行方案：37℃30分钟，95℃10分钟，40个循环的95℃15秒，58.5℃30秒和72℃45秒。反应在实时pcr装置steponeplus(abi)上进行。实验结果：为了进一步验证ctpcr3.0的特异性。有10种亚型的hpv(高风险：16、18、33、35、45、51、52、56、58和59)l1质粒dna，10对sgrna分别和cas9结合后切割每一种亚型的hpv质粒dna(37℃，30分钟)。然后在95℃下失活cas9蛋白，同时打开qpcr反应。qpcr结果显示ctpcr3.0成功地将这10种hpv亚型相互区分(图3)。上述结果再次证明ctpcr3.0可用于特异性检测10种hpv亚型。ctpcr3.0也可以用来检测其他基因。实施例4用ctpcr3.0检测宫颈癌细胞中hpvl1和e6-e7基因实验方法：ctpcr3.0反应体系(30μl)由15μl2×sybrgreenmastermix(yeasen)、1μmcas9核酸酶(neb)、300nmsgrnaa(表2)、300nmsgrnab(表2)、500nml1-my09(表3)或e67-6f(表3)、500nml1-my11(表3)或e67-7r(表3)和200ng各种宫颈癌细胞的gdna组成。使用以下运行方案：37℃30分钟，95℃10分钟，35个循环的95℃15秒，58.5℃30秒和72℃45秒。反应在实时pcr装置steponeplus(abi)上进行。实验结果：通过使用ctpcr3.0检测hela细胞中的hpv18l1和e6基因以及siha细胞中的hpv16l1和e6基因。首先，检测200nghela或sihagdna，并使用c-33agdna作为阴性对照。结果显示，ctpcr3.0可以检测到hela和sihagdna中分别含有hpv18和hpv16基因。相反，在c-33agdna中未检测到hpv18和hpv16基因(图4)。结果表明，ctpcr3.0可以在hpv感染细胞中有效地检测和分型hpvdna。实施例5用ctpcr3.0检测临床样本中的hpvl1基因实验方法：sgrna的制备同实施例1。ctpcr3.0反应(30μl)：15μl2×sybrgreenmastermix(yeasen)、1μmcas9核酸酶(neb)、300nmsgrnaa(表2)、300nmsgrnab(表2)、500nml1-my09(表3)、500nml1-my11(表3)和20ngdna。dna是从三批临床样本共26名患者的宫颈粘液脱落细胞中提取的。使用以下运行方案：37℃30分钟，95℃10分钟，40个循环的95℃15秒，58.5℃30秒和72℃45秒。反应在实时pcr装置steponeplus(abi)上进行。临床样本来自南京军区南京总医院(中国南京)。dna依次用苯酚/氯仿和异丙醇萃取，并用乙醇沉淀。将纯化的dna溶解在ddh2o中并用光谱测定法定量。实验结果：最后，通过检测临床样本来验证ctpcr3.0方法的特异性。用ctpcr3.0一共检测了3批临床样本(26例宫颈粘液脱落细胞)。cas9切割后，使用通用引物l1-my09/11进行qpcr检测。在第一批的六种临床样本(编号：1～6)中发现了hpv，而在其他两种临床样本中未发现hpv(图5)。样本1～6分别是hpv16、16、18、33、51和59。在第二批的六个临床样本中发现了hpv(编号：1-6)，在其他两个临床样本中未发现hpv(图6)。样本1～6分别是hpv16、16、35、52、56和58。在第三批的八个临床样本(编号：1～8)中发现了hpv，其他两个临床样品中未发现hpv(图7)。样品1～8分别是hpv16、18、18、33、45、52、56和58。这些结果与来自南京军区南京总医院的hpv的hc2(digene)检测报告一致，表明ctpcr3.0检测的可靠性。这些数据表明可以通过ctpcr3.0方法对临床样本中的hpv进行特异性地检测。序列表<110>东南大学<120>一种crispr分型pcr的方法及其应用<160>79<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ttaaggagtacctacgacat20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtatcttctagtgtgcctcc20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tgctgcaccggctgaaaata20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcatcatattgcccaggtac20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ctgagaggtaacaaacctat20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aaggaaaaggaagacccctt20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7acacagacatatttgtacta20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tctttaggttttggtgcact20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gggtcatatgtacttggcac20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10acgatatgtatccaccaaac20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11atcctaccattcttgaacag20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12acaggctaagccagatcctt20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ggaataccttcgtcatggcg20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14cagttgttttgtcacagttg20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15tattgggttatccccgccag20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16catattcctccacatgtcta20<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gctacgagtggtatcaacca20<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18aatgacatatatacatacta20<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19taagggtcctgtttaactgg20<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20ctggtaggtgtgtatacatt20<210>21<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21gattccataatataaggggt20<210>22<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22gaggaggaggatgaaataga20<210>23<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23gtgctgcaaccgagcacgac20<210>24<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24cgagcaattaagcgactcag20<210>25<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25cgtccmarrggawactgatc20<210>26<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26gcmcagggwcataayaatgg20<210>27<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27aagggmgtaaccgaaawcggt21<210>28<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28gtacctkcwggatcagccat20<210>29<211>53<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttg53<210>30<211>52<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30aaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagcc52<210>31<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31aaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttc32<210>32<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32ttaaggagtacctacgacatgttttagagctagaaatagcaag43<210>33<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33ttctaatacgactcactatagttaaggagtacctacgacatg42<210>34<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34gtatcttctagtgtgcctccgttttagagctagaaatagcaag43<210>35<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35ttctaatacgactcactataggtatcttctagtgtgcctccg42<210>36<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36tgctgcaccggctgaaaatagttttagagctagaaatagcaag43<210>37<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37ttctaatacgactcactatagtgctgcaccggctgaaaatag42<210>38<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38gcatcatattgcccaggtacgttttagagctagaaatagcaag43<210>39<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39ttctaatacgactcactataggcatcatattgcccaggtacg42<210>40<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40ctgagaggtaacaaacctatgttttagagctagaaatagcaag43<210>41<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41ttctaatacgactcactatagctgagaggtaacaaacctatg42<210>42<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42aaggaaaaggaagaccccttgttttagagctagaaatagcaag43<210>43<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43ttctaatacgactcactatagaaggaaaaggaagaccccttg42<210>44<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44acacagacatatttgtactagttttagagctagaaatagcaag43<210>45<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>45ttctaatacgactcactatagacacagacatatttgtactag42<210>46<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>46tctttaggttttggtgcactgttttagagctagaaatagcaag43<210>47<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>47ttctaatacgactcactatagtctttaggttttggtgcactg42<210>48<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>48gggtcatatgtacttggcacgttttagagctagaaatagcaag43<210>49<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>49ttctaatacgactcactataggggtcatatgtacttggcacg42<210>50<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>50acgatatgtatccaccaaacgttttagagctagaaatagcaag43<210>51<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>51ttctaatacgactcactatagacgatatgtatccaccaaacg42<210>52<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>52atcctaccattcttgaacaggttt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