本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一株能用于果汁降酸的发酵乳杆菌及其应用。
背景技术：
橙汁中的糖、酸含量及其糖酸比是决定橙汁风味、品质的重要指标。橙汁甜酸适口的糖酸比大约为10:1-15:1。与国外橙汁相比，我国橙汁普遍存在酸度过高的问题，严重影响了其市场竞争力，限制了我国橙汁工业的发展。目前，国内外主要采用物理降酸、化学降酸和生物降酸法达到降低水果中总可滴定酸的目的。其中物理降酸又称低温冷冻降酸，主要原理是随着温度的降低，酒石酸及其盐类结晶沉淀。该法的优点是不引入其他物质，操作简便，尤其适于冬季生产。缺点是仅能降低酒石酸盐的含量且降酸幅度较小，不适于其它有机酸去除，应用对象比较有限，常用于酸度较高的葡萄酒生产。化学降酸法主要有中和法(向果汁体系加入碱或碱式盐)、离子交换树脂和电渗析法等，但化学降酸很容易导致橙汁营养品质和风味损失，并且离子交换树脂和电渗析法等降酸过程中设备投资和运行成本较高。生物降酸是利用微生物的生长代谢分解有机酸，从而达到降酸的目的，微生物降酸不仅能使总酸下降，而且能改进果汁果酒体系的风味，成为现代降酸主要的研究和发展方向。但目前常用的降酸乳酸菌株主要作用于苹果酸，对柠檬酸和酒石酸的降酸效果较差，对大多数以柠檬酸为主的橙汁中不能发挥作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一株发酵乳杆菌，Lactobacillus fermentum L3。
本发明的另一个目的在于提供上述菌株在降酸发酵中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
一株发酵乳杆菌，其分类命名为(Lactobacillus fermentum)L3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：60317。
上述发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum L3在果汁降酸发酵中的应用。
进一步的，所述的果汁为橙汁。
发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum L3在降解柠檬酸和/或苹果酸中的应用。
一种降解柠檬酸和/或苹果酸的菌剂，该菌剂中含有发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum L3。
一种果汁降酸的发酵方法，该方法包括以下步骤：将果汁中接种发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum L3，在28～32℃下发酵5.5～8h。
进一步的，所述果汁为橙汁。
进一步的，发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum L3的接种量为105～105.5CFU/mL。
本发明发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum L3于2018年1月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏中心于2018年1月24日收到申请人提供的菌株。保藏中心给予该培养物的保藏号为GDMCC No：60317，提议的分类学名称为Lactobacillus fermentum，已于2018年1月26日鉴定保藏的菌株是存活的。
本发明的有益效果是：
(1)与其它乳酸菌株不同的是，在柠檬酸或/和苹果酸存在的情况下，本发明菌株Lactobacillus fermentum L3对橙汁中转化糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)的转化利用较弱，不会将橙汁中的糖分转化生成乳酸或乙酸。
(2)本发明菌株Lactobacillus fermentum L3能很好地利用橙汁中的柠檬酸(三羧酸)和苹果酸(二羧酸)，使果汁中的可滴定酸含量下降50％以上，并且果汁中可转化糖的总含量不会出现明显的下降。
(3)与其它乳酸菌株不同的是，本发明菌株应用于降酸发酵时，发酵时间较短，只有6-8小时，发酵过程中几乎没有双乙酰和3-羟基丁酮等异味成分产生，能很好的保留果汁的营养成分和风味。
附图说明
图1为菌株Lactobacillus fermentum L3发酵橙汁期间活菌数的变化；
图2菌株Lactobacillus fermentum L3发酵橙汁期间果汁中有机酸的变化；
图3橙汁经菌株Lactobacillus fermentum L3发酵前后感官风味的变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一、降酸菌株Lactobacillus fermentum L3的分离和富集
1)将7-8成熟的刚从广东地区青梅树上采摘的新鲜青梅放入带盖的玻璃腌菜罐中，加入等质量的水和十分之一质量的蔗糖，盖好腌菜罐盖，水封，室温(20-28℃)发酵一个月，将培养液进行梯度稀释，涂布于MRS培养基固体平板上，在30℃培养箱中培养。
2)挑取单菌落，并涂布于新的MRS培养基上，进一步分离和纯化菌体。
3)重复步聚2)，直到获得单克隆菌落。
二、降酸菌株Lactobacillus fermentum L3的筛选
筛选培养基的配制：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏2g/L，氯化钠5g/L和柠檬酸10g/L，蔗糖5g/L，用碳酸钠条件培养液的pH到3.0，蒸馏水定溶后沸水浴保持10min灭菌后待用。
将上述单菌落挑取一个到50ml上述灭菌的培养液中，30℃培养箱中静置培养。培养3d后采用pH检测培养液的pH值是否升高到3.5以上。pH高于3.5的菌株能初步判断为具有降解柠檬酸的菌株。进一步需要采用HPLC分析培养液中有机酸(柠檬酸、乳酸、乙酸)的变化以进一步确认。
筛选出的经确认具有降解柠檬酸的菌株用40％的甘油保存于-70℃超低温冰箱中。
三、降酸菌株Lactobacillus fermentum L3的分子生物学鉴定
采用Bacterial DNAout kit(TIANDZ,China)提取上述筛选出的细菌基因组DNA，利用16S rDNA的通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO:1)和1495R：5'-CTACGGCTACCTTGT TACGA-3'(SEQ ID NO:2)进行PCR扩增，扩增出16S rDNA基因片段。PCR产物委托上海生工公司测序，利用Blast程序搜索同源序列，结果与登录号为MG437394，MG437392和MG437360等序列菌株的同源性为99.9％，因此，结合菌落形态和生理生化特征，该菌株鉴定为Lactobacillus fermentum，命名为Lactobacillus fermentum L3。
四、菌株Lactobacillus fermentum L3对橙汁的发酵降酸
方法：向鲜榨的或热巴氏杀菌(85℃，30s)橙汁中接种菌株Lactobacillus fermentum L3，接种量为5.0-5.5Log CFU/mL。接种后的橙汁在28-32℃下静置发酵，发酵6-8h后热巴氏杀菌(105-110℃，10-20s)，进行无菌灌装即可。
结果与讨论：
橙汁非常适合降酸菌株Lactobacillus fermentum L3生长(图1)，6h发酵后，果汁中的柠檬酸(约7.5g/L)全部被代谢利用，苹果酸也被大量消耗(发酵8h后几乎全部被代谢利用)；发酵6h后，产生少量的乙酸(约2g/L)和乳酸(约1.5g/L)(图2)。发酵6h后，柠檬酸代谢完毕，糖代谢开始活跃，乳酸和乙酸生成率开始增加。发酵的前6h，果汁中的可转化糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)含量没有显著变化(P>0.05)。发酵6h后果汁中的总可滴定酸下降了50％，果汁的糖酸比从12：1提高到了22：1(表1)。果汁发酵6h后，果汁中的甜度、酸度、异味值和总体接受性均优于未发酵的产品，发酵过程中几乎没有双乙酰和3-羟基丁酮等异味成分产生，能很好的保留橙汁的营养成分和风味，说明本发明发酵乳杆菌轻微发酵不会改变果汁的感官品质(图3)。与未发酵的果汁相比，发酵乳杆菌轻微发酵6h后果汁中的总酚、总黄酮、色泽和Vc等指标均没有显著减少，仅仅ORAC值表现轻微下降，可能跟某些强抗氧化性物质被乳酸菌利用或代谢有关(表1)。
表1橙汁经菌株L3发酵前后(发酵6小时)主要营养指标的变化
上述结果说明本发明乳酸菌株Lactobacillus fermentum L3与其它乳酸菌株不同的是，在柠檬酸或/和苹果酸存在的情况下，该菌株对发酵液(如橙汁等果汁)中转化糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)的转化利用较弱，不会将发酵液(如橙汁等果汁)中的糖分转化生成乳酸或乙酸。可使发酵液(如橙汁等果汁)中的可滴定酸含量能下降50％以上，并且发酵液(如橙汁等果汁)中可转化糖的总含量不会出现明显的下降(糖酸比显著提高)，同时能较好的保留水果本身的营养成分和感官风味。本发明菌株应用于发酵液(如橙汁等果汁)降酸具有成本低、效果好等优点，应用前景较好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所
<120> 一种降酸发酵乳杆菌及其应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggctca 19
<210> 2
<211> 20
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<213> 人工序列
<400> 2
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