本发明属微生物动物细胞系技术领域，涉及卵巢透明细胞癌细胞系，具体涉及一种中国人卵巢透明细胞癌细胞系fdov1及其建立方法。
背景技术：
现有技术公开了卵巢癌是恶性程度最高的妇科恶性肿瘤。卵巢透明细胞癌(ovarianclearcellcarcinoma，occc)，是第二大常见组织学亚型，尤见于亚洲女性，目前已发表的研究结果多来自日本。国内有研究发表了一系列文章，其中较全面分析了我国患者的特点，提示卵巢透明细胞癌有特殊的临床病理特点和生物学行为，如，恶性程度高、预后差，传统化疗不敏感，复发后缺少有效的治疗手段等等，因此，进一步探索卵巢透明细胞癌的生物学行为和分子机制在临床研究与实践中显得尤为重要。
业内知晓，人肿瘤细胞系的建立和鉴定，对肿瘤生物学行为及分子机制的研究尤为重要。据知，目前美国标准生物品收藏中心(atcc)仅存有2株人卵巢透明细胞癌细胞系(es-2、tov-21g)，而我国国家实验细胞资源共享平台仅存有1株(es-2)。2016年发表的文献公开了迄今为止建立和鉴定的人卵巢透明细胞癌细胞系：1987年至2016年间共有14株，仅有1株来自中国香港，而其他细胞株均为日本学者建立。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟建立和鉴定我国患者来源的卵巢透明细胞癌细胞系，具体涉及一种中国人卵巢透明细胞癌细胞系fdov1及其建立方法。
于本发明相关的现有技术以及参考文献有，
1.chenw,zhengr,baadepd,zhangs,zengh,brayf,etal.cancerstatisticsinchina,2015.cacancerjclin.2016；66:115-32.
2.sungpl,changyh,chaokc,chuangcm.globaldistributionpatternofhistologicalsubtypesofepithelialovariancancer:adatabaseanalysisandsystematicreview.gynecoloncol.2014；133:147-54.
3.okamotoa,glasspoolrm,mabuchis,matsumuran,nomurah,itamochih,etal.gynecologiccancerintergroup(gcig)consensusreviewforclearcellcarcinomaoftheovary.intjgynecolcancer.2014；24:s20-5.
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5.yes,youy,yangj,caod,baih,huangh,etal.comparisonofpureandmixed-typeclearcellcarcinomaoftheovary:aclinicopathologicalanalysisof341chinesepatients.intjgynecolcancer.2014；24:1590-6.
6.yes,yangj,caod,baih,huangh,wum,etal.characteristicandprognosticimplicationofvenousthromboembolisminovarianclearcellcarcinoma:a12-yearretrospectivestudy.plosone.2015；10:e0121818.7.yes,yangj,youy,caod,huangh,wum,etal.comparisonofclinicalcharacteristicandprognosisbetweenovarianclearcellcarcinomaandserouscarcinoma:a10-yearcohortstudyofchinesepatients.plosone.2015；10:e0133498.
8.yamadat,hattorik,satomih,okazakit,morih,hirosey.establishmentandcharacterizationofacellline(hch-1)originatingfromahumanclearcellcarcinomaoftheovary.jovarianres.2016；9:32.。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种卵巢透明细胞癌细胞系，具体涉及一种中国人卵巢透明细胞癌细胞系fdov1及其建立方法。
本发明建立了一种来源于中国患者的卵巢透明细胞癌细胞系，该细胞系可稳定传代，成瘤性好，能适用于建立动物模型。该细胞系可用于卵巢透明细胞癌的发生发展及转移机制，耐药原理及新药筛选等的研究。
本发明提供的一种中国人卵巢透明细胞癌细胞系，命名为人卵巢透明细胞癌细胞株fdov1，已于2017年3月16日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.13812。
本发明的中国人卵巢透明细胞癌细胞系通过下述方法制得，
(一)取材
获得离体新鲜的卵巢肿瘤切除标本，病灶组织浸入无菌pbs溶液清洗；
(二)原代培养
选取较硬的肿瘤组织，将其切成米粒大小的组织数块，均匀的接种于10cm大皿中，静置培养，每4天半量换液1次，约1周后细胞从组织块长出；
(三)细胞纯化
接种约2周后传第1代，用0.25％胰蛋白酶消化，将细胞悬液接种于培养皿中，静置约15～20分钟后于倒置相差显微镜下观察，见部分细胞贴壁，吸取细胞悬液入另一培养瓶中继续培养；按上述方法，重复2次传代，使肿瘤细胞与成纤维细胞完全分开；
(四)传代培养
当细胞布满瓶底时，吸除培养液，pbs缓冲液漂洗，0.25％胰蛋白酶消化，按1:2的比例传代，目前已传至50余代；
经生物学特性鉴定获得中国人卵巢透明细胞癌细胞系，命名为fdov1，保藏号为no.13812。
本发明中：体外常规培养条件为含10％fbs、1％双抗的medium199细胞培养基，培养温度为37℃，气体环境为5％co2/95％空气，湿度为饱和湿度。
本发明的细胞系fdov1具有以下生物学特性：
1.单层贴壁生长，失去接触抑制，形态不一，呈圆形椭圆形或纺锤形扁平状，或不规则形；
2.体外培养生长良好，每4天传代一次，能够连续稳定传代，目前已传至50余代；
3.染色体核型分析结果提示该细胞为近二倍体细胞系，存在复杂的易位,缺失等染色体畸变；
4.流式细胞周期检测提示：g1期细胞42.28％；g2期细胞36.10％；s期细胞21.62％。
5.肿瘤标志物检测：ca125:33.7u/ml；ca199:0.78u/ml；ca153:<1.00u/ml；ca724:2.96u/ml；afp:<0.61ng/ml；cea:0.21ng/ml；he4:<15nmol/l。
6.二代测序结果：fdov1及肿瘤组织同时检测到arid1afs突变及pik3cah1047r突变。
7.fdov1免疫细胞化学染色与临床肿瘤组织免疫化学染色结果一致，证实fdov1来源于肿瘤组织。
8.将第18代fdov1细胞按1*107数量级接种于nod/skid裸鼠，20天后移植瘤形成，病理切片提示移植瘤组织学特性与原发瘤相似。
本发明提供了一种中国人卵巢透明细胞癌细胞系fdov1，该细胞系形态稳定，可以稳定多次传代，可用于卵巢透明细胞癌生物学行为的研究；具有较强的致瘤性，可用于建立卵巢透明细胞癌动物模型，所制得的动物模型适用于卵巢透明细胞癌发生发展的分子机制研究，可进一步探究其对传统化疗药物的耐药机理并筛选有效的靶向药物，该细胞系是人卵巢透明细胞癌基础研究及临床前期应用的理想细胞系。
附图说明
图1.fdov1细胞形态学观察(倒置相差显微镜100×)。
图2.fdov1细胞生长曲线。
图3.fdov1染色体核型分析。
图4.流式细胞仪分析fdov1细胞周期。
图5.二代测序结果。a：fdov1及肿瘤组织单核苷酸变异(snv)结果分析；b：fdov1及肿瘤组织基因拷贝数变异(cnv)结果分析。
图6.fdov1细胞在nod/scid小鼠体内成瘤mri成像。
图7.fdov1细胞、临床肿瘤组织及移植瘤病理切片免疫化学分析。
具体实施方式
实施例1制备中国人卵巢透明细胞癌细胞系fdov1
(1)取材
2016年5月获得离体的新鲜的卵巢透明细胞癌手术切除标本(标本来源自复旦大学附属肿瘤医院卵巢透明细胞癌患者，女，67岁，病理诊断：左附件卵巢透明细胞癌)，取病灶组织1cm3浸入无菌pbs溶液清洗，并去除结缔组织和坏死组织；
(2)原代培养
将肿瘤组织剪成约1mm3大小的小块，将组织块均匀接种于10cm大皿中，静置培养，每4天半量换液1次，约1周后观察到细胞从组织块长出；
(3)细胞纯化
接种约2周后传第1代，用0.25％胰蛋白酶消化，离心后用无血清培养基重悬接种于一个培养皿中，静置15～20min，于倒置相差显微镜下观察，见部分细胞贴壁，小心吸取细胞悬液入另一培养瓶中继续培养。按上述方法传代处理2次，可使肿瘤细胞与成纤维细胞完全分开；
(4)传代培养
当细胞布满瓶底时，吸除原瓶中的旧培养液，用pbs缓冲液漂洗1～2遍，用0.25％胰蛋白酶消化，按1:2的比例传代，目前已传至50余代；制得中国人卵巢透明细胞癌细胞系，命名为人卵巢透明细胞癌细胞株fdov1，已于2017年3月16日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.13812。
本实验体外常规培养条件为含10％fbs、1％双抗的medium199细胞培养基，培养温度为37℃，气体环境为5％co2/95％空气，湿度为饱和湿度；
(5)生物学特性的鉴定
细胞形态：倒置相差显微镜下观察，fdov1细胞单层贴壁生长，失去接触抑制，形态不一，呈圆形椭圆形或纺锤形扁平状，或不规则形(如图1所示)；
细胞生长曲线：取对数生长期的细胞，调整细胞密度为每孔2*103/100ul，接种于96孔板，设6个复孔；接种后连续10天在同一时间加入100ulcck-8试剂与培养基1:9混合液反应2小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度(od)，以时间为横轴，od均值为纵轴绘制细胞生长曲线(如图2所示)；
染色体核型分析：取对数生长期细胞，用0.25μg/ml秋水仙素处理6小时，37℃过夜，采集分裂中期细胞，固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)固定，标本经胰蛋白酶消化处理后，用giemsa染液染色，于显微镜下观察计数，随机计数45个细胞，其中2n＝45/46有35个(78％)，2n＝47条有3个(7％)，4n＝86-90有6个(13％)，其它数目1个(2％)，染色体存在复杂的易位,缺失等染色体畸变，结果符合恶性肿瘤的遗传学特征(如图3所示)；
流式细胞周期检测：收集1*106细胞于15ml离心管中，预冷的pbs重悬两次后，离心弃上清。细胞沉淀用3ml－20℃75％乙醇重悬混匀，置－20℃过夜，离心，弃上清，加入500ulpi染色液，在暗处4℃孵育20min，流式细胞仪分析标本，用488mm激发光，600nm波长滤器检测pi荧光；结果表明：g1期细胞42.28％；g2期细胞36.10％；s期细胞21.62％(如图4所示)；
肿瘤标志物检测准备2*10^6个细胞(约2个25t培养瓶，每瓶约7ml培养)，培养48h后，收集上清，换液，48h后，再次收集上清，送检.ca125:33.7u/ml；ca199:0.78u/ml；ca153:<1.00u/ml；ca724:2.96u/ml；afp:<0.61ng/ml；cea:0.21ng/ml；he4:<15nmol/l；
二代测序基因谱分析：按qiagendna提取试剂盒内实验步骤对病人肿瘤组织、血及fdov1dna进行提取，经酶标仪检测dna浓度，凝胶电泳检查dna完整程度，利用covaris将gdna随机打断，用samplepurificationbeads进行纯化，产物的末端经过修补成平末端，接着用磁珠进行片段筛选，然后在3’末端加a，连接pcr反应接头，进行pcr扩增，然后与使用sureselectcapturelibrary在杂交缓冲液中进行杂交，使用dynal磁珠捕获杂交的目的片段并分离纯化，pcr扩增捕获的dna片段并纯化pcr产物，然后进行捕获文库的质检，包括琼脂糖凝胶电泳质检、qubit浓度测定和2100bioanalyzer片段长度测定，将待测dna文库浓度在cbot上完成clustergeneration，然后将flowcell转移到测序系统上，按照illumina的标准流程进行二代测序及cnv、snv数据分析(样本有效深度>250x,target区域捕获率约70％)，结果显示，fdov1及肿瘤组织同时检测到arid1afs突变及pik3cah1047r突变(如图5所示)；
fdov1细胞及肿瘤组织免疫化学鉴定：将手术标本以及单克隆fdov1细胞用福尔马林固定，石蜡包埋切片，进行he染色(如图6所示)，选取hnf1β、pax8对单克隆fdov1细胞进行免疫细胞化学染色，与肿瘤组织免疫组织化学染色比对(如图7所示)，结果表明，免疫细胞化学染色与免疫组织化学染色结果一致，证实其保留了原始肿瘤细胞的分化表型；
细胞成瘤性：体外大规模扩增细胞，将第18代fdov1细胞以1*107数量级皮下接种nod/scid小鼠3只，20天后可观察到3只裸鼠全部移植瘤长出，继续生长20天后，小动物mri成像显示移植瘤呈结节状，外有包膜(如图6所示)；
肿瘤的病理学鉴定：继续培养一周后，常规处理2只小鼠(剩余1只小鼠在继续培养过程中死于肺炎)，肿瘤组织经福尔马林固定，石蜡包埋切片，进行he染色及免疫组织化学染色，结果表明，移植瘤免疫组织化学染色跟原临床标本免疫组织化学染色结果一致，形成对应关系(如图7所示)。
本发明提供了一种中国人卵巢透明细胞癌细胞系fdov1，该细胞系形态稳定，可以稳定多次传代，用于卵巢透明细胞癌生物学行为的研究；具有较强的致瘤性，可用于建立卵巢透明细胞癌动物模型，制得的动物模型适用于卵巢透明细胞癌发生发展的分子机制研究以及药物筛选。