本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能在37℃仍能抑制溶菌基因e的表达而有利于制备菌蜕时获得更多的菌体的溶菌质粒及其构建和在制备大肠杆菌菌蜕中的应用。
背景技术：
菌蜕(bacterialghost)是通过噬菌体phix174溶菌基因e的可调控表达而形成的缺少细胞浆和核酸且无繁殖能力的革兰氏阴性细菌空壳。溶菌基因e编码91个氨基酸的疏水蛋白，它能在革兰氏阴性细菌细胞膜上形成一个直径约为40～200nm的特异性的跨膜孔道，在渗透压的作用下使革兰氏阴性细菌的胞质内含物由孔道排出，从而形成不含核酸、核糖体及其他组分的细菌空壳。细菌菌蜕作为1种优良的新型疫苗正受到越来越多的关注，菌蜕使细菌表面抗原结构得以完整保留，即便是如菌毛这样脆弱的结构也能保存下来，所以菌蜕较传统疫苗保留了良好的免疫原性，可刺激机体产生更强的免疫反应，能诱导机体发生更强的体液和细胞免疫，是一种理想的新型疫苗。
目前制备菌蜕主要是基于λ噬菌体启动子pl/pr及其温敏阻遏蛋白ci857的温控表达载体，在革兰氏阴性菌内对噬菌体phix174裂解基因e的严格表达调控来实现的。但目前该系统存在如下不足：一方面在该系统中，基因e的表达通常在28℃时受到严格抑制，而当温度高于30℃时(通常为42℃)，由于阻遏蛋白ci857的热激失活，导致基因e开始表达，进而导致细菌裂解。然而细菌在升温诱导前必须置于28℃进行培养，而28℃并非许多病原菌的最适生长温度，也不利于一些细菌表面重要抗原决定簇的保持；其次，28℃提升到42℃的温度转换会诱导细菌产生严重的热激反应进而抑制基因e介导的裂解作用；另一方面在菌蜕制备过程中，单纯基因e所介导的裂解作用并不足以使宿主菌完全灭活。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明采用了如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种能在37℃仍能抑制溶菌基因e的表达的溶菌质粒，其特征在于，包括：温敏调控及其启动子基因δci857-pr、噬菌体溶菌基因e基因、pbv220质粒的rrnb终止子和puc19质粒载体组成，其中，所述温敏调控及其启动子基因δci857-pr的pr启动子的第2个操纵基因or2的序列为5'-taacaccgcgcgtgttg-3'。
本发明提供的溶菌质粒，还具有这样的特征，还包括：金黄色葡萄球菌核酸酶a基因sna基因和pbv220质粒的pl启动子，其中，所述pl启动子启动所述sna基因的表达。
本发明的另一个目的是提供上述的溶菌质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，设计含有相应酶切位点的引物克隆目的基因，
根据pbv220载体系列分别设计分别用于扩增温敏调控及其启动子基因ci857-pr以及rrnb终止子的5′端加入酶切位点的2对引物对，根据噬菌体溶菌基因e基因已知序列设计用于扩增e基因的3对5′端加入酶切位点的1对引物对；步骤2，克隆并纯化回收目的基因片段，采用步骤1设计的各个引物对克隆相应基因的片段并通过相应双酶切回收纯化得到包括温敏调控及其启动子基因ci857-pr、rrnb终止子以及e基因的目的基因；步骤3，构建溶菌质粒puc19-ci857-pr-e-rrnb，以puc19质粒为载体，依次连接步骤2得到的目的基因ci857-pr、e和rrnb，测序正确完整的重组质粒即为质粒puc19-ci857-pr-e-rrnb；步骤4，puc19-ci857-pr-e-rrnb溶菌质粒的突变，以重组溶菌质粒puc19-ci857-pr-e-rrnb为模板，通过多次扩增酶切回收得到由温敏调控及其启动子基因δci857-pr、e基因以及终止子rrnb组成的片段δci857-pr-e-rrnb，再将该片段与puc19载体分别进行酶切，酶切产物回收后进行连接，得到阳性质粒测序鉴定，测序正确的重组质粒即为溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb，其中，温敏调控及其启动子基因ci857-pr的pr启动子的第2个操纵基因or2的序列为5'-taacaccgtgcgtgttg-3'；温敏调控及其启动子基因δci857-pr的pr启动子的第2个操纵基因or2的序列为5'-taacaccgcgcgtgttg-3'。
本发明提供的构建方法，还具有这样的特征：其中，步骤1中的用于扩增温敏调控及其启动子基因ci857-pr、rrnb终止子、e基因的引物对分别为引物对ci857-f和ci857-r、引物对rrnb-f和rrnb-b以及引物对e-f和e-r，各个引物的核苷酸系列从5’----3’分别为：
ci857-f，aactgcaggaccagaacaccttgccg；
ci857-r，cgcgtcgacgagatctttagctgtcttggtttgc；
rrnb-f，gctctagactgttttggcggatgagag；
rrnb-r，cgcggatccgtagaaacgcaaaaagg；
e-f，cgcgtcgacatggtacgctggactttg；
e-r，gctctagatcactccttccgcacgt。
本发明提供的构建方法，还具有这样的特征：其中，步骤4具体如下：步骤4.1，以ci857-pr为模板，设计引物对ci857-mutf和ci857-mutr；步骤4.2，以重组质粒puc19-ci857-pr-e-rrnb为模板，以引物ci857-f和引物ci857-mutr为引物对扩增大小为783bp的δci857-e片段，以引物ci857-mutf和引物rrnb-r为引物对扩增大小为806bp的δci857-rrnb片段；步骤4.3，将步骤4.2得到的两个片段分别用胶回收试剂盒回收，以回收的δci857-e片段和δci857-rrnb片段同时作为模板，用引物ci857-f和引物rrnb-r为引物对扩增大小为1589bp的δci857-e-rrnb片段；步骤4.4，用相应的限制性内切酶对纯化的δci857-e-rrnb片段和puc19载体进行酶切，将回收后的片段进行连接，pcr鉴定、测序，测序正确的即为溶菌质粒puc19-δci857-pr-e-rrnb，其中，引物ci857-mutf和引物ci857-mutr的核苷酸系列从5’----3’分别为：
ci857-mutf，tatctaacaccgcgcgtgttg；
ci857-mutr，caacacgcgcggtgttagata。
本发明提供的构建方法，还具有这样的特征，还包括：
步骤5，puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn溶菌质粒的构建，其中，步骤1中，还根据pbv220载体设计1对5′端加入酶切位点的引物对用于启动子pl的扩增，根据金黄色葡萄球菌核酸酶设计1对5′端加入酶切位点的引物对用于sna基因的扩增；步骤2中，克隆并纯化回收得到的目的基因还包括启动子pl和sna基因；步骤5中，将步骤2中双酶切回收得到启动子pl和sna基因连接到步骤4得到的溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb上，测序正确的重组质粒即为溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn。
本发明提供的构建方法，还具有这样的特征：其中，用于启动子pl、sna基因扩增的引物对分别为引物对pl-f和pl-r以及引物对sn-f和sn-r，该2个引物对中的各个引物的核苷酸系列从5’----3’分别为：
pl-f，cgcggatccctctcacctaccaaacaatgc；
pl-r，cggggtaccctccttaatttttaaccaat；
sn-f，cggggtaccatggcaacttcaacta；
sn-r，cgcgagctcttattgacctgaatcagcg。
本发明还提供了一种上述的溶菌质粒在制备大肠杆菌菌蜕中的应用。
发明作用与效果
本发明提供的溶菌质粒，由于通过对温敏调控及其启动子基因ci857-pr的启动子pr进行点突变，得到新的温敏调控及其启动子基因δci857-pr，其中pr启动子的第2个操纵基因or2的序列为5'-taacaccgcgcgtgttg-3'，所以实现在37℃仍能抑制基因e的表达，有利于制备菌蜕时获得更多的菌体。
附图说明
图1为实施例1中的质粒puc19-ci857-pr-e-rrnb点突变示意图；
图2为实施例1中构建得到的溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn点突变序列比对结果图；
图3为实施例1中构建得到的溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn示意图及双酶切与pcr鉴定结果；
图4为试验例1中诱导含有溶菌质粒的dh5α和de17的生长曲线；
图5为试验例2中诱导不同时间dh5α(a图)和de17(b图)的基因组；
图6为试验例3中的正常de17和诱导后的de17在电镜扫描图。
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
实施中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1溶菌质粒的构建
溶菌质粒的构建方法包括以下步骤：
步骤1，设计含有相应酶切位点的引物克隆目的基因
根据pbv220载体系列分别设计分别用于扩增温敏调控及其启动子基因ci857-pr、rrnb终止子以及启动子pl的引物对，根据噬菌体溶菌基因e基因已知序列设计用于扩增e基因的引物对，根据金黄色葡萄球菌核酸酶设计用于sna基因的引物对，并在涉及的每个引物的5′端加入酶切位点，具体见表1中的引物对ci857-f和ci857-r、引物对e-f和e-r、引物对rrnb-f和rrnb-r、引物对pl-f和pl-r、引物对sn-f和sn-r，其中，划线部分为这些引物的划线部分各自相应的酶切位点。
表1溶菌质粒的构建引物
步骤2，克隆并纯化回收目的基因片段，
采用步骤1设计的各个引物对克隆相应基因的片段并通过相应双酶切回收纯化得到各个所述目的基因，也即e基因、rrnb终止子、温敏调控及其启动子基因ci857-pr、启动子pl和sna基因。
步骤3，构建溶菌质粒puc19-ci857-pr-e-rrnb，
以puc19质粒为载体，依次连接步骤2得到的目的基因ci857-pr、e和rrnb，测序正确完整的重组质粒即为质粒puc19-ci857-pr-e-rrnb，具体为：
puc19质粒用salⅰ和xbaⅰ进行双酶切，双酶切后用dna纯化试剂盒回收，再用t4连接酶与步骤2得到的e基因连接，将连接产物转化入大肠杆菌dh5α，然后用引物e-f/e-r进行pcr鉴定。
将pcr鉴定为阳性的克隆，转接到含100μg/mlamp的lb液体培养基，提取质粒进行酶切、测序鉴定，将测序正确的重组质粒命名为puc19-e。
puc19-e用xbaⅰ和bamhⅰ进行双酶切，再与步骤2得到的rrnb终止子连接，pcr鉴定、测序正确的重组质粒命名puc19-e-rrnb。
puc19-e-rrnb用pstⅰ和salⅰ进行双酶切，再步骤2得到ci857-pr片段连接，pcr鉴定、测序正确的即为溶菌质粒puc19-ci857-pr-e-rrnb。
步骤4，puc19-ci857-pr-e-rrnb溶菌质粒的突变
以重组溶菌质粒puc19-ci857-pr-e-rrnb为模板，通过多次扩增酶切回收得到由温敏调控及其启动子基因δci857-pr、e基因以及终止子rrnb组成的片段δci857-pr-e-rrnb，再将该片段与puc19载体分别进行酶切，酶切产物回收后进行连接，得到阳性质粒测序鉴定，测序正确的重组质粒即为溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb，具体为：
步骤4.1，以ci857-pr为模板，设计引物对ci857-mutf和ci857-mutr，具体见表1中的引物对ci857-mutf和ci857-mutr，其中，划线部分为突变位点；
步骤4.2，以重组质粒puc19-ci857-pr-e-rrnb为模板，以引物ci857-f和引物ci857-mutr为引物对扩增大小为783bp的δci857-e片段，以引物ci857-mutf和引物rrnb-r为引物对扩增大小为806bp的δci857-rrnb片段；
步骤4.3，将步骤4.2得到的两个片段分别用胶回收试剂盒回收，以回收的δci857-e片段和δci857-rrnb片段同时作为模板，用引物ci857-f和引物rrnb-r为引物对扩增大小为1589bp的δci857-e-rrnb片段；
步骤4.4，用相应的限制性内切酶对纯化的δci857-e-rrnb片段和puc19载体进行酶切，将回收后的片段进行连接，pcr鉴定、测序，测序正确的即为溶菌质粒puc19-δci857-pr-e-rrnb。
图1为实施例1中的质粒puc19-ci857-pr-e-rrnb点突变示意图；
图2为实施例1中构建得到的溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn点突变序列比对结果图。
如图1和图2所示，当λpr启动子中操纵基因的or2的第9位碱基成功的由t诱变为c(t→c)，表面成功完成上述突变，也即温敏调控及其启动子基因ci857-pr的pr启动子的第2个操纵基因or2的序列由5'-taacaccgtgcgtgttg-3'变为5'-taacaccgcgcgtgttg-3'，该突变后得到的系列即为温敏调控及其启动子基因δci857-pr的pr启动子的第2个操纵基因or2的序列。
步骤5，puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn溶菌质粒的构建
具体为：将步骤2中双酶切回收得到启动子pl和sna基因连接到步骤4得到的溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb上，测序正确的重组质粒即为溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn。
图3为实施例1中构建得到的溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn示意图及双酶切与pcr鉴定结果。
提取puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn质粒用不同的上下游引物进行搭配组合扩增目的片段鉴定，同时用相应的限制性内切酶进行双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示的，即为溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn。
试验例1大肠杆菌菌蜕制备及其溶菌试验与检测
分别将质粒puc19、puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn转化至dh5α和禽致病大肠杆菌de17感受态细胞中，37℃摇菌1h，凃布于lb(100μg/ml氨苄抗性)平板37℃培养，挑取单菌落进行鉴定，筛选阳性克隆。
鉴定正确的菌株命名为：
dh5α(puc19)、dh5α(puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn)、de17(puc19)和de17(puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn)。
图4为试验例1中诱导含有溶菌质粒的dh5α和de17的生长曲线。
分别将上述4种菌株接种于lb(100μg/ml氨苄抗性)液体培养基，37℃培养至od600值为1，1:100接种于4份100mllb(100μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃培养至od600值约为0.4。迅速将温度升高至42℃进行诱导，之后，每30min取一次样，利用分光光度计测其od600值，绘制溶菌曲线如图4所示。
取上述转化了puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn的42℃诱导0h和4h后的菌液100μl，用无菌pbs溶液进行梯度稀释后，取20μl接种到lb固体培养基上，37℃恒温培养过夜后进行活菌计数，统计各梯度活菌数(cfu)，每个稀释度3个重复，通过适当梯度cfu计算溶菌效率。计算细菌溶菌效率，计算公式为：溶菌率＝(1-诱导后cfu/诱导前cfu)×100％，溶解效率如表2所示。
表2菌蜕的溶菌效率
从图4中可以看出，随着时间的进行，转化表达了溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn的，菌种浓度很快就下降，表示可以有效地制备出大肠杆菌菌蜕，4小时左右后，菌种浓度变化不再明显；从表2中可以看出，溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn的溶菌效率接近100％，表示已经制备出有效的大肠杆菌菌蜕。
图4和表2结合可知，实施例1制备的溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb或溶菌质粒溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn，由于puc19-δci857中的启动子被突变，所以实现在37℃仍能抑制基因e的表达，有利于制备菌蜕时获得更多的菌体。
试验例2sna基因对菌蜕基因组的降解作用试验检测
分别将溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn转化至dh5α和de17，然后进行试验例1一样的试验操作，在进行42℃诱导后，每隔1h取1ml细菌培养液提取总基因组，基因组的提取使用基因组提取试剂盒，操作按照产品说明书进行。提取的基因组通过1％琼脂糖电泳分析，检测细菌基因组是否被核酸酶所降解，不含质粒组的基因组没有变化，而含菌蜕质粒组的基因组都随着热激活时间的延长而裂解变小。
图5为试验例2中诱导不同时间dh5α(a图)和de17(b图)的基因组。
如图5所示，从图5中可以看出，随着表达sna基因时间的延长，细菌的基因组被完全破坏，说明sna基因对于基因组降解效果明显。
试验例3菌蜕的电镜观察
将正常的培养的de17和如试验例1一样溶菌质粒诱导后的de17菌体(也即菌蜕)收集起来，菌体置入2.5％的戊二醛溶液中4℃固定过夜，从低浓度逐步提高到纯乙醇逐级脱水，再用包埋剂逐步替换菌体中的脱水剂。直至包埋剂均匀地浸透到细胞结构的一切空隙中，最后聚合成坚硬的固体，用超薄切片机切片后在透射电镜下进行观察。
前处理好的菌体置入2.5％戊二醛溶液中4℃固定过夜，用pbs(ph7.2)洗涤3次后，用四氧化锇4℃固定1.5h。乙醇逐级脱水，乙酸戊二酯置换，干燥后喷金，在扫描电镜下观察。
图6为试验例3中的正常de17和诱导后的de17在电镜扫描图。
如图6所示，从图中可以看出，经溶菌质粒诱导成菌蜕的de17菌体，相比正常得到的de17菌体，形成了明显的细菌空壳，说明实施例1提供的溶菌质粒，能有效地得到菌蜕。
实施例1的作用与效果
通过试验例1-3可以看出，由于实施例1中通过对温敏调控及其启动子基因ci857-pr的启动子pr进行点突变，得到新的温敏调控及其启动子基因δci857-pr，其中pr启动子的第2个操纵基因or2的序列为5'-taacaccgcgcgtgttg-3'，所以实现在37℃仍能抑制基因e的表达，有利于制备菌蜕时获得更多的菌体；进一步地，金黄色葡萄球菌核酸酶a(staphylococcalnucleasea，sna)被引入菌蜕制备中宿主菌的进一步灭活及残存遗传物质的去除，以使宿主菌进一步被灭活，同时去除残存的遗传物质，消除潜在的生物安全风险；同时，将pr-pl双启动子分开，用pr启动e基因的表达，pl启动sna基因的表达，提高单个启动子的启动效率，在提高菌蜕质粒裂解效率的同时，通过sna对细菌基因组的降解，提高菌蜕制备过程中的生物安全性。
因此，通过实施例1制备的溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn或溶菌质粒puc19-δci857-e-rrnb，可实现在37℃培养细菌，42℃制备菌蜕；同时，引入sna基因进一步得到的质粒puc19-δci857-e-rrnb-pl-sn，进一步对基因组进行降解，溶菌质粒实现了高效制备菌蜕和提高菌蜕生物安全性。
本发明的范围不受具体实施方案的限制，实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。改进也落入所附权利要求书的范围之内。