本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种pten-long蛋白纯化制备方法。
背景技术：
磷酸酶张力蛋白样同源物(pten)基因，又名多种晚期癌突变(mmac1)基因，是一种经典的肿瘤抑制基因。pten-long是pten的mrna5’-区的翻译变体，这个变体使原有翻译基础上在n端增加了173个氨基酸，是pten蛋白选择性剪接产物，且在进化上高度保守。pten-long能够被分泌，并在血清及血浆中均能找到，具有明显外分泌的能力。
相比于pten蛋白，pten-long蛋白在体外实验中发现，具有进入细胞，抑制肿瘤生长的能力。鉴于pten-long的这个能力，表明pten-long蛋白具备成为药物抗肿瘤的能力。制备pten-long纯化蛋白则具有实际意义。
但是，现有技术中，制备pten-long纯化蛋白纯度较低，且在蛋白纯化过程中需要。
技术实现要素：
本发明针对上述技术问题，提供了一种pten-long蛋白纯化制备方法，其只需要过一次镍柱且制备出来的pten-long蛋白纯度高。
本发明用于解决以上技术问题的技术方案为，提供一种pten-long蛋白纯化制备方法，包括以下步骤：
s100.将pten-long质粒转入感受态细菌，获得转入质粒后的感受态细菌的菌落；
s200.挑取若干个所述菌落，对若干个所述菌落中的细菌进行扩增以获得具有目标细菌浓度的第二菌液，并对所述具有目标细菌浓度的第二菌液中的细菌进行蛋白诱导得到蛋白诱导后的菌体；
s300.裂解所述菌体，获得初级pten-long蛋白液；
s400.用镍柱纯化所述初级pten-long蛋白液得到二级pten-long蛋白液；
s500.对所述二级pten-long蛋白液进行脱盐及浓缩以收集所述二级pten-long蛋白液中的pten-long蛋白。
可选地，所述步骤s100包括以下步骤：
s110.取出-80℃下保存的感受态细菌放入冰水中解冻，抽取100微升解冻后的感受态细菌注入第一离心管，并将在第一离心管内加入10ngpten-long质粒，混合均匀；
s120.将装有混匀的100微升感受态细菌和10ngpten-long质粒的所述第一离心管冰浴30分钟，然后放入42℃水浴中热休克45秒，取出后再冰浴1分钟；
s130.向所述第一离心管中加入lb液体培养液1ml，将所述第一离心管放置在摇床内，在37℃，200rpm的条件下，缓慢振荡培养90分钟，形成所述转入质粒后的感受态细菌的第一菌液；
s140.取出100ul的所述第一菌液涂在固体培养基中，并将固体培养基倒扣放置在37℃的培养箱中，继续培养16小时以形成所述菌落。
可选地，步骤s200进一步包括以下步骤：
s210.在第一锥形瓶中放入50ml浓度为100ug/ml的lb液体培养液；挑取单个所述菌落，接种于所述第一锥形瓶中的lb液体培养液内；将所述第一锥形瓶放置在摇床内，在37℃，150-300rpm的条件下振荡培养7-20小时，用于对所述菌落中的细菌进行扩增以获得第二菌液；
s220.在第二锥形瓶中加入400ml,氨苄西林浓度为100ug/ml的lb液体培养液和所述第二菌液8ml，将第二锥形瓶放入摇床内，在37℃，150-300rpm的条件下，振荡培养1小时30分钟，用于获得具有目标细菌浓度的第二菌液；
s230.再向所述第二锥形瓶中加入终浓度为0.1mm-1mm的异丙基硫代半乳糖苷，保持在21℃，150-300rpm的条件下，所述第二锥形瓶在摇床上振荡诱导3-6小时，用于对所述具有目标细菌浓度的第二菌液中的细菌进行蛋白诱导以获得第三菌液；
s240.从第二锥形瓶中抽取400ml第三菌液，放入第一离心机中，第一离心机保持4℃，以3000xg的离心速度收集所述菌体。
可选地，步骤s210中摇床的转速为200rpm，振荡培养的时间为16小时；
步骤s220中，摇床的转速为200rpm；
步骤s230中异丙基硫代半乳糖苷的终浓度为0.1mm，摇床的转速为200rpm，振荡诱导时间为4.5小时。
可选地，所述目标细菌浓度为490nm波长下的od值为0.5的细菌浓度；
可选地，步骤s300进一步包括：
s310.取湿重为2g的所述菌体加入20ml的细菌裂解液中，将加入所述菌体的细菌裂解液与0.1％-2％细菌裂解液体积比的聚乙二醇辛基苯基醚和终浓度1mm的苯甲基磺酰氟混合，在冰浴中超声碎菌3次，每次10分钟，用于裂解所述菌体，并得到澄清透明的第四菌液；
s320.在所述第四菌液加入终浓度1mm的苯甲基磺酰氟，放入第二离心机中，在4℃和20000xg离心速度的条件下离心30分钟，抽取上清液，丢弃沉淀，获得第五菌液；
s330.用滤过膜过滤所述第五菌液获得所述初级pten-long蛋白液。
可选地，步骤s310中聚乙二醇辛基苯基醚与细菌裂解液体积比为2％；步骤s330中的滤过膜为0,22um的滤过膜。
可选地，步骤s400进一步包括以下步骤：
s410.分别用5倍柱体积的洗脱液，5倍柱体积的去离子水，10倍柱体积的结合液平衡镍柱；采用1ml/分钟的速度上样5ml所述初级pten-long蛋白液，上样结束后调整至5ml/分钟，继续加入所述初级pten-long蛋白液至10倍柱体积，使得吸光值无明显改变；
s420.向所述镍柱中加入终浓度50mm-150mm的咪唑的混合液，用于去除吸附在镍柱上的杂质，加入10倍柱体积的混合液后再次平衡所述镍柱，用洗脱液洗脱蛋白，收集后的蛋白加入终浓度1mm的二硫苏糖醇，终浓度2mm的乙二胺四乙酸，终浓度1mm的苯甲基磺酰氟得到所述二级pten-long蛋白液；
其中，所述终浓度50mm-150mm的咪唑的混合液通过混合所述结合液和所述洗脱液得到。
可选地，步骤s420中采用终浓度100mm的咪唑。
可选地，步骤s500进一步包括以下步骤：
s510.用10倍柱体积的脱盐液平衡脱盐柱，5ml/分钟的速度上样所述二级pten-long蛋白液，根据吸光值的变化收集脱盐后的pten-long蛋白；
s520.将所述脱盐后的pten-long蛋白放入超滤管中，在第一离心机保持4℃和3000xg离心速度的条件下进行离心20分钟，浓缩并收集pten-long蛋白。
本发明提供了一种pten-long蛋白纯化制备方法，只需要过一次镍柱即可制备出pten-long蛋白，且利用本发明制备的pten-long蛋白纯度更高，pten-long蛋白的表达率在80％以上。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明所提供的pten-long蛋白纯化制备方法的步骤示意图；
图2是本发明所提供的pten-long蛋白纯化制备方法的步骤s100示意图；
图3是本发明所提供的pten-long蛋白纯化制备方法的步骤s200示意图；
图4是本发明所提供的pten-long蛋白纯化制备方法的步骤s300示意图；
图5是本发明所提供的pten-long蛋白纯化制备方法的步骤s400示意图；
图6是本发明所提供的pten-long蛋白纯化制备方法的步骤s500示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如图1所示，本发明提供的一种pten-long蛋白纯化制备方法包括以下步骤：一种pten-long蛋白纯化制备方法，包括以下步骤：
s100.将pten-long质粒转入感受态细菌，获得转入质粒后的感受态细菌的菌落；
s200.挑取若干个所述菌落，对若干个所述菌落中的细菌进行扩增以获得具有目标细菌浓度的第二菌液，并对所述具有目标细菌浓度的第二菌液中的细菌进行蛋白诱导得到蛋白诱导后的菌体；
s300.裂解所述菌体，获得初级pten-long蛋白液；
s400.用镍柱纯化所述初级pten-long蛋白液得到二级pten-long蛋白液；
s500.对所述二级pten-long蛋白液进行脱盐及浓缩以收集所述二级pten-long蛋白液中的pten-long蛋白。
通过以上步骤，本发明在制备pten-long蛋白的过程中，只需要进行过一次镍柱，且制备出来的pten-long蛋白的表达率高达80％以上。具体地，各步骤的描述如下。
s100.将pten-long质粒转入感受态细菌，获得转入质粒后的感受态细菌的菌落。
本实施例中的pten-long质粒来自于addgen,jpexpress404-pten-long-v5/his,catalog：49417；实施例中的感受态细菌为bl21感受态细菌，其为cwbio产品，货号03686。
如图2所示，步骤s100进一步包括以下步骤：
s110.取出-80℃下保存的感受态细菌放入冰水中解冻，抽取100微升解冻后的感受态细菌注入第一离心管，并将在第一离心管内加入10ngpten-long质粒，混合均匀。优选地，所述第一离心管为15ml离心管。
s120.将装有混匀的100微升感受态细菌和10ngpten-long质粒的所述第一离心管冰浴30分钟，然后放入42℃水浴中热休克45秒，取出后再冰浴1分钟。本实施例中的对第一离心管进行冰浴和水浴的水浴锅100购自上海精宏实验设备有限公司。
s130.向所述第一离心管中加入lb液体培养液1ml，将所述第一离心管放置在摇床内，在37℃，200rpm的条件下，缓慢振荡培养90分钟，形成所述转入质粒后的感受态细菌的第一菌液。
本实施例中的摇床购自上海精宏实验设备有限公司，在下述说明书的描述中，若未特别提及，使用的摇床均为该摇床。本实施例中的lb液体培养液为lb无抗生素液体培养液通过以下方法配置而成：称取蛋白胨10g、酵母提取物5g和nacl10g，溶于800ml去离子水中，用naoh调ph至7.5,加去离子水至总体积1升,放入高压灭菌设备内，在高压下蒸气灭菌20分钟。其中，蛋白胨为胰蛋白胨，其为oxoid产品，货号1227229；酵母提取物为oxoid产品，货号1844628；nacl为国药产品，货号7447-40-7；naoh为国药产品，货号1310-73-2。去离子水出自去离子水机，该去离子水机购自millipore公司。
s140.取出100ul的所述第一菌液涂在固体培养基中，并将固体培养基倒扣放置在37℃的培养箱中，继续培养16小时以形成所述菌落。
本实施例中的固体培养基为lb固体培养基，其可通过以下配置方法获得：称取蛋白胨2g、酵母提取物1g、nacl2g和琼脂糖3g，加去离子水180ml，用5mol/l的naoh调ph到7.0，加去离子水至总体积200ml，放入高压灭菌设备内，在高压下蒸气灭菌20分钟。温度降至55度，按终浓度100ug/ml加入氨苄西林，混匀，超净台中倒入灭菌平皿，凝固后放入4℃的冰箱中倒扣备用。
其中，蛋白胨为胰蛋白胨，其为oxoid产品，货号1227229；酵母提取物为oxoid产品，货号1844628；naoh为国药产品，货号1310-73-2；氨苄西林为solarbio公司，货号128f036。去离子水出自去离子水机，该去离子水机购自millipore公司。
s200.挑取若干个所述菌落，对若干个所述菌落中的细菌进行扩增，并对扩增后的细菌进行蛋白诱导得到蛋白诱导后的菌体。
如图3所示，步骤s200进一步包括以下步骤：
s210.在第一锥形瓶中放入50ml浓度为100ug/ml的lb液体培养液；挑取单个所述菌落，接种于所述第一锥形瓶中的lb液体培养液内；将所述第一锥形瓶放置在摇床内，在37℃，150-300rpm的条件下振荡培养7-20小时，用于对所述菌落中的细菌进行扩增以获得第二菌液。优选地，在步骤s210中，摇床的转速为200rpm，振荡培养的时间为16小时。lb液体培养液与步骤s130中的lb液体培养液。
s220.在第二锥形瓶中加入400ml，氨苄西林浓度为100ug/ml的lb液体培养液和所述第二菌液8ml，将第二锥形瓶放入摇床内，在37℃，150-300rpm的条件下，振荡培养1小时30分钟，用于获得具有目标细菌浓度的第二菌液。优选地，该第二锥形瓶为1000ml锥形瓶。优选地，步骤s220中，摇床的转速为200rpm；所述目标细菌浓度为490nm波长下的od值为0.5。其中，该目标细菌浓度通过酶标仪测定，抽取200微升第二菌液到96孔板，将96孔板放入酶标仪，并设置波长为490nm对所述第二菌液的目标细菌浓度进行测定。当细菌浓度高于目标细菌浓度时，细菌过多，会导致后续蛋白诱导不充分，进而导致最后制备出来的pten-long蛋白纯度不高，当细菌浓度低于目标细菌浓度时，细菌过少，制备出来的pten-long蛋白过少，因此，细菌浓度保证在目标细菌浓度时，可以保证制备出来的pten-long蛋白的产量较高，蛋白的纯度高。
采用步骤s210和步骤s220两步进行细菌扩增，可以避免扩增步骤的时间过长，扩增的细菌浓度过大，导致后续蛋白诱导的效果欠佳。通过步骤s210和步骤s220可以获得具有目标细菌浓度的第二菌液，使得后续蛋白诱导效果较好。
s230.再向所述第二锥形瓶中加入终浓度为0.1mm-1mm的异丙基硫代半乳糖苷，保持在21℃，150-300rpm的条件下，所述第二锥形瓶在摇床上振荡诱导3-6小时，用于对具有目标细菌浓度的第二菌液中的细菌进行蛋白诱导以获得第三菌液。优选地，步骤s230中异丙基硫代半乳糖苷的终浓度为0.1mm，摇床的转速为200rpm，振荡诱导时间为4.5小时。此条件下，蛋白诱导的效果最佳。
本实施例中的异丙基硫代半乳糖苷(以下简称iptg)为solarbio公司，货号1213g052。
s240.从第二锥形瓶中抽取400ml第三菌液，放入第一离心机中，第一离心机保持4℃，以3000xg的离心速度收集所述菌体。
本实施例中的第一离心机为eppendorf公司，型号为centrifuge5810r的离心机，第二离心机为为eppendorf公司，型号为centrifuge5424r的高速离心机。二者的区别为，第一离心机的容量大于第二离心机，第二离心机的离心速度高于第一离心机。
s300.裂解所述菌体，制备初级pten-long蛋白液。
如图4所示，步骤s300进一步包括：
s310.取湿重为2g的所述菌体加入20ml的细菌裂解液中，将加入所述菌体的细菌裂解液与0.1％-2％细菌裂解液体积比的聚乙二醇辛基苯基醚和终浓度1mm的苯甲基磺酰氟混合，在冰浴中超声碎菌3次，每次10分钟，用于裂解所述菌体，并得到澄清透明的第四菌液。上述细菌裂解液、菌体、聚乙二醇辛基苯基醚和苯甲基磺酰均添加在第二离心管中。优选地，步骤s310中聚乙二醇辛基苯基醚与细菌裂解液体积比为2％，这个体积比时，可以减少后续采用镍柱纯化蛋白过程中的非特异性结合。
其中，本实施例中的苯甲基磺酰氟(简称pmsf)为solarbio公司，货号p0100；聚乙二醇辛基苯基醚(简称triton-x)为solarbio公司，货号1104b053；细菌裂解液为：150mmnacl,50mmtris(三羟甲基氨基甲烷,简称“tris”)，其中，三羟甲基氨基甲烷为solarbio公司，货号0922s0710。超声碎菌在超声波细胞粉碎机中进行，超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。
s320.在所述第四菌液加入终浓度1mm的苯甲基磺酰氟，放入第二离心机中，在4℃和20000xg离心速度的条件下离心30分钟，抽取上清液，丢弃沉淀，获得第五菌液。
s330.用滤过膜过滤所述第五菌液获得初级pten-long蛋白液。本实施例中的滤过膜millipore公司，型号millexgp0.22um。将得到的初级pten-long蛋白液暂时保存在冰水中。
s400.用镍柱纯化所述初级pten-long蛋白液得到二级pten-long蛋白液。
如图5所示，步骤s400进一步包括以下步骤：
s410.分别用5倍柱体积的洗脱液，5倍柱体积的去离子水，10倍柱体积的结合液平衡镍柱；采用1ml/分钟的速度上样5ml所述初级pten-long蛋白液，上样结束后调整至5ml/分钟，继续加入所述初级pten-long蛋白液至10倍柱体积，使得吸光值无明显改变。
其中，镍柱400为通用公司产品，histraphp5ml；结合液为500mmnacl25mmtrisph7.6,20mm咪唑；洗脱液为500mmnacl25mmtrisph7.5,500mm咪唑。咪唑为solarbio公司，货号1102d031。
s420.向所述镍柱中加入终浓度50mm-150mm的咪唑的混合液，用于去除吸附在镍柱上的杂质，加入10倍柱体积的混合液后再次平衡所述镍柱，用洗脱液洗脱蛋白，收集后的蛋白加入终浓度1mm的二硫苏糖醇，终浓度2mm的乙二胺四乙酸，终浓度1mm的苯甲基磺酰氟得到所述二级pten-long蛋白液。其中，所述终浓度50mm-150mm的咪唑的混合液通过混合所述结合液和所述洗脱液得到。咪唑的终浓度低于50mm，会导致非特异性结合过高，导致杂质较多；当咪唑的终浓度高于150mm，例如，达到200mm时，会使镍柱上可逆性结合的目的蛋白大量洗脱，减少蛋白的获得量。优选地，采用终浓度100mm的咪唑，此时收集到的蛋白纯度较好且获得量较多。
其中，步骤s420在蛋白纯化仪中进行，本实施例中的蛋白纯化仪为通用公司产品，aktaprimeplus。在本实施例中，二硫苏糖醇(简称dtt)为solarbio公司，货号d1070；乙二胺四乙酸(以下简称edta)为solarbio公司，货号1025a065；苯甲基磺酰氟(简称pmsf)为solarbio公司，货号p0100。
s500.对所述二级pten-long蛋白液进行脱盐及浓缩以收集所述二级pten-long蛋白液中的pten-long蛋白。
如图6所示，步骤s500进一步包括以下步骤：
s510.用10倍柱体积的脱盐液平衡脱盐柱，5ml/分钟的速度上样所述二级pten-long蛋白液，根据吸光值的变化收集脱盐后的pten-long蛋白。这一步中，将二级pten-long蛋白液中咪唑等盐锁在脱盐柱中，因此，pten-long蛋白会先从脱盐柱中出来，然后再脱出盐。脱盐时，二级pten-long蛋白液过柱后，由于pten-long蛋白会使吸光值上升而盐有导电性，因此，在过柱后的二级pten-long蛋白液中，吸光值会先上升，导电值不变，意味着这时只有蛋白没有盐，后吸光值下降，导电值上升，意味着蛋白减少，盐逐渐流出。收集脱盐后的pten-long蛋白指的是收集二级pten-long蛋白液过柱后的二级pten-long蛋白液中吸光值高且导电值不上升的部分，这部分包含的pten-long蛋白高且不包含其他盐，这一步的目的是脱咪唑，咪唑对后续步骤有不良影响，盐量高会使pten-long蛋白不稳定。其中，吸光值的检测为现有技术，在此不再赘述。因此，根据吸光值的变化，即可收集从脱盐柱中出来的pten-long蛋白。其中，脱盐液为：50mmnacl,25mmtrisph7.5；脱盐柱为通用公司产品hitraphp5ml。
s520.将所述脱盐后的pten-long蛋白放入超滤管中，在第一离心机保持4℃和3000xg离心速度的条件下进行离心20分钟，浓缩并收集pten-long蛋白。
下述实施例中的超滤管为millipore公司，型号amiconultra-50
对收集到的蛋白进行鉴定，经sds-page系统电泳后考马斯亮蓝染色，对蛋白进行his标签检测，检测pten-long蛋白。检测结果显示，本制备方法制备出来的pten-long蛋白的表达率达80％以上，高于现有技术的制备方法制备出来的pten-long蛋白的表达率。
综上所述，本发明提供了一种pten-long蛋白纯化制备方法，只需要一次镍柱纯化即可制备出pten-long蛋白，且利用本发明制备的pten-long蛋白纯度更高，制备出的pten-long蛋白的表达率在80％以上。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。