本发明是关于巴利阿里假单胞菌及其应用，具体地说，是关于脱除金属表面处理废水中含氮化合物的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1的其相关应用。
背景技术：
随着我国制造工业的迅速崛起，机械加工、电镀及冶炼等工业在进行金属表面处理时，常常需要对金属表面进行洗涤，产生大量洗涤、冲淋废水。金属表面处理废水富含各种有机物、高磷、高氮及有毒有害重金属，高含量的氮不仅会引起水体的富营养化还会对人体健康造成严重损失，因此，对此类废水脱氮处理至关重要。
现阶段国内外处理金属表面处理废水应用比较广泛的方法为化学法、生物法、生化结合法。金属表面处理废水中的氮多以硝态氮的形式存在，化学法可以很好地脱除水中的有毒有害物质及高磷，但无法对硝态氮有很好的去除效果。生物脱氮是通过将筛选的或通过生物工程技术得到的菌种添加到污染体系中，以污水中含氮化合物为能源生存，实现对含氮化合物的降解。菌种既可以附着在载体上，形成高效生物膜；也可以以游离的状态存在。
技术实现要素：
为解决上述的问题，本发明提供一种如下的技术方案：
本发明的目的之一在于提供一种巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1，该菌株FX-1已于2018年3月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(地址：广州市先烈中路100号59号楼5楼，广东省微生物研究所，分类命名：巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)，保藏编号：GDMCC No.60335。
本发明的第二目的是提供上述的巴利阿里假单胞菌FX-1的应用，所述的巴利阿里假单胞菌FX-1用于降解氮化合物，优选用于用于降解金属表面处理废水、养殖废水、制药废水、石化废水、焦化废水、化肥废水、市政污水、景观水、食品废水、大豆蛋白废水中的氮化合物。
优选的，所述的氮化合物为硝态氮、亚硝态氮和/或氨氮。
优选的，应用巴利阿里假单胞菌FX-1降解氮化合物可以是在缺氧环境下进行。也可以在兼氧条件下降解硝态氮化合物。
本发明提供的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1可以以硝态氮化合物作为唯一氮源进行生长繁殖。
一种菌制剂，所述的菌制剂采用上述的巴利阿里假单胞菌FX-1制备而成，该菌制剂也用于降解氮化合物，同时所述的菌制剂还包括有营养培养基。营养培养基选自牛肉膏蛋白胨培养基、LB营养培养基、以及添加有碳源的无机盐培养基中的任意一种，其中，碳源优选为乙酸钠。
牛肉膏蛋白胨培养基的成分及含量为：牛肉3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，pH＝7.0-8.0，优选pH＝7.4-7.6。
LB营养培养基的成分及含量为：酵母粉5.0g/L、氯化钠10.0g/L、蛋白胨10.0g/L，pH＝7.2～7.6。
无机盐培养基的成分及含量为：硝酸钠10g/L、钼酸钠0.08g/L、七水合硫酸亚铁0.12g/L、七水合硫酸镁0.2g/L、氯化钙0.12g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二胺1g/L，pH＝7.2-7.6。
本发明提供了所述的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1或菌制剂在降解金属表面处理废水中的应用，其应用步骤如下：
a)、将所述的巴利阿里假单胞菌或菌制剂与待处理金属表面处理废水混合；巴利阿里假单胞菌添加量为添加量占废水处理体系总体积的1.5％-30％，废水处理体系中的碳氮比为1-3。优选的，添加量为废水体积的6％-15％，废水处理体系中的碳氮比为2-2.5。
巴利阿里假单胞菌或菌制剂与待处理金属表面处理废水混合后，混合体系中活菌数为1X105～1X108cell/mL。
b)、混合后投加三水合乙酸钠1.05～1.81g/L作为碳源，然后放置于20-40℃，优选30℃，160rpm的水浴摇床中反应，反应一定时间后取样；
pH值为6-8，优选为6.5-7.5，更优选为7，有利于巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1在金属表面处理水中生长繁殖，从而加快对金属表面处理水中的硝态氮化合物的降解。
优选的，金属表面处理水的硝态氮浓度为110-130mg/L。
本发明的有益效果在于，对金属表面处理废水中硝态氮有很好的去除效果，对环境无污染，是优选的除氮选择。
附图说明
图1为本发明实施例2中巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1的菌落形态图；
图2为本发明实施例3中巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1及同时筛选得到的FX-2、FX-5分别对金属表面处理废水的硝态氮去除情况；
图3为本发明实施例4中巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1处理金属表面处理废水不同反应时间的硝态氮、COD去除情况；
图4为本发明实施例5提供FX-1菌株的不同碳氮比处理金属表面处理水的硝态氮、氨氮、总氮、COD去除情况；
图5为本发明实施例6提供FX-1菌株的不同添加量处理金属表面处理水的硝态氮、氨氮、总氮、COD去除情况。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图与实施例对本发明作进一步地详细描述。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂，均可通过商购获得。
实施例1
筛选获取巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1，其筛选过程如下：
步骤1)、从中石化公司污水处理车间A/A/O处理工艺A池出口取活性污泥；
步骤2)、将5g的活性污泥接种至硝态氮体积分数为0.5％的无机盐培养基中，在温度为30℃、转速为150转/分钟的摇床上培养1天，得到第一菌液；
步骤3)、吸取步骤2)中的第一菌液转接至硝态氮体积分数为1.5％的无机盐培养基中，在温度为30℃、转速为150转/分钟的摇床上培养1天，得到第二菌液；
步骤4)、吸取步骤3)中的第二菌液转接至硝态氮体积分数为2.0％的无机盐培养基中，在温度为30℃、转速为150转/分钟的摇床上培养1天，得到第三菌液；
步骤5)、吸取步骤4)中的第三菌液涂布于硝态氮体积分数为2.0％的无机盐固体培养基中，在温度为30℃、转速为150转/分钟的摇床上培养1天，获得单菌落；
步骤6)、挑取步骤5)中的单菌落置于离心管中，与甘油(体积分数30％)1:1体积混合，制成菌液，并于-80℃超低温冰箱中保存。
实施例2
对实施例1筛选的菌种进行鉴定。
本发明的实施例1中，筛选到四株菌，本发明中分别命名为FX-1、FX-2、FX-5。其中，经鉴定，FX-1为巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)。
巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1在琼脂平板培养基上生长良好，如图1所示，菌落呈不规则形状，有褶皱，透明，大小不一，直径2～4mm，表面干燥，边缘不平整，革兰氏染色为阴性，具有运动性，兼氧生长。菌株生长温度为20～40℃，pH 6～9，最适生长条件：生长温度为30℃，pH 7.5。
对实施例1中的步骤5)获得的单菌落提取DNA，并对菌种进行DNA测序，其16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。该菌株FX-1已于2018年3月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(地址：广州市先烈中路100号59号楼5楼，广东省微生物研究所，分类命名：巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)，保藏编号：GDMCC No.60335。本发明中亦称该菌为巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1。
实施例3
对实施例1获得的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1菌的氮化合物物降解能力进行测定。具体步骤如下：
步骤1)、取实施例1获得的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1及同时筛选得到的FX-2、FX-3的菌液，于4000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1；
步骤2)、将0mL、8.00mL的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1以及同时筛选到的FX-2、FX-5分别加入编号为1、2、3、4的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为113.38mg/L的金属表面处理水及三水合乙酸钠(碳氮比为2.0)至总体积均为80mL，编号1(对照)、2、3、4中的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1以及同时筛选到FX-2、FX-5原菌液的菌浓在8.1X107～6.4X108cell/mL，体积分数分别为0、10％；
步骤3)、将步骤2)中的测量系统置于摇床中，于30℃下，150转/分钟培养16h，测得16h处理后的硝态氮，并计算处理后的金属表面处理水的硝态氮去除率。
结果详见表1和图2。
表1不同菌株处理金属表面处理水的硝态氮浓度及去除率
如表1所示，3株脱氮菌选择添加量为10％，处理时间为16h时，FX-1菌以在缺氧环境中，对金属表面综合水处理16h时的硝态氮脱除效率达到98.40％，此时硝态氮浓度为1.82mg/L。而FX-2菌与FX-5菌反硝化性能显著低于FX-1菌，硝态氮处理效率分别为44.23％和22.2％。因此，FX-1菌的脱氮效果更优，选择FX-1菌做后续的研究。从图2中可以看出，FX-1菌的脱氮效果和FX-2菌与FX-5菌相比，其效果远远要好于FX-2菌与FX-5菌。
实施例4
对实施例1获得的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1菌的不同反应时间的氮化合物物降解能力进行测定。
具体步骤如下：
步骤1)、取实施例1获得的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1，于4000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1；
步骤2)、将0mL、8.00mL的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1分别加入编号为0、1、2、3、4、5的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为123.65mg/L的金属表面处理水及三水合乙酸钠(碳氮比为2.0)至总体积均为80mL，编号0(对照)、1、2、3、4、5中的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1原菌液的菌浓在8.1X107～6.4X108cell/mL，体积分数分别为0、10％；
步骤3)、将步骤2)中的测量系统置于摇床中，于30℃下，150转/分钟培养0h，8h，12h，16h，20h，24h，测得每个时间点处理后的硝态氮、COD及pH，并计算处理后的金属表面处理水的硝态氮和COD的去除率。
结果详见表2和图3。
表2 FX-1菌株不同反应时间处理金属表面处理水的硝态氮浓度及COD的去除
如表2所示，在FX-1菌株添加量为10％条件下分别对0h，8h，12h，16h，20h，24h的pH、硝态氮和COD变化考察，结果表明随着处理时间的增加，硝态氮去除率有先增加后下降的趋势。其中，处理时间为16h时，FX-1菌脱氮效率最高，且为93.20％，此时硝态氮浓度为8.40mg/L。当处理时间少于16h时，菌株反硝化进程进行得不完全，脱氮效率较低。当处理时间大于16h时，由于体系中碳源或氮源缺乏，微生物菌体活性下降，造成一部分菌体死亡，会增加水中的硝态氮和COD含量。由以上硝态氮和COD处理结果表明，反应时间选择16h最佳，从图3也可以得出相同的结论。
实施例5
对实施例1获得的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1菌的不同碳氮比条件下的氮化合物物降解能力进行测定。具体步骤如下：
步骤1)、取实施例1获得的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1，于4000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1；
步骤2)、将0mL、8.00mL的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1分别加入编号为1、2的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为119.45mg/L的金属表面处理水和三水合乙酸钠(碳氮比为1.5)至总体积均为80mL，编号1(对照)、2中的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1原菌液的菌浓在8.1X107～6.4X108cell/mL，体积分数分别为0、10％；
步骤3)、将0mL、8.00mL的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1分别加入编号为3、4的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为119.45mg/L的金属表面处理水和三水合乙酸钠(碳氮比为2.0)至总体积均为80mL，编号3(对照)、4中的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1原菌液的菌浓在8.1X107～6.4X108cell/mL，体积分数分别为0、10％；
步骤4)、将0mL、8.00mL的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1分别加入编号为5、6的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为119.45mg/L的金属表面处理水和三水合乙酸钠(碳氮比为2.5)至总体积均为80mL，编号5(对照)、6中的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1原菌液的菌浓在8.1X107～6.4X108cell/mL，体积分数分别为0、10％；
步骤4)、将步骤2)，步骤3)，步骤4)中的测量系统置于摇床中，于30℃,下，150转/分钟培养16h，测得16h处理后的硝态氮、亚硝态氮、氨氮、总氮、COD及pH，并计算处理后的金属表面处理水的硝态氮、氨氮、总氮、COD的去除率。
结果详见表3，表4，表5，表6，表7和图4。
表3 FX-1处理金属表面处理水不同碳氮比硝态氮浓度及去除率
如表3所示，在FX-1菌株添加量为10％，反应时间为16h条件下，分别对碳氮比为1.5，2.0和2.5的硝态氮和COD去除效果进行考察，结果碳氮比越高，硝态氮浓度越低，硝态氮脱除速率越大。碳氮比为1.5，2.0，2.5处理后的硝态氮浓度分别为：26.94mg/L，4.76mg/L，3.33mg/L。FX-1菌利用NO2-和NO3-为呼吸作用的最终电子受体，把硝酸还原成氮(N2)，其脱氮作用过程为：NO3-→NO2-→N2↑。反硝化细菌多为异养型细菌，异养反硝化细菌可以以有机物为碳源，硝态氮为能源进行反硝化作用，其生化过程为：5CH3COOH+8NO3—→6H2O+10CO2↑+4N2↑+8OH—+能量。碳源浓度的高低影响着反硝化作用的进程。碳氮比为1.5时，碳源相对不足，硝态氮浓度相对较高，硝态氮脱除效率为77.44％。碳氮比为2.0时，碳源浓度适宜，此时硝态氮脱除效率达到96.00％，碳氮比为2.5时，碳源较为充足，硝态氮脱除效率达97.21％。
表4 FX-1处理金属表面处理水不同碳氮比亚硝态氮浓度及去除率
如表4所示，菌种添加量为10％，FX-1对金属表面处理水处理16h时，碳氮比为1.5，碳源相对不足时，NO3-→NO2-过程正常进行，而NO2-→N2受到抑制，反硝化过程中的中间产物NO2-的积累，从而使得亚硝态氮浓度增加。当碳氮比为2.0和2.5时，碳源相对充足时，NO3-→NO2-与NO2-→N2过程同步进行，亚硝态氮浓度较低分别为0.03mg/L和0.04mg/L，脱除效率为95.77％和94.37％。
表5 FX-1处理金属表面处理水不同碳氮比氨氮浓度及去除率
如表5所示，原水样中氨氮浓度为9.80mg/L，浓度较低。菌种添加量为10％，FX-1对金属表面处理水处理16h，碳氮比分别为1.5，2.0，2.5时对金属表面处理废水处理后的氨氮浓度分别为：2.15mg/L，1.53mg/L，1.68mg/L。氨氮去除率分别为：78.06％，84.38％，82.85％。结果表明，好氧环境下，FX-1菌具有异养硝化好氧反硝化作用。
表6 FX-1处理金属表面处理水不同碳氮比总氮浓度及去除率
如表6所示，原水样中总氮浓度为130.10mg/L，以硝态氮为主，含有少量氨氮及亚硝态氮，几乎不含有机氮。菌种添加量为10％，FX-1对金属表面处理废水处理16h时，碳氮比为1.5，2.0，2.5处理后的总氮浓度分别为：30.25mg/L，7.24mg/L，6.08mg/L。总氮去除率分别为：76.75％，94.44％，95.32％。体系中碳氮比越高，总氮去除效率越高，与硝态氮去除率相同。从成本节约的角度，碳氮比为2:0时为最优。
表7 FX-1处理金属表面处理水不同碳氮比COD浓度及去除率
如表7所示，菌种添加量为10％，FX-1对金属表面处理废水处理16h，碳氮比为1.5，2.0，2.5处理后的COD(化学需氧量)浓度分别为：80.4mg/L，43.5mg/L，67.2mg/L。COD去除分别为：83.96％，93.11％，92.77％。碳氮比为1.5与2.0的体系中大部分碳源消耗完全，微生物利用率高。碳氮比为2.5的体系中较2.0体系中利用率降低，表明所投加的碳源量略高，优选碳氮比为2.0为最佳碳氮比。
实施例6
对实施例1获得的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1菌的不同添加量的含氮化合物降解能力进行测定。具体步骤如下：
步骤1)、取实施例1获得的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1菌液，分别取2.4mL、4.8mL、8.0mL、12mL和16mL的菌液，于4000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1；
步骤2)、将0mL、2.4mL、4.8mL、8.0mL、12mL和16mL的菌液的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-菌体1分别加入编号为1、2、3、4、5、6的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为118.98mg/L的金属表面处理水和对应的三水合乙酸钠(配成碳氮比为2.0:1)至总体积均为80mL，编号1(对照)、2中的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)FX-1原菌液的菌浓在8.1X107～6.4X108cell/mL，体积分数分别为0、3％、6％、10％、15％和20％；
步骤3)、将步骤2)中的测量系统置于摇床中，于30℃下，160转/分钟培养16h，测得16h处理后的硝态氮、亚硝态氮、氨氮、总氮、COD及pH，并计算处理后的金属表面处理水的硝态氮、氨氮、总氮、COD的去除率。
结果详见表8，表9，表10，表11，表12和图4。
表8 FX-1处理金属表面处理水不同添加量硝态氮浓度及去除率
如表8所示，碳氮比为2.0，以体积比分别投加菌液3％、6％、10％、15％和20％对金属表面处理废水处理16h。结果表明，当菌株添加量为3％-6％时，菌株投加量越大，硝态氮脱除效率越高；当菌株添加量为10％时，FX-1菌脱氮效率最高为96.00％，此时硝态氮浓度为4.76mg/L；当菌株添加量为15％-20％时，体系中碳源或氮源缺乏，部分菌体死亡，部分硝态氮的释放，硝态氮浓度略升高。
表9 FX-1处理金属表面处理水不同添加量亚硝态氮浓度及去除率
如表9所示，原水中亚硝态氮存在部分降解，处理16h空白组对亚硝态氮的去除率有8.45％。当菌体添加量为3％-6％时，体系中碳源相对充足，随着菌株添加量的增大，亚硝态氮浓度逐渐降低；当添加量为10％时，亚硝态氮浓度最低为0.21mg/L；当添加量为15％-20％时，亚硝态氮的浓度逐渐上升，说明菌体量越多，会产生更多的代谢产物，增加水中亚硝态氮的浓度。
表10 FX-1处理金属表面处理水不同添加量氨氮浓度及去除率
如表10所示，碳氮比为2.0，以体积比分别投加菌液3％、6％、10％、15％和20％对金属表面处理废水处理16h。当添加量为3％-6％时，添加量越大，氨氮浓度越低；当添加量为10％时，氨氮浓度降至最低为1.84mg/L，说明在好氧条件下，FX-1菌体有异养硝化好氧反硝化作用；当添加量为15％-20％时，氨氮浓度逐渐升高，菌体投加量越多，会产生更多的代谢产物，增加水中氨氮的浓度。
表11 FX-1处理金属表面处理水不同添加量总氮浓度及去除率
如表11所示，碳氮比为2，按体积比分别投加菌体3％、6％、10％对金属表面处理废水处理16h。当添加量为3％-6％时，添加量越大，总氮浓度越低；当添加量为10％时，总氮脱除效率最高，此时总氮浓度降至最低为7.03mg/L；当添加量为15％-20％时，总氮脱除效率稍微降低，体系中总氮浓度稍微升高，但仍达到排放标准要求。
表12 FX-1处理金属表面处理水不同添加量COD浓度及去除率
如表12所示，以碳氮比为2，按体积比分别投加菌液3％、6％、10％、15％、20％对金属表面处理废水处理16h。当投加量为3％-6％时，添加量越大，碳源消耗越大，COD浓度越低。此时菌种投加量太低，既不能够完全消耗碳源也无法有效去除体系中的氮；当投加量10％时，菌种对体系中COD利用完全，体系中碳源有效利用处理后水中的总氮浓度可以降低至标准以下。当投加量为15％-20％，投加的碳源过多，引起水中COD过高。因此以投加量10％为宜。
上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市长隆科技有限公司
<120> 一种巴利阿里假单胞菌FX-1及其应用
<130> PJ1810167.06
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 808
<212> DNA
<213> Pseudomonas balearica
<400> 1
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