本发明涉及医药
技术领域：
，是一种荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷及其制备方法和应用。
背景技术：
：金莲花始载于清代赵学敏所著《本草纲目拾遗》，谓其“味苦，性寒，无毒”，可“治口疮、喉肿、浮热牙宣、耳疼、目痛”，具有“明目、解岚瘴”的功效。现代药理学研究表明，金莲花属植物具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性，对急性化脓性扁桃体炎、咽炎、上呼吸道感染、急性肠炎、泌尿系统感染等均有较好的疗效。目前，金莲花有冲剂、片剂、滴丸和注射液等多种制剂应用于临床，用于呼吸道感染、肠炎、中耳炎、泌尿系统感染等多种疾病的治疗。金莲花属植物在世界上共有25种，主要分布于北温带及寒温带高山区域。药用的主要有宽瓣金莲花(trolliusasiaticusl.)、金莲花(t.chinensis)、短瓣金莲花(t.ledebouri)、长瓣金莲花(t.macropetalus)、阿尔泰金莲花(t.altaicus)等。金莲花属植物化学成分主要包括黄酮、有机酸、生物碱和挥发油等，其中以荭草素、牡荆素及其衍生物为代表的黄酮碳苷类化合物是该属植物的主要特征性成分。作为金莲花属植物的一个品种，阿尔泰金莲花不仅在新疆阿勒泰地区有广泛的应用，而且还广泛流通于国内医药市场。该药材性味苦、凉，气微，具有清热解毒之功效，用于治疗上呼吸道感染、急慢性咽炎和扁桃体炎等，收载于《哈萨克药志》等医药文献中。然而，该药材的研究却少有文献报道。沈阳药科大学宋冬梅等通过硅胶、sephadexlh-20等柱色谱手段从阿尔泰金莲花中分离得到了6个黄酮类成分：荭草苷、牡荆苷、牡荆素2"-o-β-d-吡喃阿洛糖苷、柯伊俐素、木犀草素和异牡荆苷，并发现了其提取物的抑菌活性(阿尔泰金莲花的资源及质量控制研究[d].苏州大学,2005)。黄酮碳苷类化合物荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷是阿尔泰金莲花中含量最高的标识性成分，含量可达2.69％(中药材,2006,12:1312-1313)。有文献报道荭草素-2"-o-β-d-半乳糖苷能够抑制小胶质细胞炎症反应和产生神经保护作用(荭草素-2"-o-β-d-半乳糖苷抑制小胶质细胞炎症反应及其机制研究[d].苏州大学,2013.)。因此，为了阿尔泰金莲花的深度开发利用，也为了开发这一天然产物，有必要对其提取分离纯化方法进行研究。目前，荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的提取分离纯化主要是采用水醇提取、溶剂萃取及硅胶柱层析等常规提取分离纯化方法得到。董永喜等采用70％乙醇溶液提取、硅胶柱层析的方法从1.5公斤金莲花t.chinensis中分离纯化得到120mg的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷(中国药业,2012,21(19):17-18.)。从上述文献报道的方法可以看出，现有技术中荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的提取分离纯化存在得率低，操作繁琐，使用毒性大的有机溶剂等问题。同时，到目前为止也没有相关文献对荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷在化学性肝毒性物质所致肝损伤方面的相关报道。技术实现要素：本发明提供了一种荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷及其制备方法和应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有荭草素-2"-o-β-d-半乳糖苷的得率和纯度低，生产成本高，难以实现工业化生产；且也没有相关文献对荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷在化学性肝毒性物质所致肝损伤方面相关报道的问题。本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷，按下述方法得到：第一步，在干燥阿尔泰金莲花花蕾中加入乙醇溶液煮沸后回流提取2次至3次，每次回流提取1h至2h，提取后合并提取液并减压浓缩，减压浓缩后得到浸膏a；第二步，浸膏a用去离子水溶解后，上大孔吸附树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以30％乙醇溶液洗脱，收集30％乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏b；第三步，浸膏b用去离子水溶解后，上mcigelchp20p色谱柱，后以去离子水洗脱除杂，再依次用10％甲醇溶液、20％甲醇溶液、30％甲醇溶液、40％甲醇溶液、50％甲醇溶液梯度洗脱，收集含有荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的甲醇洗脱物，甲醇洗脱物减压浓缩至黄色粉末，即为荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷。下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：上述第一步中，乙醇溶液的加入量为阿尔泰金莲花干燥花蕾重量的8倍至20倍，乙醇溶液为50％至70％的乙醇溶液。上述第一步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.1至1.2，减压浓缩后得到浸膏a。上述第二步中，浸膏a用3倍至10倍浸膏a重量的去离子水溶解。上述第二步中，大孔吸附树脂的型号为d101型或ab-8型。上述第二步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.1至1.2，减压浓缩后得到浸膏b。上述第三步中，浸膏b用3倍至10倍浸膏b重量的去离子水溶解；或/和，第三步中，收集波长为254nm色谱峰下含有荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的甲醇洗脱物。上述第三步中，甲醇洗脱物减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，甲醇洗脱物减压浓缩的温度为45℃至60℃，甲醇洗脱物减压浓缩至质量百分含水率小于0.5％的黄色粉末，即为荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷。本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的制备方法，按下述步骤进行：第一步，在干燥阿尔泰金莲花花蕾中加入乙醇溶液煮沸后回流提取2次至3次，每次回流提取1h至2h，提取后合并提取液并减压浓缩，减压浓缩后得到浸膏a；第二步，浸膏a用去离子水溶解后，上大孔吸附树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以30％乙醇溶液洗脱，收集30％乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏b；第三步，浸膏b用去离子水溶解后，上mcigelchp20p色谱柱，后以去离子水洗脱除杂，再依次用10％甲醇溶液、20％甲醇溶液、30％甲醇溶液、40％甲醇溶液、50％甲醇溶液梯度洗脱，收集含有荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的甲醇洗脱物，甲醇洗脱物减压浓缩至黄色粉末，即为荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷。下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：上述第一步中，乙醇溶液的加入量为阿尔泰金莲花干燥花蕾重量的8倍至20倍，乙醇溶液为50％至70％的乙醇溶液。上述第一步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.1至1.2，减压浓缩后得到浸膏a。上述第二步中，浸膏a用3倍至10倍浸膏a重量的去离子水溶解。上述第二步中，大孔吸附树脂的型号为d101型或ab-8型。上述第二步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.1至1.2，减压浓缩后得到浸膏b。上述第三步中，浸膏b用3倍至10倍浸膏b重量的去离子水溶解；或/和，第三步中，收集波长为254nm色谱峰下含有荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的甲醇洗脱物。上述第三步中，甲醇洗脱物减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，甲醇洗脱物减压浓缩的温度为45℃至60℃，甲醇洗脱物减压浓缩至质量百分含水率小于0.5％的黄色粉末，即为荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷。本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷在制备预防和/或治疗化学性肝毒性物质所致肝损伤药物中的应用。本发明较现有分离纯化技术得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷，得率有较大幅度提升，纯度更高，成本更低，易于工业化生产；同时本发明首次公开了荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷在制备预防和/或治疗化学性肝毒性物质所致肝损伤药物中的应用，试验证明，本发明得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷能够很好的预防和/或治疗化学性肝毒性物质所致肝损伤。具体实施方式本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为体积百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，乙醇溶液为乙醇溶液水溶液。实施例1，该荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷按下述制备方法得到：第一步，在干燥阿尔泰金莲花花蕾中加入乙醇溶液煮沸后回流提取2次至3次，每次回流提取1h至2h，提取后合并提取液并减压浓缩，减压浓缩后得到浸膏a；第二步，浸膏a用去离子水溶解后，上大孔吸附树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以30％乙醇溶液洗脱，收集30％乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏b；第三步，浸膏b用去离子水溶解后，上mcigelchp20p色谱柱，后以去离子水洗脱除杂，再依次用10％甲醇溶液、20％甲醇溶液、30％甲醇溶液、40％甲醇溶液、50％甲醇溶液梯度洗脱，收集含有荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的甲醇洗脱物，甲醇洗脱物减压浓缩至黄色粉末，即为荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷。可用薄层色谱检测荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的甲醇洗脱物；实施例1得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的得率为2.15％至2.30％；实施例1得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的纯度为96.68％至98.12％。实施例2，该荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷按下述制备方法得到：第一步，在干燥阿尔泰金莲花花蕾中加入乙醇溶液煮沸后回流提取2次或3次，每次回流提取1h或2h，提取后合并提取液并减压浓缩，减压浓缩后得到浸膏a；第二步，浸膏a用去离子水溶解后，上大孔吸附树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以30％乙醇溶液洗脱，收集30％乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏b；第三步，浸膏b用去离子水溶解后，上mcigelchp20p色谱柱，后以去离子水洗脱除杂，再依次用10％甲醇溶液、20％甲醇溶液、30％甲醇溶液、40％甲醇溶液、50％甲醇溶液梯度洗脱，收集含有荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的甲醇洗脱物，甲醇洗脱物减压浓缩至黄色粉末，即为荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷。实施例3，作为上述实施例的优化，第一步中，乙醇溶液的加入量为阿尔泰金莲花干燥花蕾重量的8倍至20倍，乙醇溶液为50％至70％的乙醇溶液。实施例4，作为上述实施例的优化，第一步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.1至1.2，减压浓缩后得到浸膏a。实施例5，作为上述实施例的优化，第二步中，浸膏a用3倍至10倍浸膏a重量的去离子水溶解。实施例6，作为上述实施例的优化，第二步中，大孔吸附树脂的型号为d101型或ab-8型。实施例7，作为上述实施例的优化，第二步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.1至1.2，减压浓缩后得到浸膏b。实施例8，作为上述实施例的优化，第三步中，浸膏b用3倍至10倍浸膏b重量的去离子水溶解；或/和，第三步中，收集波长为254nm色谱峰下含有荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的甲醇洗脱物。实施例9，作为上述实施例的优化，第三步中，甲醇洗脱物减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，甲醇洗脱物减压浓缩的温度为45℃至60℃，甲醇洗脱物减压浓缩至质量百分含水率小于0.5％的黄色粉末，即为荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷。实施例10，该荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷按下述制备方法得到：第一步，称取1.0kg干燥阿尔泰金莲花花蕾，在干燥阿尔泰金莲花花蕾中加入乙醇溶液煮沸后回流提取2次，每次回流提取1h，提取后合并提取液并减压浓缩，减压浓缩后得到浸膏a；第二步，浸膏a用去离子水溶解后，上大孔吸附树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以30％乙醇溶液洗脱，收集30％乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏b；第三步，浸膏b用去离子水溶解后，上mcigelchp20p色谱柱，后以去离子水洗脱除杂，再依次用10％甲醇溶液、20％甲醇溶液、30％甲醇溶液、40％甲醇溶液、50％甲醇溶液梯度洗脱，收集含有荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的甲醇洗脱物，甲醇洗脱物减压浓缩至黄色粉末，即为荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷。实施例10得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的得率为2.26％；实施例10得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的纯度为96.68％。实施例11，该荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷按下述制备方法得到：第一步，称取50.0kg干燥阿尔泰金莲花花蕾，在干燥阿尔泰金莲花花蕾中加入乙醇溶液煮沸后回流提取3次，每次回流提取2h，提取后合并提取液并减压浓缩，减压浓缩后得到浸膏a；第二步，浸膏a用去离子水溶解后，上大孔吸附树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以30％乙醇溶液洗脱，收集30％乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏b；第三步，浸膏b用去离子水溶解后，上mcigelchp20p色谱柱，后以去离子水洗脱除杂，再依次用10％甲醇溶液、20％甲醇溶液、30％甲醇溶液、40％甲醇溶液、50％甲醇溶液梯度洗脱，收集含有荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的甲醇洗脱物，甲醇洗脱物减压浓缩至黄色粉末，即为荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷。实施例11得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的得率为2.30％；实施例11得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的纯度为98.12％。实施例12，该荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷在制备预防和/或治疗化学性肝毒性物质所致肝损伤药物中的应用。上述实施例得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷在制备预防和/或治疗化学性肝毒性物质所致肝损伤药物中的应用试验如下：荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷对四氯化碳(ccl4)致小鼠急性肝损伤的防治作用研究实验方法昆明种小鼠60只，体重18g至22g，随机分为6组，每组10只，随机分为本发明荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷低剂量组(50mg/kg)、本发明荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷中(100mg/kg)、本发明荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷高剂量组(200mg/kg)、联苯双酯阳性对照组(200mg/kg)、模型组和空白组。给药组按10ml/kg体重每日灌胃给药1次，空白组和模型组小鼠每日灌胃等体积的蒸馏水1次，连续灌胃7天。末次给药1小时后，除对空白组腹腔注射花生油溶液10ml/kg外，其余各组均腹腔注射含体积分数0.12％的四氯化碳花生油溶液10ml/kg。禁食不禁水8小时后摘眼球取血，3000r/min离心取血清，按试剂盒说明书测定小鼠血清alt和ast水平。采用spss统计学软件进行数据处理，结果以x±s表示，用单因素方差分析对数据进行分析；荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷对ccl4致肝损伤小鼠血清alt和ast的影响(n＝10,x±s)见表1所示。从表1可以看出，与空白组相比较，模型组ccl4致肝损伤小鼠血清alt和ast活性显著提高(p<0.05)，说明小鼠肝细胞膜的结构和功能受到损伤。与模型组比较，本发明荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷低剂量组(50mg/kg)、本发明荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷中(100mg/kg)和本发明荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷高剂量组(200mg/kg)均能显著降低小鼠血清alt和ast水平(p<0.05)，且呈剂量依赖关系，其疗效接近于阳性对照联苯双酯；说明本发明荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷对四氯化碳致小鼠急性肝损伤具有较好的保护作用，可应用于化学性肝毒性物质所致肝损伤的预防和治疗。本发明较现有技术的优点：1.采用现有分离纯化技术得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的平均得率小于1％；而采用本发明得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的得率为2.15％至2.30％；说明本发明较现有分离纯化技术得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的得率有较大幅度提升。2.采用现有分离纯化技术得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的纯度为95％；而采用本发明得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的纯度为96.68％至98.12％；说明本发明较现有分离纯化技术得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷的纯度更高。3.本发明制备工艺流程操作简单，在制备过程中仅使用水和乙醇溶液，避免了现有分离纯化技术中使用的氯仿和乙酸乙酯等其它价格高、毒性较大、易燃易爆的有机溶剂，从而降低了生产成本。4.本发明首次公开了荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷在制备预防和/或治疗化学性肝毒性物质所致肝损伤药物中的应用。综上所述，本发明较现有分离纯化技术得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷，得率有较大幅度提升，纯度更高，成本更低，易于工业化生产；同时本发明首次公开了荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷在制备预防和/或治疗化学性肝毒性物质所致肝损伤药物中的应用，试验证明，本发明得到的荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷能够很好的预防和/或治疗化学性肝毒性物质所致肝损伤。以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。表1荭草素2″-o-β-l-半乳糖苷对ccl4致肝损伤小鼠血清alt和ast的影响组别剂量(mg/kg)alt(u/l)ast(u/l)空白组-60.39±16.05123.78±17.28模型组-122.47±16.71#326.72±33.07#阳性对照组20066.74±12.51*196.50±42.01*本发明低剂量组50103.30±16.46*276.86±33.35*本发明中剂量组10080.49±13.31*245.78±30.14*本发明高剂量组20070.81±12.03*207.97±40.68*注：与空白组比较，#p<0.01；与模型组比较，*p<0.01。当前第1页12