本发明涉及微生物和连作障碍修复领域，具体涉及一种瓜类作物根际自毒物质降解菌及其应用。
背景技术：
瓜类作物作物是我国设施农业的重要经济作物，保护地周而复始的种植条件导致土壤理化性质发生很大变化，生产性能下降，土壤中的病原微生物含量逐年积累，产生了严重的连作障碍。大量研究发现瓜类作物的自毒作用是产生连作障碍的重要原因，连续种植导致土壤生态环境发生改变，植物病残体及根系分泌物与病原微生物的代谢物对植物生长具有毒害作用，影响种子萌发、植株生长、细胞分裂、病原菌活性和土壤微生物结构，从而引发自毒作用，导致连作障碍的产生。
大量研究表明通过添加有益微生物或拮抗菌等手段可以有效的防治由自毒作用和根系土传病害等引起的连作障碍的发生。植物内生菌存活于植物各个组织和器官内部，却不使宿主植物表现出明显的感染症状，并对植株自毒物质具有降解作用的微生物种群，通过从植株体内分离，筛选和接种有益微生物来分解连作土壤中存在的有害物质、克服自毒作用，同时提高植株的抗逆能力，并与有害菌竞争营养和生存空间，降低土壤病原菌的数量及其对根系的侵染能力，从而降低土传病害发病率，解决实际生产中的连作障碍问题。
目前应用于瓜类作物连作障碍和自毒作用治理的益生菌比较少，大多采用杀菌剂和化肥进行土壤治理，导致土壤板结酸化、养分失衡、次生盐渍化等问题，缺乏安全有效的生物菌治理严重制约了瓜类作物连作障碍的治理和可持续发展，已成为瓜类作物农业生产亟需解决的瓶颈问题之一。
以下是申请人检索的与本申请相关的参考文献
1.程莹，白寿发，庄敬华等.2011.甜瓜残茬腐解物对镰孢枯萎病的助长作用.中国农学通报,27(8):217-221.
2.李勇,龙期良,丁万隆等.2014.微生物降解对人参自毒作用的缓解效应.中国中药杂志,39(15):2868-2872.
3.赵亚慧，袁云云，杜海岩等.2015.花生化感物质降解菌发酵参数的优化.花生学报，44(4)31-36.
4.刘昭军,王德国,李铁等.2007.野生大豆根际微生物的分离及其缓解大豆连作障碍的研究.26(2)176-180.
技术实现要素：
为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种瓜类作物根际自毒物质降解菌及其应用，用于降解瓜类作物根际的自毒物质，解决瓜类作物连作障碍问题，起到促进植株生长和降解自毒作用的目的。
本发明的另一个目的在于，提供一种降解瓜类作物自毒作用的微生物菌剂的制备方法，由一种瓜类作物内生细菌栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)和矿质营养元素通过优化配比混合而成，其目的是降解瓜类作物自毒物质，增强植株的抗逆能力，降低自毒物质的产生及危害。
本发明的目的是通过以下技术解决方案实现的：一种瓜类作物根际自毒物质降解菌及其应用，其技术要点是：
一种瓜类作物根际自毒物质降解菌：该菌株的分类命名为栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15325，保藏日期为2018年01月29日。
该菌株的菌落及菌体特征为：该自毒物质降解菌在NA培养基(酵母浸粉1g；牛肉膏3g；蛋白胨5g；蔗糖10g；琼脂18g；蒸馏水1000ml；121℃灭菌30min)上培养48h后菌落光滑的或皱纹的，边缘整齐或不规则，平凸，淡黄色，30℃培养2d后菌落直径2mm，菌体杆状，鞭毛运动，不产芽孢，革兰氏染色阴性。
该菌株生理生化特征为：氧化酶试验阴性、接触酶试验阳性、甲基红试验阴性、淀粉水解试验阴性、明胶水解试验阴性、硝酸盐还原试验阳性、H2S试验阴性、丙二酸盐利用试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、葡萄糖利用试验阳性、乳糖利用试验阴性、半乳糖利用试验阳性、麦芽糖利用实验阳性。
栖稻假单胞菌菌株的最适宜培养基为LB培养基，配方包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L，接种量为培养基重量的2％，发酵温度为28℃，搅拌速度为120rpm，发酵时间为5天。
该菌剂可用于制备微生物菌剂；菌液的浓度为2.0-3.0×108cfu/ml。
菌剂的使用方法：在瓜类作物的移栽期采用穴施和灌根的施用方法，每颗苗菌剂用量为250ml。
作为实施例的优选方式，所述微生物菌剂加入矿质营养元素，包括磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸钙、钼酸、硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸锌，有效成分为：
本发明的有益效果：该微生物菌剂在田间应用时其根际定殖能力好并且安全可靠，并且对间作作物(茼蒿、油菜等蔬菜)均无致病侵染能力对瓜类作物根系分泌物中的自毒物质具有良好的降解作用，促进了瓜类作物植株的抗逆能力，提高瓜类作物的产量和果实品质；制备方法简单，配方合理，功效稳定对缓解瓜类作物的自毒作用效果明显。
具体实施方式
1.材料和方法
1.1用于分离栖稻假单胞菌的培养基为无机盐培养基，配方包括MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl2·2H2O 0.02g/L，FeCl3 0.05g/L，KH2PO4 1.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，NH4NO31.0g/L，胆固醇0.3g/L，琼脂17g/L分别以处理浓度为200μg·mL-1的对羟基苯甲酸、苯甲酸和肉桂酸作为唯一碳源，调PH值至中性。
1.2用于分离栖稻假单胞菌的方法：取甜瓜根茎交界处流水冲洗后剪成小段，75％酒精浸泡1min，0.1％升汞30s，再使用无菌水漂洗4次，在无菌的研钵中研磨成浆，研磨液稀释3倍后涂布于无机盐培养基中，28℃温箱中培养48h，得到栖稻假单胞菌菌株。
栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌株编号：20180101H16，保藏编号为CGMCC No.15325，保藏日期为2018年01月29日。
1.3制备栖稻假单胞菌菌剂：用于培养栖稻假单胞菌菌株的适宜培养基和LB培养基，配方包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L，接种量为培养基重量的2％，发酵温度为28℃，搅拌速度为120rpm，发酵时间为5天，得到菌悬液。
1.4降解瓜类作物连作障碍的微生物菌剂的制备及应用：将所得栖稻假单胞菌菌悬液(浓度为2.0-3.0×108cfu/ml)加入矿质营养元素，包括磷酸二氢钾100-150mg/L、硫酸镁200-500mg/L、硫酸钙500-900mg/L、钼酸0.5-1.0mg/L、硫酸锰15-30mg/L、硫酸亚铁3-5mg/L、硫酸锌5-10mg/L。100g甜瓜连作土与微生物菌剂50ml混合，25℃保湿条件下培养30天；100g连作土与50ml无菌水混合作空白对照；每个处理三次重复。
1.5微生物菌剂对土壤中的酚酸物质的降解作用检测方法：
(1)取25g的供试土壤置于75mL的离心管中，向土壤中添加25mL的1mol·L-1的NaOH溶液，用漩涡震荡仪混匀后静置24h，次日经翻转摇匀仪混匀1h，超声波振荡器震荡30min，离心后分离上清液，采用12mol·L-1的盐酸调整土壤溶液pH值到2.5，静置2h后离心除去胡敏酸，分离上清液4℃保存准备分析测定。
(2)酚酸类物质HPLC分离和鉴定
标准溶液的配制：准确称量10mg对羟基苯甲酸、香草醛、丁香酸、香兰素、香豆酸、邻苯二甲酸二丁酯、苯甲酸、肉桂酸(由上海sigma生物科技有限公司提供)分别置入100mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至100mL，则该标准溶液每种酚酸的浓度100μg·mL-1。
(3)色谱条件：土壤中不同种类的酚酸的测定采用HPLC法(Agilent LC 1100，美国)。样品进样前必须经过用0.22μm的微孔滤膜过滤去除溶液中存在的杂质，色谱分离柱为SB-C18(Agilent 4.6mm×250mm)，设流速1mL·min-1，柱温25℃,样品检测波长280nm，每次进样量均为20μL，流动相A：甲醇(色谱级)和流动相B：pH＝2.8的乙酸水溶液(色谱级)，样品分离通过梯度洗脱的方法达到分离和缩短酚酸类物质保留时间的目的。洗脱条件B：70％(0min)→50％(15min)→30％(16min)→0％(30min)→end(30min)。采用保留时间进行定性，采用峰面积外标法进行定量。
(4)数据处理及统计分析
每试验重复3次，使用spss 17.0对数据进行统计分析，各处理间显著性差异分析使用Duncan法进行分析。
土壤中酚酸类物质含量R(mg·kg-1)的计算公式如下：R(mg·kg-1)＝
S样×V样×C标/S样×m(R-样品中某物质酚酸含量；S样-样品峰面积；V样-样品定容体积，mL；C标-标准溶液浓度，mg·L-1；S标-标准溶液峰面积；m-样品重量，g。)
降解率的计算公式：降解率＝对照组酚酸含量-处理组酚酸含量/对照组酚酸含量×100
1.6微生物菌剂防治甜瓜枯萎病的田间试验
供试甜瓜品种：特大超早糖王(黑龙江景丰高新技术开发有限公司)。
试验地点：沈阳农业大学试验基地。
甜瓜种植前一个月进行整地施肥，3-4月进行定植，定植穴施深15厘米，瓜苗入坑后使瓜土坨上距畦面2-3厘米，周围用细土围好，定植水中加入，微生物菌剂灌根处理，菌液的浓度为2.0-3.0×108cfu/ml。
设不采用微生物菌剂灌根处理为对照，第一茬、第二茬甜瓜开花结果期调查枯萎病发病情况，采收期调查产量，即待田间甜瓜坐果成熟后，对各个处理条件下的甜瓜果实进行称重并记录数据，计算不同处理条件下的甜瓜产量。
发病率(％)＝发病总株数/总株数×100
病情指数(％)＝∑(各级病株数×各级代表值)/调查总株数×最高级代表值×100
2结果与分析
微生物菌剂对甜瓜连作土壤中的酚酸物质的降解作用结果表明，该菌剂对甜瓜分泌物中的主要酚酸具有优异的降解作用，其中对肉桂酸的降解最佳(见表1)。
表1微生物菌剂对甜瓜连作土壤中的酚酸物质的降解作用
大田试验研究结果表明(表2)，外源施加微生物菌剂可利于增强植株的生长和产量的提高，可利于增强植株的生长和产量的提高，降低甜瓜枯萎病的发生。
表2微生物菌剂对甜瓜株高、产量和发病率的作用