本发明涉及鉴别鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株技术领域，尤其是用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合、试剂盒以及方法。
背景技术：
鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(ducktembusuvirus，dtmuv)引起的一种新的鸭传染病，感染率达100％，发病率和死亡率为5％～30％，主要表现为生长缓慢、高热、食欲下降、产蛋量急剧下降甚至停止、病鸭死亡等临床症状，对我国养鸭业造成了严重的经济损失。dtmuv为有囊膜的单股正链rna病毒，属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类恩塔亚病毒群。dtmuv不仅可以感染鸭，还可以感染鸡、鹅、麻雀等禽类，甚至从蚊子中分离到病毒，在人血清和口腔拭子中也检测到dtmuv抗体和病毒核酸。
由于目前尚无有效的治疗方案，接种疫苗仍然是预防该疾病流行的最有效方式。已经获批的鸭坦布苏病毒疫苗包括灭活疫苗hb株及活疫苗wf100株，另外还有2014年11月临床试验申请获批的fx2010-180p株等。由于活疫苗在临床使用存在一定的毒力返强及排毒风险，故接种活疫苗对疾病的及时准确诊断带来了一定的难度，从而影响其疾病治疗效果。有必要建立针对鸭坦布苏病毒疫苗株与野毒株的鉴别检测方法。
目前对dtmuv的检测主要有病毒分离鉴定、套式rt-pcr、rt-lamp、荧光定量rt-pcr、双抗体夹心elisa，未检索到dtmuv野毒株与疫苗株的鉴别检测方法。因此，建立一种疫苗株与野毒株的鉴别检测方法具有重要意义。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合，本发明提供了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，本发明还提供了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠，有利于在临床实践中推广应用。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合，所述引物的核苷酸序列如下所示：
引物f：5'-ataacagtcaacccatacgtgtc-3'；
引物r：5'-cacttctatgccactggtacct-3'；
所述探针的核苷酸序列：5'-ccacttccaccattatcttggcacccg-3'，其中，所述探针的5’端结合荧光报告基团，所述探针p的3’端结合荧光淬灭基团。
优选地，所述荧光报告基团为fam、hex、vic、cy5、tet中的至少一种，所述荧光淬灭基团为tamra、mgb、bhq中的至少一种。
本发明提供了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，所述试剂盒含有上述所述的引物和探针的组合。
优选地，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品包括dtmuv野毒株的核酸、dtmuv活疫苗wf100株的核酸及fx2010-180p株的核酸。
本发明提供了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的方法，包括以下步骤：
(1)从样品中提取病毒rna；
(2)以步骤(1)提取的病毒rna为模板，以dtmuv野毒株的核酸、dtmuv活疫苗wf100株的核酸及dtmuv活疫苗fx2010-180p株的核酸作为阳性对照，采用上述所述的引物和探针的组合进行荧光pcr扩增反应获得扩增产物；
(3)对扩增产物进行熔解曲线分析，将样品的熔解温度与阳性对照品的熔解温度进行比较，若样品的熔解温度与阳性对照的熔解温度的δtm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有该阳性对照所对应的病毒株。
熔解曲线分析技术是一种基于pcr结合靶序列与探针杂交后熔点发生变化而对基因snp位点进行快速检测的方法，该法具有操作省时、高通量、避免污染、结果分析直观、易于判断、应用范围较广等优点。
优选地，所述步骤(2)中的荧光pcr扩增反应体系为：
优选地，所述步骤(2)中的荧光pcr扩增反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸20s；循环55次。
优选地，所述步骤(3)中的熔解曲线分析程序为：95℃变性10sec；37℃退火60sec；37℃到97℃以0.2℃/s的速率，5次/℃连续采集探针荧光信号，进行熔解曲线分析。
优选地，所述步骤(3)中将样品的熔解温度与阳性对照品的熔解温度进行比较的具体过程：
若样品熔解温度与dtmuv活疫苗wf100株的核酸的熔解温度的δtm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有鸭坦布苏病毒疫苗wf100株；
若样品熔解温度与dtmuv活疫苗fx2010-180p株的熔解温度的δtm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有鸭坦布苏病毒疫苗fx2010-180p株；
若样品熔解温度与dtmuv野毒株的核酸的熔解温度的δtm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有鸭坦布苏病毒野毒株。
本发明的有益效果为：
(1)本发明首次建立了一种可快速区分鸭坦布苏病毒野毒株与疫苗株的荧光pcr检测方法以及相应的引物和探针，该检测方法操作简单，只需一个反应即可实现鸭坦布苏病毒野毒株与疫苗株(wf100株和fx2010-180p株)的鉴别检测；检测速度快且高通量，全部操作过程不需3小时，显著缩短了病毒野毒株与疫苗株鉴别与检测所需时间，并且准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
(2)本发明的荧光pcr引物对f/r，对鸭坦布苏病毒可特异性扩增，有助于提高pcr的效率，减少病毒鉴别分型的时间；本发明的探针可特异性与鸭坦布苏病毒野毒株与疫苗株(wf100株和fx2010-180p株)的鉴别位点杂交，特异性较好；引物对f/r和探针，均不与其他常见鸭源病毒核酸结合，有利于提高本发明对结果分析的正确性。
(3)本发明的用于区分鸭坦布苏病毒野毒株与疫苗株的荧光pcr检测方法的最低检测限可达到每个反应单拷贝，灵敏度较高。
附图说明
图1为dtmuv标准化样品的熔解曲线图；
图2为dtmuv荧光检测方法特异性试验熔解曲线图；
图3为dtmuv核酸的灵敏度试验熔解曲线图；
图4为dtmuv临床样品的熔解曲线图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1引物及探针
本申请的发明人对所设计的大量引物和探针进行试验筛选后，发现引物f/r，及探针p对熔解曲线分析法区分dtmuv野毒株与疫苗株的效果最好，其碱基序列如下所示。
引物f：5'-ataacagtcaacccatacgtgtc-3'(seqidno：1)；
引物r：5'-cacttctatgccactggtacct-3'(seqidno：2)；
探针p：5'-ccacttccaccattatcttggcacccg-3'(seqidno：3)，其中，所述探针p的5’端结合荧光报告基团，所述探针p的3’端结合荧光淬灭基团。
实施例2标准样品的制备、荧光pcr扩增及熔解曲线分析
1)鸭坦布苏病毒rna的提取
分别取dtmuv活疫苗wf100株及fx2010-180p株，加入3mlpbs盐酸缓冲溶液进行溶解，分别取dtmuv野毒株w株细胞培养液各200μl按takara公司的minibestviralrna/dnaextractionkitver.4.0的说明书进行核酸提取。
2)标准样品的制备
为了验证本发明方法可行性与可靠性，同时构建标准阳性样品(经序列测定正确)，为之后的临床样品检测提供阳性对照，本实施例中优先制备dtmuv野毒株w与疫苗株wf100株及fx2010-180p株的阳性标准样品p-w、p-wf100及p-fx2010-180p。
标准样品p-w、p-wf100及p-fx2010-180p的制备步骤如下：取经过测序确定为野毒株的w株细胞培养液，购买疫苗公司的鸭坦布苏病毒活疫苗wf100株及fx2010-180p株；分别提取上述野毒株w株、疫苗株wf100株及fx2010-180p株的核酸，并以引物f和引物r为扩增引物进行rt-pcr扩增。分别回收纯化扩增的产物，克隆至pmd18t-vector中作为dtmuv野毒株和疫苗株wf100株及fx2010-180p株的阳性对照样品，依次命名为p-w、p-wf100及p-fx2010-180p。
3)阳性标准样品的荧光pcr
分别以上述获得的三种阳性标准样品为模板，分别进行荧光pcr扩增反应和熔解曲线分析；
按以下组成配制rt-pcr反应液，对照
pcr扩增反应程序如下：
50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸20s；循环55次。
熔解曲线分析程序如下：
95℃变性10sec；37℃退火60sec；37℃到97℃以0.2℃/s的速率，5次/℃连续采集探针p荧光信号，进行熔解曲线分析。
4)阳性标准样品熔解曲线分析的结果分析：
pcr扩增产物用lightcycler96分析仪进行分析。dtmuv的野毒株与疫苗株wf100株及fx2010-180p株的阳性标准样品p-w、p-wf100及p-fx2010-180p熔解曲线分析结果如图1所示。
结合图1的结果，可获知：
1)dtmuv野毒株，相应的熔解温度为69.85±0.20℃；
2)dtmuv疫苗株wf100株，相应的熔解温度为53.11±0.49℃；
3)dtmuv疫苗株fx2010-180p株，相应的熔解温度为65.52±0.25℃。
上述结论均已通过测序方法得到证实。由此，通过熔解曲线tm值差异可以完全区分开dtmuv野毒株及疫苗株wf100株和fx2010-180p株。
实施例3用于区分鸭坦布苏病毒野毒株与疫苗株的方法
本发明的用于区分鸭坦布苏病毒野毒株与疫苗株的方法的一种实施例，包括如下步骤：
1)从样本中提取病毒核酸：方法同上述实施例2中核酸提取方法。
2)以提取的病毒核酸为模板，分别进行荧光pcr扩增反应和熔解曲线分析；同时以实施例2中的阳性标准品p-w、p-wf100及p-fx2010-180p作为阳性对照。
其中，pcr反应体系如下：
pcr扩增反应程序如下：
50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸20s；循环55次。
熔解曲线分析程序如下：
95℃变性10sec；37℃退火60sec；37℃到97℃以0.2℃/s的速率，5次/℃连续采集探针p荧光信号，进行熔解曲线分析。
4)阳性标准样品熔解曲线分析结果与分析
pcr扩增产物用lightcycler96分析仪进行分析：在引物f、r和探针p的荧光检测结果中，
1)若样品熔解温度与阳性对照p-w熔解温度的δtm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有dtmuv野毒株；
2)若样品熔解温度与阳性对照p-wf100熔解温度的δtm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有dtmuv活疫苗wf100株；
3)若样品熔解温度与阳性对照p-fx2010-180p熔解温度的δtm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有dtmuv活疫苗fx2010-180p株。
实施例4特异性实验
为了检测本申请的用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针、以及方法的特异性，发明人进行了如下试验：
分别提取其他常见导致鸭产蛋下降类病原，如提取鸭瘟病毒(dpv)、鸭病毒性肝炎病毒(dhv-1)、鸡传染性支气管炎(ibv)以及新城疫病毒(ndv)和减蛋综合征病毒(edsv)，将上述病毒的核酸和水分别作为pcr模板，以上述实施例2中的pcr扩增反应和熔解曲线分析方法进行分析，并与dtmuv的野毒株与疫苗株wf100株和fx2010-180p株的阳性标准样品p-w、p-wf100及p-fx2010-180p进行对比分析，熔解曲线峰型化图如图2所示。
从图2可以看出，本发明的检测方法只能特异性扩增并形成dtmuv的野毒株与疫苗株wf100株和fx2010-180p株的熔解峰，而对其它常见导致鸭产蛋下降类病原，如dpv、dhv-1、ndv、edsv、ibv都没有扩增并形成特异熔解峰，表明实施例1的引物对f/r及探针p具有很好的特异性，可以用于dtmuv疫苗株及野毒株的荧光检测。
实施例5灵敏度实验
为了检测本申请的用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针、以及方法的灵敏度，发明人进行了如下试验：
将实施例2中标准质粒样品p-w、p-wf100及p-fx2010-180p做核酸检测，换算质粒数，做10倍梯度稀释，形成1.0x108、1.0x107、1.0x106、1.0x105、1.0x104、1.0x103、1.0x102、1.0x101、1.0x100copies/μl共9个梯度，按上述实施例2中的荧光pcr扩增反应和熔解曲线分析方法进行分析，扩增曲线图和熔解曲线峰型化图如图3所示。
从图3可以看出，本发明检测方法针对dtmuv每种型随着核酸浓度的降低呈现明显的下降的荧光信号，当质粒浓度降低至1.0x100copies/reaction，还可以检测到相应明显的荧光信号，说明本发明的方法可用于区分dtmuv野毒株及疫苗株，该方法的灵敏度较高。
实施例6临床样品荧光pcr扩增及熔解曲线分析
1)从临床采集的样本中提取病毒核酸：方法同上述实施例2中核酸提取方法。
2)以提取的病毒核酸为模板，方法同上述实施例2中荧光pcr扩增反应和熔解曲线分析；同时以实施例2中所述的阳性标准品p-w、p-wf100及p-fx2010-180p作为阳性对照。
3)临床样品熔解曲线分析结果与分析：
荧光pcr扩增产物用lightcycler96分析仪进行分析。本实施例检测了临床样本12个，编号分别为1-12，熔解曲线分析结果如图4所示，其中p-w、p-wf100及p-fx2010-180p为阳性对照，水为阴性对照。
从图4所示的jev临床样品检测峰型化熔解曲线图上可以看出，样本1、2、3、5、6、7、8、9、12共九个样本与阳性对照p-w的δtm值的绝对值均小于1.0℃，为野毒株；样本11与阳性对照p-wf100的δtm值的绝对值均小于1.0℃，为疫苗株wf100株；样本4和10共两个样本，与阳性对照p-fx2010-180p的δtm值的绝对值均小于1.0℃，为疫苗株fx2010-180p株。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110>广东省农业科学院动物卫生研究所
<120>用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合
<130>2018
<160>3
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
ataacagtcaacccatacgtgtc23
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
cacttctatgccactggtacct22
<210>3
<211>27
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
ccacttccaccattatcttggcacccg27