本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种高效nk细胞培养方法。
背景技术：
：自然杀伤细胞(naturalkillercell,nk)是机体重要的免疫细胞，主要分布于外周血中，占pbmc的5％-10％，淋巴结和骨髓中也有nk活性，但水平较外周血低。nk细胞是一群异质性、多功能的免疫细胞，是人类的众多免疫细胞中的一种，表现为自然细胞毒活性的杀伤细胞。主要作用消灭攻击人类身体的病毒、细菌、癌细胞等。发挥作用的方式分为：直接杀伤、释放穿孔素、nk细胞毒因子和tnf等。每个人的身体里至少有50亿个nk细胞，多则达到1000亿个。但nk细胞的数量和其活动力不是成正比的。即使nk细胞显示有足够的数量，但是不激活他们，他们的工作效率也是非常低的。目前，国内外已经有大量的研究者进行了人nk细胞的培养和生物治疗方面的研究，但多数研究都是单纯利用il-2和il-12等白介素类细胞因子去培养，但是这样获得的结果往往有两个弊端，要么是数量上不去，达不到治疗性回输所需的量，要么是纯度上不去，达不到应有的效果。因为白介素类细胞因子都不是强烈的nk细胞活化剂，缺乏强有力的活化作用。但是，当nk细胞被充分活化后，白介素类细胞因子对nk细胞的活性维持和增殖发挥了极为重要的作用。因此，获得高数量高纯度的nk细胞，首先需要充分活化nk细胞。技术实现要素：本发明为解决现有技术中的上述问题提供一种区别于传统培养法的人nk细胞的培养方法，使之简单易行。本发明中培养获得的人nk细胞被活化，nk细胞分泌的il2、il12和ifn-γ的表达水平更高，细胞纯度高，生长良好，细胞增殖更快，且细胞得率和存活率均大大提高。为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术措施为：一种高效nk细胞培养方法，包括以下步骤：步骤1：用pbs稀释单克隆抗体cd16和cd2获得抗体稀释液，然后用抗体稀释液过夜包被细胞培养容器；步骤2：分离单个核细胞；步骤3：将步骤2获得的单个核细胞接种到培养容器中，从接种时间开始计时，每隔3天更换新鲜的细胞培养基，培养18天后收集细胞；所述的细胞培养基中含有乙酰化α葡聚糖。为了优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：优选地，上述的乙酰化α葡聚糖浓度为5-15mg/ml。优选地，上述的细胞培养基，还含有10％knockout血清替代品和500u/ml的il-2。优选地，上述的10％knockout血清替代品还可以替换成人血小板裂解物。优选地，上述的细胞培养基为cellgroscgm或rpmi-1640培养基。优选地，上述的培养容器为细胞培养瓶或细胞培养板，更优选为t75细胞培养瓶。优选地，上述步骤2的接种细胞密度为2×106/ml。另一方面，本发明还提供根据上述的细胞培养方法培养得到的nk细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：(1)传统的方法nk细胞扩增慢，数量很难满足临床需求，而利用本发明的培养方法分离培养的nk细胞的数量足，扩增快，一般外周血培养15天，能够达到70亿个细胞；(2)传统的方法nk细胞活性低，nk细胞的数量和其活性不成正比，而本发明通过培养基中添加乙酰化α葡聚糖作为激活调动剂，成功激活了nk细胞，促使其分泌il2、il12和ifn-γ，而il2、il12和ifn-γ在nk细胞活化后维持其活性和扩增速率起到关键的作用，使其更具有临床应用价值；(3)与传统方法相比，本发明方法获得nk细胞的纯度高，对流式细胞仪检测结果进行分析，发现cd3-cd56+的nk细胞数达到80％以上。附图说明图1为实施例一中分离培养的nk传代细胞的显微镜图(10x)；图2为实施例一中分离培养的nk传代细胞的显微镜图(20x)；具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。实施例11.本方法与常规方法的细胞扩增倍数的比较本实施例中实验组分离培养nk细胞的细胞培养方法，具体步骤如下：步骤1.取肝素抗凝的静脉血60ml，分2支取单个核细胞(pbmc)。具体步骤如下：向50ml离心管中加入15ml淋巴细胞分离液，再贴着管壁，缓慢加入30ml静脉血，避免破坏淋巴细胞分离液的水相。400g，离心20分钟。将上层血浆小心吸出至新的50ml离心管中，56℃加热25分钟，充分灭活补体，待用。将中间层的白膜层，即单个核细胞层吸出至新的15ml离心管中，用0.01m的pbs充分洗涤3次，洗涤时，200g离心5分钟，弃上清，所得即为pbmc。步骤2.将离心所得的pbmc用上述培养基重悬，即：用含10％knockout血清替代品和乙酰化α葡聚糖的1640培养基重悬，细胞密度调整为2×106/ml，将细胞重悬液转移到t75培养瓶中，每3天更换新的培养基，并利用显微镜观察细胞形态(如附图1-2)。本实施例实验对象分为实验组和常规组两组。其中，常规组按传统的技术培养。分别在第0、6、12及18天从两组取培养细胞，用台盼蓝染色后计数，将计数当天的细胞总数除以培养前的细胞数(即第0天)，数值即为细胞的扩增倍数。以此方法可以动态比较两组细胞的扩增情况，结果如表1所示：在培养的第6、12、18天，本法的细胞扩增倍数均显著高于常规组，p<0.05。培养天数(天)061218常规组111.58±2.2742.59±4.0979.25±5.78实验组122.28±4.3471.43±4.56150.05±5.54表1本方法与常规方法的细胞扩增倍数的比较由表1可以分析得出，传统的方法培养nk细胞，成本高，工艺复杂，效果不理想，并且细胞扩增慢，数量很难满足临床需求，而利用本发明的培养方法工艺相对简单，分离培养的nk细胞的数量足，扩增快，能够满足临床需求。实施例21.本方法与常规方法的细胞纯度的比较本实施例实验对象分为实验组和常规组两组。其中，实验组按实施例1中的细胞培养方法培养nk细胞。常规组按传统的技术培养。在第18天分别从两组培养体系取细胞培养液，pbs洗涤两次，洗涤后调整细胞浓度为2x105/ml，加入流式抗体，4c避光30min，洗掉多余抗体，pbs重悬后，对细胞表型进行流式检测。所用抗体来自美国bd公司，结果如表2所示，常规组的cd3-cd56+的nk细胞占50.16±1.02％，本方法的cd3-cd56+的nk细胞占82.86±1.83％，两组有显著性差异(p＜0.05)。组别cd3-cd56+常规组49.16±1.02％实验组79.86±1.91％表2本方法与常规方法的细胞纯度的比较由表2可以分析得出，传统方法获得的nk细胞的纯度低，很大程度上限制了nk细胞的应用，而本发明方法获得nk细胞的纯度高，通过流式细胞仪的检测，cd3-cd56+的nk细胞数达到80％以上，纯度达到了临床应用的要求，对其临床上的应用有着重要的指导意义。实施例31.本方法与常规方法的细胞分泌的il2、il12、ifn-γ的分泌水平比较本实施例实验对象分为实验组和常规组两组。其中，实验组按实施例1中的细胞培养方法培养nk细胞。常规组按传统的技术培养。在第18天分别从两组培养体系取100毫升细胞培养液，用常规方法浓缩之后，用试剂盒检测其中的il2、il12、ifn-γ含量，所有试剂盒购买自武汉博士德生物工程有限公司。实验结果如表3所示，实验组细胞分泌的il2、il12、ifn-γ含量显著高于常规组含量(单位μg/ml)。组别il2il12ifn-γ常规组10±1.417±1.824±2.2实验组20±1.731±0.939±1.8表3本方法与常规方法的细胞分泌的il2、il12、ifn-γ的分泌水平比较由表3可以分析得出，与传统方法相比，本发明通过培养基中添加乙酰化α葡聚糖作为激活调动剂，成功激活了nk细胞，促使其分泌il2、il12和ifn-γ，而il2、il12和ifn-γ在nk细胞活化后维持其活性和扩增速率起到关键的作用，使其更具有临床应用价值。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。当前第1页12