本发明涉及一种可视化检测转基因食品的方法的方法，属于食品安全领域。
背景技术：
转基因生物由于其抗除草剂、抗虫、抗病毒等的抗性和高产量、高营养成分等特性在农业领域具有一定的优势。并且全球的转基因作物种植面积从1996年的1.7万顷增加到2015年的179.7万顷。大豆作为食品和饲料的重要蛋白质来源之一。随着发展，转基因大豆作为为一种主要的转基因食品，在减轻贫困及缓解饥饿问题方面起到了至关重要的作用。同时，转基因大豆的安全性及对环境和健康的影响仍存在争议。欧盟、韩国、日本和澳大利亚等许多国家需要对大豆进行分析，以确保严格遵守的标签规定。才能将其卖给消费者，根据标签规定，食品产品中转基因成分的阈值水平为0.9％-5％。
过去20年，检测转基因食品有很多种方法。主要有两方面，一种方法是基于外源基因表达蛋白的检测，包括分子印迹，酶联免疫和试纸条法等。这些基于蛋白质检测的方法的缺点是耗时，有的需要用检测蛋白的专用仪器；并且在一些深加工食品中，一些蛋白质可能在加工制造过程中被破坏，导致检测效果差。另一种方法是基于基因的稳定性进行的基因的检测。目前常被用在检测转基因生物的基因有花椰菜花叶病毒35s启动子(camv35s)、5-烯丙基酸盐3-磷酸合成酶基因(cp4-epsps)和终止子胭脂碱合酶基因(nos)等。这些基因检测方法包括聚合酶链式反应(pcr)结合琼脂糖凝胶电泳，实时荧光pcr，表面离子共振等。然而，这些方法也有一些缺点，如耗时，仪器昂贵，操作较为复杂。因此，研究简单、快速和灵敏的检测转基因大豆分析方法十分有意义。
滚环扩增(rollingcircleamplification，rca)是近几年发展起来的一种等温条件下的dna复制技术，在恒温条件下，以短寡核苷酸链为引物，线性单链dna序列形成环状模板，使用具有链置换作用的dna聚合酶使引物扩增生成含有许多互补于环状模板的串联重复长链dna序。扩增产物主要通过凝胶电泳、荧光探针、量子点和偶联纳米粒子等方式检测。因操作简便、特异性强、扩增高效、产物稳定，该技术受到越来越多的关注，被作为高度通用的dna扩增工具，广泛地应用于核酸序列、蛋白质和小分子等超灵敏检测中。
在rca方法中，能形成环状的rca模板可以与目的基因结合，在聚合酶的反应下循环扩增，形成长链的核苷酸产物。对pcr而言，其主要局限是必须要进行热循环步骤，并且仪器费用昂贵。rca方法作为生物研究和诊断的基本方法已经成为pcr的替代方法。随着rca技术的快速发展，rca技术已不但用于扩增质粒、噬菌体dna和病毒环形核酸分子等环状核酸模板，而且也可利用随机引物和指数rca扩增原理来实现全基因组扩增。至今为止，多重替换扩增和限制性连接环化rca已被报道用于全基因组扩增。前者主要利用phi29聚合酶在恒温条件(30℃)下对少于十个的人类细胞进行精密准确的全基因组扩增，2～3h后反应达到平衡。该技术也可用于人类全血中的基因组扩增，且无需纯化dna。后者则是先通过限制性内切酶催化作用得到短链基因组dna，再进行环化和连接生成环状dna模板，引物开始触发rca反应。
目前已经有人基于rca反应来检测camv35s，比如：(1)pangs，qureshif，shanahand，etal。investigationoftheuseofrollingcircleamplificationforthedetectionofgmfood中利用rca的方法检测转基因食品，用凝胶电泳定性分析结果，存在检测的准确性不够的问题。(2)郝振明，赵鑫，吴孝槐等超分枝滚环扩增技术结合试纸法检测食品中多种转基因组分，检测限为100pg/ul，存在检测准确性不够，检测限较高的问题；(3)guvenb，boyaciih，tameru等在developmentofrollingcircleamplificationbasedsurface-enhancedramanspectroscopymethodfor35spromotergenedetection，报道了采用修饰金纳米棒结合rca反应通过表面增强拉曼光谱的方案检测35sdna的方法，检测范围1.0×10-13-1.0×10-7mol/l，检测限为6.3×10-15mol/l，检测过程中需要合成及修饰金纳米粒子及金纳米棒，实验方法比较繁琐，并且检测需要使用表面增强拉曼仪器，检测方法成本较高等问题；(4)wangx,dat,guanq等在detectionofgeneticallymodifiedcropsusingmultiplexasymmetricpolymerasechainreactionandasymmetrichyperbranchedrollingcircleamplificationcoupledwithreversedotblot中报道了多重pcr结合多分支rca利用点杂交显示的方法检测转基因作物，检测限为0.1ug/l的2％rrs和0.5ng/l的转基因大豆dna，但需要与多重pcr仪器连用，增加了检测方法的复杂成度，存在实验用时较长，利用点杂交显示法存在实验结果灵敏度不高等问题。
也有基于dna酶可视化检测camv35s的报道，比如：(1)wangc，nanc，zhul，etal。colorimetricbiosensorbasedonadnazymeprimeranditsapplicationinlogicgateoperationsfordnascreening报道利用基因特异性结合生成dna酶显色检测camv35s等转基因片段，该方案只能作为定性检测方法，不能定量检测，存在检测准确性不够的问题。(2)jiangx，zhangh，wuj，etal。g-quadruplexdnabiosensorforsensitivevisibledetectionofgeneticallymodifiedfood.利用g-四链体形成dna酶显示反应检测转基因食品，检测范围5.0×10-8-5.0×10-7mol/l，检测限3.0×10-9mol/l，存在检测范围小检测限较高的问题。
因此，有必要提供一种能够解决上述问题的高效检测方法。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明建立了一种检测含camv35s的转基因食品的方法。本发明方法通过目的物(camv35s基因)引发的滚环扩增结合dna酶，不仅实现了可视化检测，而且方法简便、检测限低。
本发明的第一个目的是提供一种检测大豆样品的方法，通过检测其基因组中camv35s的存在情况确定大豆样品中是否存在转基因大豆；所述方法，包括利用具有特异性识别功能的camv35s特定核酸探针和相应的模板序列；当特异性camv35s特定核酸探针存在时，与相应模板序列结合形成环状，经过t4-dna连接酶的连接成环，在phi29聚合酶的作用下，能够有效引发滚环扩增，扩增产物结合氧化血红素形成dna酶催化显色反应；通过显色分析检测结果，判断大豆样品的基因组中camv35s的含量；其中，所述模板序列，其两端碱基序列与camv35s特定核酸探针互补配对，中间段包含有一段与g-四链体核苷酸序列互补的碱基序列。
在一种实施方式中，所述方法，还包括提取不同比例转基因大豆的混合大豆样品的基因组，利用模板序列引发滚环扩增并将扩增产物形成dna酶催显色反应，建立紫外吸收强度与混合大豆样品中转基因大豆比例的回归曲线方程；当需要检测未知大豆样品时，提取未知大豆样品基因组并在相同的条件下进行反应获取紫外吸收强度，并将结果代入回归曲线方程，即获得未知样品中转基因大豆的比例。
在一种实施方式中，所述模板序列，两端碱基序列与目的基因完全互补配对。
在一种实施方式中，所述模板序列，5'-p-tcaacgatggcccccaacccgccctacccagcagaggcatct-3'(5'-phosphate)，如seqidno:1所示。其两端可以与camv35s特定核酸探针互补配对。
在一种实施方式中，所述的camv35s特定核酸探针的序列为：
cgccatcgttgaagatgcctctgc，如seqidno:2所示。即camv35s启动子中的部分序列，在实验中起到与模板结合成环的作用，只有这个核酸探针存在才能与模板结合成环从而引发滚环扩增。
在一种实施方式中，所述显色反应的试剂是abts。
在一种实施方式中，提取dna的方法为sds法。
本发明中，dna酶，即氯化血红素/g-四链体dna酶(g-quadruplexes-hemindnazyme)，是一段含有丰富鸟嘌呤g的dna序列在金属离子(k+、na+等)存在下生成稳定的g-四链体，并结合氯化血红素(hemin)后模拟辣根过氧化物酶功能的复合物。dna酶作为一种类似过氧化物酶的催化剂，可催化h2o2氧化无色的2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(abts)生成绿色产物abts·+。
在一种实施方式中，所述方法具体是，模板序列在含有t4-dna连接酶的连接反应体系中反应，然后再与聚合酶在rca反应体系中反应得到扩增产物，再使滚环扩增产物与氧化血红素结合生成dna酶，催化abts显色，根据显色强度与反应模板浓度建立的紫外吸收强度与camv35s含量浓度的回归曲线关系，计算得到camv35s含量。
在一种实施方式中，所述紫外吸收强度是在420nm处下测定比色信号。
在一种实施方式中，所述连接反应体系中t4-dna连接酶的浓度为50-300units/25μl，可选地为250units/25μl。
在一种实施方式中，所述连接反应的时间为40-70min，可选地为50min。
在一种实施方式中，所述rca反应体系中聚合酶的浓度为5-25units/25μl，可选择为20units/25μl。
在一种实施方式中，所述rca反应的时间为40-60min，可选择为40min。
本发明的第二个目的是提供一种检测待测核酸片段中camv35s的方法，设计具有特异性识别功能的camv35s特定核酸探针和相应的模板序列；当有特异性camv35s启动子模板时，camv35s特定核酸探针能够有效引发滚环扩增，扩增产物形成dna酶催化显色反应；通过显色分析检测结果，判断待测核酸片段中是否含有camv35s或者camv35s的含量；其中，所述模板序列，与camv35s特定核酸探针两端碱基序列互补配对，中间段包含有一段与g-四链体核苷酸序列互补的碱基序列。
在一种实施方式中，所述模板序列，两端碱基序列与camv35s特定核酸探针完全互补配对。
在一种实施方式中，所述模板序列，5'-p-tcaacgatggcccccaacccgccctacccagcagaggcatct-3'(5'-phosphate)。
在一种实施方式中，所述方法具体是，模板序列在含有t4dna连接酶的连接反应体系中反应，然后再与聚合酶在rca反应体系中反应得到扩增产物，再使滚环扩增产物与氧化血红素结合生成dna酶，催化显色反应，根据显色强度与反应模板浓度建立的紫外吸收强度与camv35s含量浓度的回归曲线关系，计算得到camv35s含量。
在一种实施方式中，所述紫外吸收强度是在420nm处下测定比色信号。
在一种实施方式中，所述连接反应体系中t4-dna连接酶的浓度为50-300units/25μl，可选地为250units/25μl。所述连接反应的时间为40-70min，可选地为50min。
在一种实施方式中，所述rca反应体系中聚合酶的浓度为5-25units/25μl，可选地为20units/25μl。所述rca反应的时间为40-60min，可选地为40min。
在一种实施方式中，反应的条件：模板为10nmol/l，camv35s启动子特定核酸探针为10nmol/l，t4-dna连接酶浓度为250u，反应时间为50min，phi29聚合酶浓度为20u，聚合时间为40min。
本发明的第三个目的是提供一种可以通过滚环扩增可视化检测转基因食品、混合样品中转基因的比例、待测核酸片段中camv35s的含量或比例的模板序列，如seqidno:1所示。
在一种实施方式中，所述转基因食品可以是以下多种转基因作物，如大米、玉米、大豆、番茄等。
本发明方法中，只有在目的基因存在下，线性模板才能经t4-dna连接酶催化作用使两端连接形成环状模板，随后聚合酶催化作用下进行rca反应，生成一系列与环状模板互补的长单链扩增产物。扩增产物结合金属离子和氧化血红素可形成dna酶，来催化无色h2o2-abts反应系统产生大量蓝绿色产物abts·+，在紫外420nm处有特异性吸收峰。
本发明方法，可以用于检测转基因产品、混合样品中转基因的比例、待测核酸片段中camv35s的含量或比例，与现有的转基因产品检测技术相比，还具有如下优点：
1)rca反应过程简单，只需要一个恒温的环境，对反应条件的要求不高。
2)目的基因与模板的特异性结合提升了反应方法对目标物的特异识别能力。
3)结合dna酶催化abts显色技术，可以对目标物进行可视化检测。
附图说明
图1为：一种rca方法原理图。
图2为：t4-dna连接酶的浓度对实验的影响图。
图3为：phi29聚合酶的浓度对实验的影响图。
图4为：t4-dna连接酶反应时间优化图；rca反应时间优化图。
图5为：特异性实验结果图。
图6为：对不同浓度目的基因(0.1pm，1pm，10pm，100pm，1000pm)的反应线性相关曲线及反应实物图。
图7为：不同含量转基因大豆基因组dna检测反应结果及线性相关曲线。
具体实施方案
结合实例对本发明作进一步的描述：
实施例1
利用目的物引发的rca合成dna酶可视化检测转基因大豆特异性序列的原理如图1所示。首先，利用sds提取转基因大豆中的基因组dna。设计42个碱基组成、5'端磷酸化的线性dna模板，其两端碱基序列与目的基因完全互补配对，中间段包含有一段与g-四链体核苷酸序列互补的碱基序列。只有在camv35s启动子核酸探针存在下，线性模板才能经t4-dna连接酶催化作用使两端连接形成环状模板，随后phi29聚合酶催化作用下进行rca反应，生成一系列与环状模板互补的长单链扩增产物。扩增产物结合金属离子和氧化血红素可形成dna酶，来催化无色h2o2-abts反应系统产生大量蓝绿色产物abts·+，在紫外420nm处有特异性吸收峰。
具体步骤包括：
(1)连接反应
将1.0μl10nmol/l模板序列、1.0μl10nmol/l的camv35s特定核酸探针、20.5μl超纯水混合均匀，于95℃下加热变性3min，缓慢冷却。然后在37℃条件下孵育30min，使模板和引物互补配对。再加入2.5μl10×t4-dna连接酶缓冲液(含500mmol/ltris-hcl，ph7.5，200mmol/lmgcl2，100mmol/ldtt，10mmol/latp)，250unitst4-dna连接酶，振荡完全，37℃条件下反应50min后，再于65℃条件下孵育10min使连接酶失活来终止连接反应。
最佳t4-dna连接酶的浓度实验结果如图2显示，使用不同浓度的t4-dna连接酶，吸光值随着酶浓度的增加而增加，在250units后达到最高。这可能是因为反应体系中的模板随着连接酶浓度的增加而越来越多地被连接成环；而当连接酶浓度到达250units后，可能是反应体系中的模板被完全环化，或是体系中atp基质的耗尽而引起反应达到平稳。因此，实验中最终确定的t4-dna连接酶浓度为250units。
为了节省反应时间，本实验对连接反应时间及rca反应时间也进行了优化。如图4所示，对t4-dna连接酶随着反应时间的延长，吸光值也随之增加。这是因为随着连接反应进行，使模板与特定核酸探针有效结合，形成的环状基因增加，进而扩增产物dna酶序列增多，催化h2o2-abts反应系统增强；因此，实验最终确定的连接反应时间为50min。
(2)rca反应
在上述连接反应的混合液中，加入5.0μl10×phi29dna聚合酶缓冲液(含500mmol/ltris-hcl，ph7.5，100mmol/lmgcl2，100mmol/l(nh4)2so4，40mmol/ldtt)、2.0μl400μl/ml牛血清白蛋白、2.0μl500μmol/ldntps、20unitsphi29dna聚合酶和15.5μl超纯水混合均匀后，30℃条件下进行rca反应40min，于65℃条件下孵育10min使聚合酶失活。取9.0μl扩增产物和1.0μl10nmol/l模板混合均匀，于2.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，sybrgreeni染色，紫外凝胶成像系统照相分析。
最佳phi29聚合酶的浓度实验结果如图3显示，使用不同浓度的phi29聚合酶，吸光值随着酶浓度的增加而增加，在20units后达到最高。这可能是因为反应体系中的产物随着聚合酶浓度的增加而聚合成线性长链；而当聚合酶浓度到达20units后，可能是反应体系中的产物浓度太高，影响聚合酶反应结果有所下降。因此，实验中最终确定的phi29聚合酶浓度为20units。
对rca反应时间进行优化如图4，紫外吸光值随扩增时间增加而逐渐增大，当扩增时间为40min时吸光值达到最大，因此，实验最终确定的rca反应时间为40min。
(3)显色反应
在模板为10nmol/l，camv35s启动子特定核酸探针为10nmol/l，t4-dna连接酶浓度为250u，反应时间为50min，phi29聚合酶浓度为20u，聚合时间为40min的最优条件下，通过目的基(即camv35s启动子特定核酸探针)引发的滚环扩增合成dna酶测定camv35s浓度与颜色变化之间的关系，结果如图6所示，随着目的基因浓度的增加，催化反应生成的绿色产物abts·+越来越多，颜色也越来越深。将催化产物于紫外420nm处下测定比色信号，从图6中可以看出，本方法在0.1pm-1000pm范围内目的基因浓度与吸光值呈现良好线性关系，回归方程为y＝0.373x+0.026，相关系数r2＝0.993，理论检测限为0.03pm。
实施例2：可视化检测camv35s方法在检测转基因大豆含量的应用
提取dna
取0.1克实际样品于5.0ml离心管中，加入提取/裂解缓冲液1.0ml，混匀后12000rpm离心15min，吸取上清液至新的离心管中。加入1倍体积tris饱和的平衡酚，轻摇混匀后12000rpm离心10min，取上层水相至新的离心管。往其中添加1倍量的平衡酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，轻摇混合后12000rpm离心10min，吸取上层水相至新的离心管中。重复此步骤，直至相间界面清洁。然后加入1倍体积氯仿-异戊醇溶液，轻摇混合后12000rpm离心10min，再次吸取上层水相至新的离心管。重复此步骤，直到相间界面清洁。在水相中添加0.1倍量的醋酸钾溶液和2倍量的95％酒精，完全混匀。于-20℃静置1h后取出，12000rpm离心10min后倒去上清。用500μl70％乙醇溶液洗涤离心管中的dna沉淀，混合后12000rpm离心10min后弃去上清，干燥dna沉淀。用100.0μlte缓冲液溶解dna放入冰箱待后续检测使用。后续方法如实例一所示。
不同含量的转基因大豆是将转基因大豆标准品与非转基因大豆阴性对照按比例混合配成0，0.1％，0.3％，0.5％，0.7％，0.9％，1.1％，1.3％，1.5％，2％，5％，10％，50％，100％标准含量的转基因大豆进行检测，测定结果如图7所示，回归方程为y＝0.123x+0.505，相关系数r2＝0.980，检测限为0.5％。
用本方法对市售的豆腐样品进行测定，测定结果与荧光定量pcr方法做对照，实验方法如实例一，结果显示，转基因含量为0.74％，rsd为4.75％，结果可靠，与对照方法结果相符，表明本发明构建的方法可以应用于实际样品中转基因camv35s含量的测定。
序列表
<110>江南大学
<120>一种可视化检测转基因食品的方法
<160>2
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>42
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>1
tcaacgatggcccccaacccgccctacccagcagaggcatct42
<210>2
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>2
cgccatcgttgaagatgcctctgc24