本发明属于昆虫控制领域，具体涉及一种转运必需体分选复合物iii核心亚基snf7类的双链rna(dsrna)，以及该dsrna的制备方法和应用。
背景技术：
escrt-ⅲ，称为转运必需体分选复合物ⅲ(theendosomalsortingcomplexesrequiredfortransport-iii)主要由vps20、snf7/vps32、vps24和vps2四个“核心”亚基组成，是真核细胞中完成内体膜内陷以形成多囊泡体(mvb)的关键组分。escrt-ⅲ的主要功能是募集去泛素化(de-ubiquitin)的酶，促进被泛素(ubiquitin)标记的膜蛋白的降解。除了参与mvb的形成外，escrt-iii还与细胞跨膜蛋白的内化、转运、分选、细胞自噬和细胞分裂等细胞生命活动有关，而这些生命过程又与mvb形成过程密切相关(babst等，2002；res等，2007；capalbo等，2012；tang等，2015)。因此，escrt-iii对于所有真核生物的生长发育均有重要的作用。
snf7属于进化保守的蛋白质家族，在酵母中是由240个氨基酸组成，在果蝇中的同系物为shrb(shrub)，在人类的同系物为chmp4，其存在于除古细菌外的其它任何物种(babst等，2002；mcmillan等，2016)。snf7是一种可溶性卷曲螺旋蛋白，含有高度结构化的“四核”螺旋结构域。snf7的功能包括：1)自噬；2)与去泛素酶的相互作用(dub)招募dub到escrt途径；3)多囊泡体内腔内囊泡(ilv)形成mvb；4)细胞分裂(lata等，2008；obita等，2007；ramaseshadri等，2013；
snf7虽为绝大部分生物生命活动中的必需蛋白，但在昆虫中的研究还较少，其中以果蝇和西方玉米根甲虫(westerncornrootworm，wcr，diabroticavirgiferavirgifera)中的研究最多。sweeney等通过对果蝇shrub(即果蝇的snf7)突变体的研究，发现shrb在昆虫的神经形态发生中发挥重要作用(sweeney等，2006)。baum等通过西方玉米根甲虫的rnai实验，发现极低剂量的dsdvsnf7就可导致wcr致死(baum等，2007)。随后bolognesi等通过rnai技术干涉wcr幼虫中的snf7基因的表达，发现试验组幼虫相于对照组生长明显被阻碍，且分别以50ng/ml和1000ng/ml的剂量饲喂幼虫24h后会造成90.3％和94.6％的致死率(bolognesi等，2012)。对玉米根甲虫饲喂dsdvsnf7后，发现泛素化蛋白在幼虫组织中积累，阻碍了中肠和脂肪体的细胞自噬而导致幼虫死亡(ramaseshadri等，2013)。
目前，针对昆虫杀虫剂的研究较多，但主要集中的是昆虫特有基因，如:蜕皮激素受体(ecdysonereceptor，ecr)和几丁质合成酶(chitinsynthase，chs)(wu等，2012；wang等，2012)。这些杀虫剂的主要优点是针对大部分昆虫，是一种宽谱杀虫剂，但其相对安全性不高，且对昆虫的致死效率有限，这极大地限制了昆虫特有基因杀虫剂的使用。由于snf7对昆虫生长发育起至关重要的作用，已有研究者通过设计特异性片段，获得了高效安全的仅针对西方玉米根甲虫的窄谱杀虫剂。通过对褐飞虱snf7这一管家基因进行特异性片段设计，将有助于我们筛选到新的针对褐飞虱的高效安全的窄谱杀虫剂。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种针对褐飞虱防治效果显著的高效安全性杀虫dsrna。
本发明的另一个目的是提供所述高效安全性杀虫dsrna的制备方法。
本发明的再一个目的是提供所述高效安全性杀虫dsrna在制备用于防治褐飞虱的药物中的应用。
本发明的又一个目的是提供使用所述高效安全性杀虫dsrna防治褐飞虱的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种escrt-iii核心亚基snf7类双链rna，其转录模板的正义链的核苷酸序列如seqidno：1所示。
本发明还提供了所述escrt-iii核心亚基snf7类双链rna的制备方法，其包括以下步骤：
1)提取褐飞虱总rna：取成虫，于液氮中研磨，用trizol法提取总rna；
2)合成cdna第一链：将1μg总rna反转录为cdna；
3)制备褐飞虱snf7同源基因nl020727基因中间片段，并制备含有所述中间片段的载体；
4)以步骤3)得到的载体为模板，扩增得到目的片段，即所述escrt-iii核心亚基snf7类双链rna。
具体地，步骤3)的具体操作如下：
步骤1、聚合酶链式反应：试剂包括peasy--020727质粒dna1.5μl、10μm的所述nl020727基因特异性上游引物nl020727-f2μl、10μm的所述nl020727基因特异性下游引物nl020727-r2μl、2×phantamaxbuffer25μl、dntpmix1μl、phantamaxsuper-fidelitydnaploymerase1μl、双蒸水17.5μl；将所述试剂混合得到混合液，总体积为50μl；所述聚合酶链式反应的具体步骤如下：将所述混合液95℃预变性3min，然后进入下列循环：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，共30个循环，最后72℃再延伸7min；其中，扩增所述nl020727基因特异性片段的上游引物nl020727-f的序列为：5’-ccctttcactactactcatcttca-3’；下游引物nl020727-r的序列为：5’-gttcttcttcttctttttcttcct-3’；
步骤2、扩增产物纯化：使用magen凝胶回收试剂盒纯化pcr扩增片段，得到纯化产物；
步骤3、中间载体获得：将所述纯化产物按照连接反应体系，克隆到peasy-bluntzero载体，转化到trans1-t1感受态细胞，在含有100ug/ml氨苄青霉素的lb平板上过夜培养，得到菌落；所述连接反应体系为：纯化产物4μl，peasy-bluntzero1μl，总体积共5μl；
步骤4、质粒纯化：将所述菌落接种于lb液体培养基，37℃摇床过夜培养后收取菌液，抽提质粒，得到含有nl020727基因的质粒。
具体地，所述步骤4)的具体操作如下：
步骤a、设计以下特异性引物：
dsnl020727-f：5’-aatgaagggaagagagatcgtgccaaa-3’
dsnl020727-r：5’-tacagcctcatcatcctcagcagtca-3’
dsnl020727-t7f：
5’-ggatcctaatacgactcactataggaatgaagggaagagagatcgtgccaaa-3’
dsnl020727-t7r：
5’-ggatcctaatacgactcactataggtacagcctcatcatcctcagcagtca-3’
步骤b、以含有所述nl020727基因中间片段的载体为模板，使用所述步骤a中的特异性引物分别按照以下反应条件扩增，得到目的片段：
a反应体系如下：
b反应体系如下：
其中，pcr仪扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸35s，30个循环；72℃再延伸10min；
其中，通过dsrna合成试剂盒合成所述nl020727基因对应的双链rna。
本发明还提供了一种杀虫剂，其包括所述escrt-iii核心亚基snf7类双链rna作为活性成分。
本发明还提供了所述escrt-iii核心亚基snf7类双链rna在制备用于防治褐飞虱的药物中的应用。
本发明还提供了一种使用所述escrt-iii核心亚基snf7类双链rna防治褐飞虱的方法，其包括：使用所述escrt-iii核心亚基snf7类双链rna对褐飞虱进行注射。
优选地，注射所述escrt-iii核心亚基snf7类双链rna的终浓度为0.025μg/μl至0.2μg/μl。
目前防治褐飞虱的主要办法包括农业防治、化学防治和生物防治，由于化学药物带来的抗性作用以及环境污染等问题，使得褐飞虱防治工作难以得到持续性发展。本发明采用escrt-iii核心亚基snf7类双链rna(dsrna)，该双链rna的转录模板为褐飞虱snf7同源基因(nl020727)。本发明通过利用褐飞虱snf7该保守基因，筛选得到双链rna，将其用于褐飞虱防治，可有效抑制褐飞虱的正常发育和繁殖，防治效果显著，而且不会产生抗药性和环境污染，安全环保。
附图说明
图1是注射dsnl020727后褐飞虱的mrna相对表达量变化图。
图2是注射dsnl020727后褐飞虱的校正致死率变化图。
图3是注射dsnl020727后褐飞虱的蛋白变化图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
按照以下步骤制备dsrna：
1.选取褐飞虱成虫1天
2.总rna的提取：取1头成虫，于液氮中研磨，用trizol法提取总rna。
3.cdna第一链的合成：按照使用takara公司的primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒说明书，将1μg总rna反转录为cdna。
4.下面描述nl020727中间片段制备过程。
(1)聚合酶链式反应(pcr)试剂(vazyme
上述聚合酶链式反应的具体步骤如下：将上述混合液95℃预变性3min，然后进入下列循环：95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸50s，共30个循环，最后72℃再延伸7min。
其中，扩增nl020727基因特异性片段的上游引物nl020727-f的序列为：5’-ccctttcactactactcatcttca-3’(seqidno：2)；下游引物nl020727-r的序列为：5’-gttcttcttcttctttttcttcct-3’(seqidno：3)；
(2)扩增产物纯化：使用magen凝胶回收试剂盒纯化pcr扩增片段。
(3)中间载体获得：将纯化产物按照下列连接反应体系，中间载体获得：将纯化产物按照下列连接反应体系，克隆到peasy-bluntzero载体(北京全式金生物技术有限公司)，转化到trans1-t1感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，在含有100ug/ml氨苄青霉素的lb平板上过夜培养；
连接反应体系如下：
纯化产物4μl
peasy-bluntzero1μl
总体积5μl
(4)质粒的纯化：挑取5个菌斑，进行菌落pcr验证，选取正确的菌落接种于lb液体培养基，37℃摇床过夜培养后收取菌液，按magen质粒dna抽提试剂盒抽提质粒。
(5)序列测定与同源检测：进行测序结果分析，得到nl020727基因的核苷酸序列，长710bp(如seqidno：12所示)。本发明所述escrt-iii核心亚基snf7类双链rna的核苷酸序列如seqidno：1所示，长312bp。
含有nl020727基因的质粒命名为peasy—020727。
实施例2
(1)设计带有t7启动子的特异性引物，进行nl020727的dsrna体外合成，同时使用绿色荧光蛋白基因的引物，合成dsgfp作为对照。
dsnl020727-f：5’-aatgaagggaagagagatcgtgccaaa-3’(seqidno：4)
dsnl020727-r：5’-tacagcctcatcatcctcagcagtca-3’(seqidno：5)
dsnl020727-t7f：
5’-ggatcctaatacgactcactataggaatgaagggaagagagatcgtgccaaa-3’
(seqidno：6)
dsnl020727-t7r：
5’-ggatcctaatacgactcactataggtacagcctcatcatcctcagcagtca-3’(seqidno：7)
dsgfp-f：5’-aagggcgaggagctgttcaccg-3’(seqidno：8)
dsgfp-r：5’-cagcaggaccatgtgatcgcgc-3’(seqidno：9)
dsgfp-t7f：
5’-ggatcctaatacgactcactataggaagggcgaggagctgttcaccg-3’(seqidno：10)
dsgfp-t7r：
5’-ggatcctaatacgactcactataggcagcaggaccatgtgatcgcgc-3’(seqidno：11)
(2)以实施例1得到的名称为peasy--020727的质粒为模板，使用步骤1设计的引物分别按照以下反应条件扩增，得到目的片段。
a反应体系如下：
b反应体系如下：
pcr仪扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸35s，30个循环；72℃再延伸10min；
(1)通过dsrna合成试剂盒(t7ribomaxtmexpressrnaisystem,promega,usa)合成nl020727对应的dsrna，命名为dsnl020727。
(2)对褐飞虱注射dsnl020727，终浓度为0.025μg/μl、0.05μg/μl、0.1μg/μl和0.2μg/μl四个梯度，以绿色荧光蛋白的dsgfp为对照。
(3)收集步骤(2)注射后24、48、72h的短翅雌性成虫一天的褐飞虱，通过荧光定量pcr的方法进行nl020727基因的mrna相对表达量变化的检测。结果如图1所示，发现注射0.025μg/μl至0.2μg/μl浓度的dsnl020727后，其mrna表达量均显著降低。此外，对注射不同剂量dsnl02072后褐飞虱的致死率进行统计，结果如图2所示，发现在注射四个剂量的dsrna后的13天内，褐飞虱的致死率持续上升，且在第13天的致死率均高达70％，说明dsnl02072阻碍了褐飞虱的正常发育。
(4)收集注射0.05μg/μldsnl020727后1天和5天的褐飞虱，通过westernblot的方法检测nl020727蛋白表达变化，结果如图3所示，发现褐飞虱注射dsnl020727后，随着时间的延长，褐飞虱体内的nl020727蛋白表达水平显著降低。结果说明通过对褐飞虱注射dsnl020727片段，能有效干扰靶标基因的表达，阻碍了nl020727的蛋白质合成。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均因为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>中山大学
<120>一种escrt-iii核心亚基snf7类双链rna及其制备方法及应用
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>312
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
aatgaagggaagagagatcgtgccaaattattactgaagaagaagagataccaagaacaa60
ctgctaagcagaactgatggccagcttgaaaacttggaaacattggttcacgacctggag120
tttgctcaaatcgaaacccaggtcgtggaaggattgaaagtaggaaacgatgcgctgaag180
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ggcatcgagaagcagaaagagatagacgatctgctgagtggagcgatgaccgctgaggat300
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<210>2
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<211>710
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<213>人工序列(artificialsequence)
<400>12
ccctttcactactactcatcttcaattttttccataaaaattataccgatttccatagtt60
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