本发明涉及时间分辨荧光分析领域，具体涉及一种应用于时间分辨荧光分析中的桥接蛋白及其复合物的制备和应用。
背景技术：
时间分辨荧光分析法(time-resolvedfluoroimmunoassy，trfia)是利用镧系元素螯合物标记抗原、抗体、多肽、激素等，发生如抗原/抗体免疫反应、生物素/亲和素反应等反应后，加入增强液解离镧系元素，使其荧光信号得到加强，再经外源性脉冲光激发，并采用延时读取等光电技术检测镧系元素的特异荧光，从而达到对样品分析检测的目的。由于发光物质铕离子和螯合剂结合后与包被的抗原或抗体进行免疫反应，形成的抗原-抗体-铕标记物复合物在弱碱性缓冲液中经激发光激发所发生的荧光信号甚弱，须加入增强液(β-酮体、topo、tritonx-100、ph2-3的醋酸和邻苯酸氢钾的酸性溶液)，使稀土离子从络合物上离下来，与新的络合物结合形成大分子的微囊，这种微囊将能量传递给eu3+，阻断水所产生的淬灭效应，使原来的荧光信号增强近100万倍，利于荧光测量。
在传统的时间分辨荧光分析法中，需要解离和增强，增强液是不可或缺的，且对增强液纯度要求很高。增强液的纯度影响增强液的荧光本底，从而影响检测灵敏度。
目前，在时间分辨荧光分析法中研究较多的如申请公布号为cn104634961a的中国发明专利，其利用聚苯乙烯将磺酰氯螯合剂(bhhct)与稀土元素复合形成荧光复合微球。该络合剂一端与稀土元素连接，一端与生物大分子(例如：抗原或抗体)连接，避免了蛋白质分子之间的交联反应，且由于稀土元素没有和生物大分子直接接触，其不会影响生物大分子的生物活性，也不需要进行解离和增强。但是该方法存在以下缺陷：①由于微球直径较大，常见的在100nm以上，而抗体分子小于10nm，在生物液相反应中限制其相互作用的速度和范围，在快速定量检测中无法进一步提供反应速度；②微球易聚集、沉淀，导致抗体失去活性；③微球与生物大分子链接中采用化学处理，容易使生物大分子失活；④微球制备过程复杂，批次间均一性差，成本高，在微量检测中造成批次间差异大。
技术实现要素：
基于此，本发明利用基因工程方法提供一种桥接蛋白，该分子能够将示踪剂直接与生物大分子连接在一起，即无需使用增强液，或制备微球。
本发明第一方面提供一种桥接蛋白，其用于示踪剂和生物大分子之间的连接。其中生物大分子为能够应用于时间分辨荧光分析法检测的大分子，例如：抗原、抗体、多肽、激素等。
示例性地，所述桥接蛋白包括前导序列a和结合蛋白b，所述前导序列a与结合蛋白b之间直接连接或间接连接。例如，前导序列a与结合蛋白b通过连接肽连接。所述前导序列a与示踪剂偶联连接，所述结合蛋白b与生物大分子连接；
在本发明的一个具体实施方式中，所述桥接蛋白还包括荧光蛋白c，所述荧光蛋白c用于实时监测桥接蛋白的活性。
在本发明提供的一个具体实施方式中，所述前导序列a含有-nh和/或-nh2。
示例性地，所述前导序列a包括1个或多个赖氨酸，和/或1个或多个精氨酸，和/或1个或多个组氨酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述前导序列a包括赖氨酸，由赖氨酸提供-nh2或-nh基团。优选地，所述前导序列a包括6个串联的赖氨酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述前导序列a由6个串联的赖氨酸组成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述荧光蛋白c包括gfp，yfp，rfp；优选地，所述荧光蛋白c包括gfp。
在本发明的一个具体实施方式中，所述结合蛋白b是能与生物大分子特异性结合的结合蛋白。
示例性地，所述结合蛋白b与生物大分子通过抗原-抗体，proteina/g，或生物素-亲和素等相结合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述结合蛋白b包括亲和素，proteina，proteing，抗体分子或抗体分子片段，抗原分子或抗原分子片段；优选地，所述结合蛋白b包括链霉亲和素。
在本发明的一个具体实施方式中，所述桥接蛋白的核苷酸序列如seqidno：1所示的序列或其简并序列。
本发明第二方面提供上述桥接蛋白的制备方法，其包括：通过全基因合成其基因序列，并将其导入到表达载体上；以及任选地，将表达载体转入宿主细胞中表达。
示例性地，所述表达载体选自质粒、细菌和病毒中的一种或多种；优选地，所述表达载体为pet28a载体；所述宿主细胞为de3。
在本发明的一个具体实施方式中，上述桥接蛋白的制备方法具体包括：
1.通过全基因合成桥接蛋白的基因并扩增，将扩增产物导入到表达质粒pet28a中。
2.采用试剂盒提取上述表达质粒pet28a，并将其转入到de3中。
3.向步骤2)中加入iptg诱导蛋白的表达后，离心，收集沉淀。
4.加入裂解液进行纯化即得桥接蛋白。
本发明第三方面提供一种复合物，其包括上述所述的桥接蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中国，所述复合物还包括示踪剂，所述示踪剂与前导序列a连接。
示例性地，所述示踪剂与前导序列a通过-n-或-nh-连接。优选地，所述示踪剂与前导序列a通过1个或多个赖氨酸，和/或1个或多个精氨酸，和/或1个或多个组氨酸提供的-n-或-nh-连接。
在本发明的一个具体实施方式中，所述示踪剂与前导序列a通过6个串联的赖氨酸连接。
在本发明的一个具体实施方式中，所述示踪剂为磺酰氯螯合剂(bhhct)与镧系元素形成的复合体，所述bhhct与前导序列a连接。
在本发明一个具体实施方式中，所述镧系元素为铕。
在本发明一个具体实施方式中，所述复合物还包括功能性生物大分子，所述功能性生物大分子与桥接蛋白的结合蛋白b连接。其中所述功能性生物大分子为能够应用于时间分辨荧光分析法检测的大分子，例如：抗原、抗体、多肽、激素等。
本发明第四方面提供上述复合物的制备方法，其包括：按照桥接蛋白：bhhct为1:1-10的质量比例将桥接蛋白与磺酰氯螯合剂bhhct相混合，室温反应后，加入镧系元素，以及生物大分子进行反应，反应后纯化即得复合物。
在本发明的一个具体实施方式中，上述复合物的制备方法具体包括：
1)按照桥接蛋白：bhhct为1:6的质量比例将桥接蛋白与bhhct相混合；
2)室温反应90min后加入与bhhct摩尔数相同的镧系元素；加入生物大分子，生物大分子的加入量为桥接蛋白的1/3，充分反应即得复合物；
3)通过凝胶过滤色谱，纯化步骤2)中的复合物。
本发明第五方面体用上述桥接蛋白或上述复合物在时间分辨荧光分析法中的应用。
本发明至少具有以下优势之一：
本发明提供一种桥接蛋白，该桥接蛋白能够偶联示踪剂和生物大分子，以避免示踪剂与生物大分子直接连接时破坏生物大分子的活性；而且示踪剂无需连接在微球上，可避免微球在液相反应中聚集沉淀所导致的的结合效率低，检测能力受限的缺陷。
附图说明
图1所示为本发明实施例提供的桥接蛋白结构示意图。
图2所示为本发明实施例提供的复合物连接示意图。
图3所示为本发明实施例提供的检测复合物的灵敏度的实验结果图。
图4所示为本发明实施例提供的复合物与荧光微球相比较的实验结果图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明中，术语“抗体”指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、fv、fab和f(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体等(harlow等，1999,in:usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,ny；harlow等，1989,in:antibodies:alaboratorymanual,coldspringharbor,newyork；houston等，1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；bird等，1988,science242:423-426)。
术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、scfv抗体和多特异性抗体。
除非另有规定，核苷酸序列包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和rna的核苷酸序列可包括内含子。
术语“特异性结合”指识别特异性结合物质，但基本上不识别或结合样本中的其他分子。
示踪剂包括但不限于同位素示踪剂、酶标示踪剂、荧光标记示踪剂、自旋标记示踪剂等。
术语“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例以赖氨酸、绿色荧光蛋白和链霉亲和素组成的桥接蛋白为例进行说明。
实施例1桥接蛋白的制备
1)如图1所示，通过全基因合成赖氨酸-绿色荧光蛋白-链霉亲和素融合蛋白的基因序列，其具体序列如seq.idno.1所示。以seqidno：1所示的基因序列为模板，通过pcr扩增得到pcr产物。具体反应体系及扩增体系见表1所示。
表1反应体系以及扩增程序
2)通过基因工程手段，将扩增产物导入pet-28a表达载体后，转入de3菌株，利用iptg诱导表达融合蛋白，具体步骤如下：
插入pgem-teasy载体，连接体系：pcr产物与pgem-teasy连接：pcr产物15μl，pgem-teasy0.5μl，t4连接酶2μl，连接缓冲液2μl，4℃连接24-48小时。
连接产物取出10μl，加入100μl感受态细胞，静置30-60分钟，放入42℃水浴中45-90秒后立刻置冰上2分钟，然后加入800μllb培养基，37℃摇动1-2小时。取出100μl涂于含有80μg/mlx-gal和100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂糖培养平板。
挑取白斑后在1ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中37℃摇动4-12小时，通过测序验证插入片段序列。选取完全一致序列的克隆，然后在5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中37℃摇动24小时。
通过康为抽提质粒试剂盒抽提质粒，获得5μg质粒后进行酶切。用内切酶bamhi2μl、xhoi2μl、smartcutbuffer5μl、质粒和水40μl、37℃水浴4-12小时。通过琼脂糖电泳后切取目的条带，通过胶回收试剂盒提取目的dna片段。
连接pet28a质粒：预切pet28a质粒1μl，融合蛋白dna15μl，t4连接酶2μl连接缓冲液2μl，4℃连接24-48小时。
连接产物取出10μl，加入100μl感受态细胞，静置30-60分钟，放入42℃水浴中45-90秒后立刻置冰上2分钟，然后加入800μllb培养基，37℃摇动1-4小时。取出100μl涂于含有卡那霉素的lb琼脂糖培养平板。
挑取白斑后在1ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中37℃摇动4-12小时，通过测序验证插入片段序列。选取完全一致序列的克隆，然后在5ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中37℃摇动24-48小时。
通过康为抽提质粒试剂盒抽提质粒，获得5ng-1μg质粒后加入100μlde3感受态细胞，静置30分钟，放入42℃水浴中45-90秒后立刻置冰上2分钟，然后加入800μllb培养基，37℃摇动1-4小时。取出100μl涂于含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂糖培养平板。
挑取白斑后在1ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中37℃摇动4-12小时。然后加入500ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基，待菌液浓度达到od600＝0.8时，加入iptg试剂诱导。37℃摇动8-12小时。离心收获菌体。
3)用gehealthcareni2+sepharose4b纯化，随后用sephacryls-200纯化43kd融合蛋白，蛋白为深红色，其纯度可达95％以上。涉及的裂解缓冲液、清洗液、洗脱液见表2所示。
表2裂解缓冲液、清洗液、洗脱液
具体步骤如下：
5g湿菌体中加入50ml的裂解缓冲液，冰浴并用超声破碎，4℃12,000g离心30分钟，收集上清，然后使用gehealthcare的蛋白纯化填料ni-sepharose琼脂纯化融合蛋白，4℃过柱平衡过夜，用清洗液洗ni-sepharose琼脂，清洗20ml后加入洗脱液洗脱蛋白，即得桥接蛋白：赖氨酸-绿色荧光蛋白-链霉亲和素融合蛋白。
实施例2复合物的制备
复合物以bhhct和eu3+组成的复合体作为示踪剂为例进行说明。
如图2所示，将实施例1中纯化后的赖氨酸-绿色荧光蛋白-链霉亲和素融合蛋白进行标记：
1)按照：赖氨酸-绿色荧光蛋白-链霉亲和素融合蛋白：bhhct为1:6的质量比例将赖氨酸-绿色荧光蛋白-链霉亲和素融合蛋白与bhhct相混合，室温下进行反应；
2)桥接蛋白室温反应30min后加入与bhhct摩尔数相同的eu3+；加入鼠抗1(ckmb-04，购于菲鹏生物股份有限公司鼠抗1预先用试剂盒(aat-5521，aatbioquest，艾美捷科技有限公司)进行生物素化)，鼠单抗1与桥接蛋白的比例为1：3，充分反应后即得复合物；
3)通过凝胶过滤色谱，纯化步骤2)中的复合物。
实施例3复合物在时间分辨荧光分析法中的应用
1)利用双抗夹心法检测实施例2所制备的复合物的灵敏度。
将鼠抗2(ckmb-03，菲鹏生物股份有限公司)喷涂于硝酸纤维膜，0.5mg/ml点膜；将鼠抗1标记的复合物以0.5mg/ml喷点于玻璃纤维膜上。检测10ul不同浓度0.0ng/ml，1.0ng/ml，5.0ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml的ckmb蛋白。检测结果如图3所示。从图3中可以看出利用实施例2所制备的复合物进行时间分辨荧光分析法时，其检测浓度最低可达1ng/ml。
2)实施例2所制备的复合物与荧光微球的比较
将鼠抗1喷涂于硝酸纤维膜，0.5mg/ml点膜，鼠抗2标记的荧光微球(nb0214-30，广东墨赛生物科技有限公司)以0.5mg/ml喷点于玻璃纤维膜上，在与1)相同的条件下检测相同的样品。将其所得到的实验结果与1)中的实验结果进行对比分析，对比结果如图4所示。从图4中可以看出，利用时间分辨荧光分析样品，利用实施例2中所制备的复合物进行检测分析时，在检测同样浓度的ckmb时，桥接蛋白的荧光值明显高于荧光微球，其灵敏度明显优于利用荧光微球的检测。
本申请实施例中提供的桥接蛋白中的前导序列a(例如赖氨酸)为磺酰氯螯合剂提供了充足的特异的结合位点，进而加快了螯合剂的结合，并提高了螯合剂的结合力；桥接蛋白中的结合蛋白b(例如链霉亲和素)与生物大分子特异性结合，无需化学处理，以便更好地保持生物大分子的活性；而荧光蛋白c(例如绿色荧光蛋白)能够实时显示示踪剂偶联过程中桥接蛋白的变性状态，是否影响桥接蛋白的活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>程秋萍
王云志
<120>桥接蛋白及其复合物的制备和应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1233
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>桥接分子
<400>1
atgaagggcggtaaaggaaagggtggcaaaggaaagggcaaaggaggtggcaaaggagaa60
gaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcac120
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