本发明属于免疫学技术领域，具体是一种可以鉴别pcv2与pcv3感染后抗体的pcv3抗原表位的多肽序列筛选方法。
背景技术：
圆环病毒对我国的养猪业危害巨大，其本身可以和多种病原体混合感染，容易引起免疫失败。目前对临床上危害较多的是pcv2感染，但近些年，圆环病毒在机体内出现重组、变异，出现了新的型别，pcv3。相关资料表明，pcv3单独感染可以造成猪群发病甚至死亡，其与pcv2混合感染对猪群造成的伤害更大。
然而，由于pcv3属于最近新发现的病毒株，临床上还没有效的防控手段。病毒在进化过程中，其本身为了逃逸机体的免疫监视，势必会进行相关氨基酸位点的突变，或者发生基因片段的重组，从而使得其在宿主内增殖。不论是关键氨基酸位点的突变还是基因片段的重组，其本质是病毒抗原表位的变异，其抗原表位不仅可以制备相应的检测试剂，还可以制备相关的亚单位疫苗，甚至根据其抗原表位制备相应的治疗抗体。
然而，在前期研究中，pcv2感染占主导地位，研究人员主要研究pcv2的相关致病及预防措施。由于pcv3疫病突发，目前还没有相关的诊断、预防及治疗措施。病毒在长期的进化中，机体也会提升自己的监视能力，对于新出现的、变异的病原体，机体自然会提升自己的监察能力，针对不同毒株，机体针对病原体产生的抗体所识别的位点自然不同。因此，根据其位点的差异，可以制备诊断其机体是否存在相关病毒株的抗体，从而推导出其是否感染相关病毒株。
近年的研究表明，根据病毒的表位从而研发相应的诊断试剂，治疗抗体，新型的亚单位疫苗是可行的。
技术实现要素：
本发明的目的是提供pcv3抗原表位的多肽序列及其筛选方法，通过免疫学方法首次鉴定出pcv3蛋白的抗原表位，同时公开pcv3抗原表位的用途。
本发明pcv3抗原表位的多肽序列，包括五条多肽，其氨基酸序列分别为：
pcv3-1：gtpqnnkpwh；
pcv3-2：spaqqtktmf；
pcv3-3：wlqddpyaesstrkv；
pcv3-4：mtskkkhsry；
pcv3-5：vpektgmtdfygtke；
上述氨基酸序列的核苷酸序列分别为：
pcv3-1：ggaacccctcagaataacaagccctggcac30；
pcv3-2：tctccggctcagcaaacaaaaactatgttc30；
pcv3-3：tggctccaagacgacccttatgcggaaagttccactcgtaaagtt45；
pcv3-4：atgacttctaaaaaaaaacacagccgttac30；
pcv3-5：gtcccggaaaaaactggaatgacagacttctacggcaccaaagaa45。
本发明pcv3抗原表位的多肽序列的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）根据ncibi上边公布的已知pcv3cap蛋白的氨基酸序列，比对分析pcv2与pcv3结构蛋白的主要差别，观察其氨基酸的保守性；
（2）使用dnastar7.0软件对其中一株pcv3的cap蛋白进行氨基酸抗原性预测，预测pcv3结构蛋白的抗原表位区，从而分阶段表达；
（3）通过采取免疫pcv2与pcv3的抗血清分别与pcv3表达一系列短肽进行结合反应，从而筛选出与pcv3特异性结合的短肽，其氨基酸序列分别为：
pcv3-1：gtpqnnkpwh；
pcv3-2：spaqqtktmf；
pcv3-3：wlqddpyaesstrkv；
pcv3-4：mtskkkhsry；
pcv3-5：vpektgmtdfygtke。
本发明采用elisa的方法检测pcv2与pcv3的抗血清igg，通过elisa的方法，筛选出与pcv3抗体特异性结合的短肽。筛选出的短肽，可以为将来pcv3的亚单位疫苗及相关诊断圆环病毒3感染的试剂，治疗圆环病毒3感染的抗体等提供可靠依据。
本发明的优点在于，筛选出的五条多肽抗原性良好，抗原表位经鉴定为pcv3所特有，且序列保守，应用其表位序列可以有效的鉴别诊断动物是否感染pcv3，为以后防治pcv3提供有效的检测手段。
附图说明
图1为实施例pcv3cap蛋白的抗原片段预测图。
图2为实施例经过纯化后的蛋白sds-page后结果图。
图3为pcv2与pcv3的多抗血清分别与5条多肽的间接elisa结果；其中，3a为验证试验图，3b为对照试验图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
实施例
pcv3抗原表位的多肽序列的筛选，包括如下步骤：
首先，根据ncibi上边公布的已知pcv3cap蛋白的氨基酸序列进行氨基酸序列的比对分析，观察其氨基酸的保守性；
其次，使用dnastar7.0软件对其中一株pcv3的cap蛋白进行氨基酸抗原性预测，预测结果见图1所示；
然后，通过pcr的方法，分别扩增预测的5条短肽序列，并克隆到原核表达载体pgex-4t-3中，通过转化的方法，转入bl21（de3）中，诱导表达；将诱导表达的细菌进行超声波破碎，使用gst蛋白纯化柱，纯化后的蛋白经过sds-page电泳后，其电泳结果如图2所示，1-5分别为5条短肽样品，marker为170kd蛋白电泳marker。
鉴别pcv2与pcv3抗体的间接elisa方法：
（1）将纯化后的5条短肽分别包被elisa板，所包被使用的蛋白浓度为5ug/ml，包被条件为4℃过夜；
（2）第二天弃去包被液，使用5%脱脂奶粉的pbst封闭elisa板，37℃封闭2h；
（3）使用pbst溶液清洗3次后，倍比稀释从猪场采集的猪阳性血清；第一列血清1:100稀释，后边一直倍比稀释到第11列，采用2倍梯度稀释法；加入1抗溶液（猪场采集的感染圆环病毒3的阳性），加入1抗后，放于37℃孵育1h；
（4）弃去1抗，pbst洗6次，之后加入1:8000的hrp标记的羊抗猪二抗，37℃孵育1h；
（5）pbst洗6次后，加入显色液以及底物溶液显色，之后加入终止液，在酶标仪上进行od450波长的读数，判别elisa反应结果。
elisa反应结果如图3所示。根据图中所示，pcv3-1：gtpqnnkpwh可以与感染pcv3的阳性血清特异性反应，与感染pcv2的阳性血清没有反应。
序列表
<110>华南农业大学
<120>pcv3抗原表位的多肽序列筛选方法
<141>2018-01-24
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>30
<212>dna
<213>siposequencelisting1.0
<400>1
ggaacccctcagaataacaagccctggcac30
<210>2
<211>30
<212>dna
<213>siposequencelisting1.0
<400>2
tctccggctcagcaaacaaaaactatgttc30
<210>3
<211>45
<212>dna
<213>siposequencelisting1.0
<400>3
tggctccaagacgacccttatgcggaaagttccactcgtaaagtt45
<210>4
<211>30
<212>dna
<213>siposequencelisting1.0
<400>4
atgacttctaaaaaaaaacacagccgttac30
<210>5
<211>45
<212>dna
<213>siposequencelisting1.0
<400>5
gtcccggaaaaaactggaatgacagacttctacggcaccaaagaa45