本发明属于柞蚕丝深加工领域，尤其涉及一种阶梯控温水解制备柞蚕丝素肽的方法。
背景技术：
丝素肽是将蚕丝脱胶后进行处理的副产品，具有皮肤保湿、降血压、解酒保肝、抗疲劳及提高免疫力等功能。柞蚕（antheraepernyi）丝素蛋白属于天然的昆虫大分子蛋白，其氨基酸中丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和酪氨酸含量占90%左右，精氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸还可以形成独特的功能性rgd(arg-gly-asp)三肽序列氨基酸，组成与人体相近，易被吸收利用。但是，柞蚕丝素蛋白主要由疏水性氨基酸组成，丝素分子中含有-nh,-oh,-cooh等官能团，能与其它官能团形成氢键，丝素分子内和分子间通过氢键能形成很强的作用力，并且丝素纤维大分子链间含有二硫键，比桑蚕丝素更难溶解，故现有制备丝素肽大多以桑蚕丝为原料。
目前，已有多种生产丝素肽的方法，但是均存在着不同程度的问题。如中国专利公开号为cn102206695a的发明专利申请，公开了“一种用废蚕丝制备丝短肽及丝氨基酸的方法”，是以废蚕丝为原料，采用蒸汽爆破法进行预处理，再在一定压力下用稀硫酸水解，进行适当脱酸处理后，接着加入酸性蛋白酶水解，然后进行脱色、中和、精制，最后进行真空浓缩及调配得到丝短肽及丝氨基酸，不仅工艺复杂，而且所得到的丝短肽是分子量500~1000da的纳滤截留液，即分子量大于500~1000da，分布广不集中，产品功能广泛但针对性差。中国专利公开号为cn105385728a的发明专利申请，公开了“一种联产分子量分布均匀丝素多肽和丝胶多肽及其制备方法”，该方法由清洗、蒸汽膨润、高压脱胶、二次酶解、超滤、膜分离浓缩、干燥等工序组成，工艺复杂且只能得到占比达到80%以上分子量在500~5000da的丝素多肽或丝胶多肽，产品针对性强，但功能单一。
技术实现要素：
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种阶梯控温水解制备柞蚕丝素肽的方法。
本发明的技术解决方案是：一种阶梯控温水解制备柞蚕丝素肽的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a.取脱胶后的柞蚕丝与质量浓度85%的磷酸按质量比为1：9~10混合，在10℃~25℃条件下反应3~5天，得溶丝液；
b.将溶丝液在40℃~100℃内的至少三个温度点进行水解反应，三个温度点由低至高且梯度为20~30℃，每个温度点水解反应1~6小时；
c.停止加热，调节酸度为50%后自然降温；
d.脱盐、浓缩及干燥后得柞蚕丝素肽。
所述b步骤为三个温度点，分别为40℃、60℃、90℃，每个温度点对应水解反应时间分别为4小时、4小时、6小时。
所述b步骤为四个温度点，分别为40℃、60℃、90℃、100℃，每个温度点对应水解反应时间分别为4小时、4小时、3小时、2小时，90℃水解反应后将酸度调至80%。
所述b步骤为三个温度点，分别为40℃、60℃、90℃，每个温度点对应水解反应时间分别为4小时、4小时、3小时，b步骤后加温加压至116℃~124℃、0.08mpa~0.14mpa，水解反应2小时，再进行c步骤。
本发明选择了溶丝的温度及时间，无论长短柞蚕丝都可以一次性加入实现低温均匀溶丝，降低了溶丝成本且可保证后续水解的均一性；生产工艺简单，可操作性强，无需超滤等辅助操作，即可以生产多种分子量分布集中且功能性强的丝素肽产品（保湿、降血糖及降血脂）；通过调节酸度、自然降温控制反应温和进行，避免过反应产生氨基酸现象，使目标产品得率达到75%以上。
附图说明
图1是本发明实施例1柞蚕丝素肽1号产品的gpc凝胶色谱分析示意图。
图2是本发明实施例1柞蚕丝素肽1号产品和对照品的保湿性能实验效果图。
图3是本发明实施例2柞蚕丝素肽2号产品的gpc凝胶色谱分析示意图。
图4是本发明实施例2柞蚕丝素肽2号产品产品和对照组的降血糖性能实验效果图。
图5是本发明实施例3柞蚕丝素肽3号产品的gpc凝胶色谱分析示意图。
图6是本发明实施例3柞蚕丝素肽3号产品和对照组的降血脂性能实验效果图。
具体实施方式
实施例1：
a.取300g脱胶后的柞蚕丝（长丝和3~5cm短丝）与质量浓度85%的磷酸按质量比为1：9混合，在室温（10℃~25℃）条件下反应3天达到透明，即得到溶丝液。
脱胶可以按照现有技术，亦可以采用如下方法：将柞蚕废茧壳用清水清洗过后，在1%碳酸钠溶液中煮沸1h，脱去丝胶，然后用双氧水60℃漂煮1h，水洗去蚕丝上附着的碱液和漂洗液，在50℃条件下烘干即可。
不同时间及配比的柞蚕丝酸溶反应状态见表1及表2。
表1：长短柞蚕丝的酸溶状况
表2：不同料液比柞蚕丝在室温下的酸溶状况
b.将溶丝液在40℃、60℃、90℃三个温度点进行水解反应，40℃水解4小时、60℃水解4小时、90℃水解6小时；
c.停止加热，加水调节酸度为50%，自然降温至室温，在降温过程中反应结束，避免出现氨基酸等过反应产品；
d.可按照现在技术，采用氧化钙进行脱盐，利用旋转蒸发仪进行浓缩，之后通过小型喷雾干燥机得到柞蚕丝素肽1号产品。
对比例：
取300g脱胶处理好的柞蚕丝剪成3~5cm，使用85%的磷酸，按1:6的料液比添加柞蚕丝和磷酸，在90℃条件下水解6h，按照实施例1的方法脱盐、浓缩及干燥后得柞蚕丝素肽对照品。
利用gpc色谱法检测本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品和柞蚕丝素肽对照品的分子量分布，色谱条件包括检测器：dawnheleosⅱ18角度激光光散射仪（美国wyatt公司)；色谱柱：shodexohpaksb-804hq，sb-806hq；流动相：0.1mol/l硝酸钠溶液；流速：1ml/min；柱温：25℃。
本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品分子量分布如图1所示。
本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品与柞蚕丝素肽对照品的分子量分布结果如表3所示。
表3
结果表明：本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品分子量主要集中在0.1-2.0kd，占比90%左右，2.0-3.0kd区间占比约10%；而丝素肽对照品的分子量分布比较分散，0.1-1.0kd区间占比26.6%，1.0-2.0kd区间占比20.1%，2.0-3.0kd区间占比27.5%，3.0-5.0kd区间占比20.8%，5.0-8.0kd区间占比3.8%，>8.0kd区间占比1.2%。
本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品和柞蚕丝素肽对照品的保湿性实验：温度为20℃时，在干燥器底部盛装200g经干燥过的变色硅胶，然后放入本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品和柞蚕丝素肽对照品进行保湿试验。每隔12h将结晶皿取出精确称取试样重量，由公式保湿率(%)=hn/h0×100%，计算样品的保湿率，式中：h0和hn分别为放置前、后的水分质量。以甘油作为保湿性实验的对照（con），测定方法同上。对每次保湿实验重复三次，取三次结果的平均值，结果如图2所示。从图2可以看到，本发明实施例1的柞蚕丝素肽1号产品在12到48小时的保湿性好于柞蚕丝素肽对照品。
实施例2：
除b步骤外，其它步骤同实施例1。
b步骤是将溶丝液在40℃、60℃、90℃及100℃四个温度点进行水解反应，40℃水解4小时、60℃水解4小时、90℃水解3小时，100℃水解2小时，90℃水解反应后将酸度调至80%，即100℃水解是在酸度80%下进行。
d步骤干燥后得到柞蚕丝素肽2号产品。
利用gpc色谱法检测本发明实施例2的柞蚕丝素肽2号产品和柞蚕丝素肽对照品的分子量分布，色谱条件同实施例1。
本发明实施例2的柞蚕丝素肽2号产品分子量分布如图3所示。
本发明实施例2的柞蚕丝素肽2号产品与柞蚕丝素肽对照品的分子量分布结果如表4所示。
表4
结果表明：本发明实施例2的柞蚕丝素肽2号产品分子量主要集中在2.0-3.0kd，占比15.3%，3.0-5.0kd占比76.5%，5.0-8.0kd占比8.2%；而柞蚕丝素肽对照品的分子量分布比较分散，0.1-1.0kd区间占比26.6%，1.0-2.0kd区间占比20.1%，2.0-3.0kd区间占比27.5%，3.0-5.0kd区间占比20.8%，5.0-8.0kd区间占比3.8%，>8.0kd区间占比1.2%。
本发明实施例2柞蚕丝素肽2号产品降血糖功能实验：选取清洁级(spf)昆明种小鼠（大连医科大学动物中心，动物繁殖的合格证号（scxk(辽)2008-0002）），♀、♂各半，适应性喂养1个星期，随机取10只作为正常对照(con)，其余小鼠以四氧嘧啶诱导制作糖尿病模型。以空腹血糖水平≥11.0mmol/l和≤30.0mmol/l作为造模成功的标准，将造模成功的模型中选取30只小鼠用于实验，血糖未达标准者剔除。按血糖值、体质量随机分成3组：模型对照组（mol），柞蚕丝素肽2号产品组和柞蚕丝素肽对照品组。正常对照组和模型组每天灌服蒸馏水，柞蚕丝素肽2号产品组和柞蚕丝素肽对照品组每天灌服4g/kg，连续给药20d。柞蚕丝素肽2号产品组和柞蚕丝素肽对照品组在实验期间，在第0d、7d、14d分别于尾部采血测量空腹血糖（fbg），每次测血糖前禁食4h，结果如图4所示。从图4的降血糖实验可以看到，与模型组（mol）相比，柞蚕丝素肽2号产品组在7-14d的降血糖效果显著，柞蚕丝素肽对照品组虽然也有降血糖作用，但效果不显著。
实施例3：
步骤基本同实施例1，b步骤亦为三个温度点，分别为40℃、60℃、90℃，区别是每个温度点对应水解反应时间分别为4小时、4小时、3小时，b步骤后加温加压至116℃~124℃、0.08mpa~0.14mpa，水解反应2小时，再进行c步骤。
d步骤干燥后得到柞蚕丝素肽3号产品。
利用gpc色谱法检测本发明实施例3的柞蚕丝素肽3号产品和柞蚕丝素肽对照品的分子量分布，色谱条件同实施例1。
本发明实施例3的柞蚕丝素肽3号产品分子量分布如图5所示。
本发明实施例3的柞蚕丝素肽3号产品与柞蚕丝素肽对照品的分子量分布结果如表5所示。
表5
结果表明：本发明实施例3的柞蚕丝素肽3号产品分子量主要集中在主要集中在1.0-2.0kd，占比89.7%，2.0-3.0kd占比9.1%，3.0-5.0kd占比1.2%；而柞蚕丝素肽对照品的分子量分布比较分散，0.1-1.0kd区间占比26.6%，1.0-2.0kd区间占比20.1%，2.0-3.0kd区间占比27.5%，3.0-5.0kd区间占比20.8%，5.0-8.0kd区间占比3.8%，>8.0kd区间占比1.2%。
本发明实施例3柞蚕丝素肽3号产品降血糖功能实验：选取清洁级(spf)昆明种小鼠（大连医科大学动物中心，动物繁殖的合格证号（scxk(辽)2008-0002）），♀、♂各半，适应性喂养1个星期，随机取10只作为正常对照（con），灌胃生理盐水，其余小鼠灌胃60°白酒（15ml/kg/d）制作酒精性脂肪肝模型。按体质量随机分成3组：模型对照组（mol），柞蚕丝素肽3号组和柞蚕丝素肽对照组每日灌胃4g/kg柞蚕丝素肽。连续给药4周后，禁食（自由饮水）12h，眼眶取血，分离血清，待自然凝聚后，2-8℃，1000g离心l0min，取上清液冻存，留作血脂生化指标（tc，tg，ldlc，hdlc）的检测，按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书操作，制备空白管、标准管和测定管；充分混匀后，于37℃保温5min；于500nm处，lcm光径，空白管调零，测各管吸光度值；记录各管od值，按公式计算tc含量，以mmol/l表示，结果如图6。从图6可以看出，与模型组（mol）相比，本发明实施例柞蚕丝素肽3号产品能够降低血脂各项指标的水平并能显著降低tg和ldlc水平，而柞蚕丝素肽对照品虽也有降血脂作用，但只有降低tg水平具有显著性。