本发明属于废弃物资源化领域，具体涉及一种高效发酵鸡粪的组合菌制剂。
背景技术：
：近年来养殖业快速发展，蛋鸡、肉鸡养殖规模不断扩大，鸡粪量不断增多，如果没有得到及时处理或者处理不当，对养殖场及其周边的环境会造成污染。鸡的消化道短,饲料在其中停留的时间不长,吃进的饲料消化利用不充分，大量的营养物质随粪便排出，粪便中仍有相当一部分营养物质未被机体消化利用,目前鸡粪大多只用作堆肥，其中丰富的营养物质并没有得到充分利用。肉用仔鸡鸡粪中，粗蛋白含量25％～30％,真蛋白约13％。其中，粗蛋白中含较多非蛋白氮，以氨化物和尿酸盐为主，尿酸在非蛋白中含量高达一半，如果将鸡粪直接作为饲料，动物利用率低。另外，鸡粪中含有治病细菌、病毒、寄生虫等,将其直接饲喂动物也会导致疾病的发生。综上，鸡粪不能直接用于饲喂动物，必须做无害化处理,以达到提高真蛋白含量、除臭、灭菌、脱水等目的,从而提高饲用价值和饲喂效果。目前鸡粪发酵生产饲料大多只重视处理前后粗蛋白和风味的变化，鲜有注重鸡粪发酵对真蛋白含量的影响。而鸡粪中主要的非蛋白氮为氨化物和尿酸，而真蛋白才是动物真正所需要的营养蛋白。因此，提供一种高效发酵鸡粪的组合菌制剂，从而提高发酵鸡粪中的真蛋白含量，具有重要的现实意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种高效发酵鸡粪的组合菌制剂。为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种组合菌制剂，用于鸡粪的高效发酵，包括在总接种量5％的酵母菌组合制剂和总接种量5％的乳酸菌组合制剂；所述酵母菌组合制剂由异常威克汉姆酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母按接种量为1:(2～3):(2～3)混合，所述各酵母菌的菌浓度＞1.0×109个/ml；所述乳酸菌组合制剂由嗜酸乳杆菌、胚芽乳杆菌、香肠乳杆菌按接种量为1:1:1混合，所述各乳酸菌的菌浓度＞1.0×1010个/ml。优选的，所述酵母菌制剂为：异常威克汉姆酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母按接种量为1:2:2混合。优选的，所述酵母菌组合制剂用于鸡粪的好氧发酵，所述乳酸菌组合制剂用于鸡粪的厌氧发酵。优选的，所述鸡粪的高效发酵，具体步骤包括：(1)鸡粪预处理：将鸡粪在70～100℃高温条件下热处理0.5～2h；(2)发酵底物预混：按质量份数，将预处理后的鸡粪5～7份、麸皮1～2份、玉米粉1～2份混匀，调整含水量至50％，得发酵底物；(3)好氧发酵：将酵母菌组合制剂接种到发酵底物中，在20～35℃条件下进行好氧发酵24h～48h，发酵至：肉眼可见发酵底物中长有白色菌丝，得好氧固态发酵物料；(4)厌氧发酵：将乳酸菌组合制剂接种到好氧固态发酵物料中，在20～35℃条件下密封厌氧发酵48～96h，发酵至：发酵底物ph值达到4以下，具有浓郁的酒香味和乳香味，质地松散，发酵完成。优选的，步骤(3)所述好氧发酵时间为36h。优选的，步骤(4)所述厌氧发酵时间为60h。相应的，所述方法发酵的鸡粪在动物饲料中的应用。本发明具有以下有益效果：1、本发明通过热处理和好氧-厌氧两步发酵，杀灭或抑制志贺氏菌、沙门氏菌、霉菌、大肠杆菌、蛔虫虫卵等有害微生物，去除了有害物质，保证发酵蛋白饲料的使用安全，同时增加有益菌，使鸡粪由废弃物成为可饲喂饲料，环保绿色、成本低廉。2、本发明提供的发酵鸡粪的方法，分为好氧发酵和厌氧发酵两步，氨氮及尿酸等非蛋白氮的含量极低，有效提高了发酵鸡粪中真蛋白的含量。3、本发明将好氧发酵后的发酵物接种5％的乳酸菌混合液，进行厌氧发酵，选择的乳酸菌中：嗜酸乳杆菌能调整肠道菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖，对致病菌具有拮抗作用并能耐受低ph；胚芽乳杆菌具有良好的热、酸稳定性，其发酵物具有乳香味；香肠乳杆菌含有免疫活性的某一种物质。发酵后的饲料既增加了乳香味，又能抑制喂养畜禽中肠道不良微生物的繁殖，具有良好的饲喂性能。4、本发明采用先好氧发酵后厌氧发酵后的方法，将鸡粪发酵饲料中真蛋白含量从13.2％(132g/kg)提高到20.6％(206g/kg),远高于单纯的厌氧发酵后鸡粪发酵饲料中真蛋白含量(15.9％)。5、同时，本发明在发酵过程中将粗纤维、粗蛋白、淀粉等大分子物质分解转化成易消化吸收的葡萄糖、氨基酸等小分子营养物质，且能产生丰富的维生素及有机酸、酶、多肽等小分子营养物质。具体实施方式一、本发明涉及的培养基如下：(1)酵母菌液体培养基：葡萄糖(食品级)20g/l、蛋白胨8g/l、酵母提取物3g/l。(2)酵母菌固体培养基：葡萄糖(食品级)20g/l、蛋白胨8g/l、酵母提取物3g/l，1.5～2.0％琼脂。(3)乳酸菌液体培养基：葡萄糖(食品级)20g/l、牛肉膏5g/l、蛋白胨15g/l、酵母粉5g/l、氯化钠1g/l、硫酸锰0.05g/l、硫酸镁0.5g/l、k2hpo42g/l、乙酸钠2g/l、柠檬酸二铵2g/l、tween801ml/l、西红柿汁50ml。(4)乳酸菌固体培养基：葡萄糖(食品级)20g/l、牛肉膏5g/l、蛋白胨15g/l、酵母粉5g/l、氯化钠1g/l、硫酸锰0.05g/l、硫酸镁0.5g/l、k2hpo42g/l、乙酸钠2g/l、柠檬酸二铵2g/l、tween801ml/l、西红柿汁50ml、1.5～2.0％琼脂。二、本发明发酵鸡粪的步骤如下：(1)鸡粪的预处理：将鸡粪在70～100℃高温条件下热处理0.5～2h，杀灭病原菌和虫卵，保证发酵蛋白饲料的使用安全。(2)麸皮和玉米粉的预处理：麸皮和玉米粉均在60～80℃条件下干热处理5～8h。(3)发酵底物的混合：将预处理后的鸡粪、麸皮及玉米粉进行混合，重量比例为鸡粪5～7份、麸皮1～2份、玉米粉1～2份。保证混合后的混合物含水率达到50％，如果含水率未达到50％，需加适当的水进行调节；如果含水率过高，则适当加麸皮进行调节。保证该发酵底物混合后含水率达到50％的方法为：(1)定量计算：通过各原料的含水率及添加量，计算出混合后混合物料的含水率；(2)感官判断：手紧握混合物料，手指间有水滴但不能成水滴往下流，达到松手落地能散开的程度。(4)菌剂的准备：1)酵母菌选择三种菌种：异常威克汉姆酵母、热带假丝酵母、杰丁毕赤酵母；乳酸菌选择三种菌种：嗜酸乳杆菌、胚芽乳杆菌、香肠乳杆菌。将上述各菌种分别经上述酵母菌固体培养基和乳酸菌固体培养基活化(活化方法为：将长有菌种的斜面培养基从冷藏室取出，接种到新的固体培养基上，30℃下培养48h)。活化后，再在无菌条件下，分别取湿重100mg接种到500ml三角瓶对应的液体培养基中进行培养，28℃，200rpm,48h，培养至：各酵母菌经血细胞平板计数活菌数达到1.0×109个/ml以上，各乳酸菌经平板计数活菌数达到1.0×1010个/ml以上。2)将上述各酵母菌菌种按液体体积比：异常威克汉姆酵母：热带假丝酵母：杰丁毕赤酵母＝1:(2～3):(2～3)混合，作为菌剂a；将上述各乳酸菌菌种按液体体积比：嗜酸乳杆菌：胚芽乳杆菌：香肠乳杆菌＝1:1:1混合，作为菌剂b。(5)好氧固态发酵：将上述菌剂a按照5％(v/w)的添加量加入到步骤(2)所述的发酵底物中，充分混合，混匀后装入发酵容器中，并用灭菌的4层纱布遮盖，在20～35℃条件下进行好氧发酵24h～48h，发酵至肉眼可见发酵底物中长有大量白色菌丝，得好氧发酵物料。好氧发酵阶段，酵母菌在有氧条件下繁殖快速、菌体量多，可高效利用发酵底物中的可溶性糖、氨、尿酸等合成菌体蛋白，从而提高发酵底物中的真蛋白含量，并降低氨和尿酸等非蛋白氮含量。(6)厌氧固态发酵：好氧发酵结束后，在发酵物料中接入占发酵底物5％的菌剂b，在20～35℃条件下密封厌氧发酵48～96h，发酵至：发酵底物ph值达到4以下，具有浓郁的酒香味和乳香味，质地松散。厌氧发酵过程中，乳酸菌产生各种次生代谢酸性物质，降低好氧固态发酵物料的ph值，从而抑制病原微生物生长繁殖；同时，在此过程中，酵母菌产生酒香味物质，乳酸菌产生乳香味物质，进一步提高适口性。(7)上述发酵结束后，得鸡粪发酵产物，可根据实际情况，直接将发酵产物鲜料添加到饲料中，也可将脱水处理形成易储存的干料，再在需要时添加到饲料中。下面结合具体实施方式，对本发明进行进一步说明。实施例1：酵母菌的筛选鸡粪中粗蛋白含量为25％～30％,粗蛋白中含较多非蛋白氮，非蛋白氮又以氨化物和尿酸为主。因此，能否高效利用鸡粪中的碳氮氨化合物进行快速生长繁殖，能否高效将非蛋白氮转化为真蛋白，是选择酵母菌的关键。因此，本实施例利用鸡粪中的混合氮、氨化物及尿酸作为唯一的氮源对酵母菌进行筛选。1、制备不同氮源的培养基：(1)少量矿物质及微量元素液(mg/l)：cacl2·2h2017930；na2hp4·h2o6408；kh2po44272；mgso4·7h2o4920；fecl3·6h2o290；cuso4·5h2o20；mnso4·7h2o110。(2)鸡粪浸出液培养基：鸡粪浸出液：以新鲜鸡粪：水＝1:6，充分搅拌后过滤，液体为鸡粪浸出液，该浸出液中既有碳源又有混合氮源。按重量份数，取9份鸡粪浸出液，再加入1份上述少量矿物质及微量元素液，加琼脂18g/l，ph＝6.5～7.0，121℃灭菌30min。灭菌后制成平板，简称为固1。(3)分别以4g/l的(nh4)2so4、1.5g/l的尿酸作为氮源，分别加入葡萄糖10g/l、上述少量矿物质及微量元素液100ml，补充水至1l，琼脂18g/l，ph＝6.5～7.0，121℃灭菌30min。灭菌后制成平板，分别简称为固2、固3。(4)三种不同氮源液体培养基，除不加琼脂外，其他成分与上述固体培养基完全相同，下述分别简称为液1、液2、液3。2、酵母菌株的比选(1)酵母菌的选择选用下述共计8种酵母菌：异常威克汉姆酵母(wickerhamomycesanomalus,编号为a)；产朊假丝酵母(cyberlindnerajadinii,编号为b)；以上2种菌购于cgmcc。热带假丝酵母(candidautilis,编号为c)；酿酒酵母1(saccharomycescerevisiae，编号为e),酿酒酵母2(saccharomycescerevisiae，编号为js)；德巴利汉逊酵母(debaryomyceshansenii，编号为jrj)；库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii，编号为gj)；葡萄汁有孢汉逊酵母(hanseniasporauvarum，编号为pcj)，以上6株酵母菌为本实验室分离保存。(2)在酵母菌固体培养基中的生长将上述8株酵母菌活化后，各取一环分别接种到酵母菌的平板培养基上，28℃培养36h。再用接种环取一环菌液将各种酵母菌的单菌落分别接种到装有5ml液体培养基中，28℃，180rpm培养36h。将培养的各液体酵母菌分别接种到上述固1、固2、固3上，在28℃条件下培养72h后，观察不同酵母菌对不同氮源的利用情况及生长情况。根据菌落大小对上述各酵母菌在三种培养基生长情况进行打分。具体方法为：利用游标卡尺测定菌落直径，直径≧3mm为4分；直径在3～2mm为3分；直径2～1mm为2分；直径1～0.5mm为1分；直径＜0.5mm为0分。各酵母菌在不同氮源固体培养基上的生长情况打分如表1所示。具体如表1所示。表1不同酵母菌在各固体培养基上的生长情况从表1可以看出：a、b、c、e在各固体培养基上的生长情况均较好，其中，a、b、c生长相对最佳。(3)在酵母菌液体培养基中的生长再将上述各酵母菌分别接种1环到3种液体培养基中，28℃培养36h后，测定od值。相同培养基条件下，od值越高，细菌含量越好，结果如表2所示。表2各酵母菌在各液体培养基上的od540nm值菌种液1液2液3a0.1211.1081.122b0.1241.2001.128c0.1091.1161.108e0.0950.9831.102js0.0630.4200.532jrj0.0610.5580.601cj0.0710.8150.973pcj0.0660.6010.651(4)结果分析表2中，液1各菌的od值普遍低，原因可能是鸡粪浸出液培养基颜色较深，且空白值和含菌的鸡粪浸出液的颜色很接近，故用此方法说测值变化不太明显。根据各酵母菌在三种不同氮源的固体培养基和液体培养基上的生长情况，比选结果排序为：a、b、c、e、gj、pcj、jrj、js，前三株菌(a、b、c)在三种不同氮源固体培养基上和液体培养基中生长均比较好。根据编号其对应的菌名分别是：a为异常威克汉姆酵母、c为热带假丝酵母、b为产朊假丝酵母，这三株酵母菌作为发酵用菌株。3、酵母菌组合优选(1)按接种量的不同比例组合及编号，如下所示：处理1：只接异常威克汉姆酵母；处理2：只接产朊假丝酵母；处理3：只接热带假丝酵母；处理4：1/3异常威克汉姆酵母+1/3产朊假丝酵母+1/3热带假丝酵母；处理5:1/5异常威克汉姆酵母+2/5产朊假丝酵母+2/5热带假丝酵母；处理6:2/5异常威克汉姆酵母+1/5产朊假丝酵母+2/5热带假丝酵母；处理7：2/5异常威克汉姆酵母+2/5产朊假丝酵母+1/5热带假丝酵母。空白对照组：不接种酵母菌，其他发酵成分和培养条件均相同。(2)将各酵母菌按上述发酵鸡粪的好氧固态发酵方法，分别对等量鸡粪进行发酵，其中，鸡粪热处理条件为：85℃下60min；鸡粪7kg、麸皮1.5kg、玉米粉1.5kg；30℃下发酵36h。将上述7个处理组分别按照总接种量为5％(v/w)，加入发酵底物，30℃，好氧发酵36h。测定各组别鸡粪发酵的效果，如表3所示。表3各组别处理后鸡粪组分对比编号氨氮含量(g/kg)尿酸含量(g/kg)真蛋白含量(g/kg)处理11.219.11171处理20.627.23198处理30.937.54189处理40.877.94179处理50.707.01201处理60.928.03198处理70.817.66188空白对照组4.01591452发明人发现，在本发明的技术方案下，使用特定组合的酵母菌联合发酵，会产生未知协助作用，更有利于鸡粪发酵中真蛋白的形成。处理组2的真蛋白含量也较高，但实践中发现，处理组5不仅真蛋白含量更高，而且在风味上更佳，动物更喜采食，故选用处理5中所用的菌种配比。实施例2：乳酸菌的筛选(1)使用实施例1处理组5发酵鸡粪的方法对鸡粪在30℃下进行好氧发酵，发酵时长为36h。其中，鸡粪热处理条件为：85℃下60min；鸡粪70kg、麸皮15kg、玉米粉15kg；发酵后分为等量的5份。(2)将三种乳酸菌：嗜酸乳杆菌、胚芽乳杆菌、香肠乳杆菌，分别活化。在无菌条件下取湿重100mg接种到500ml三角瓶液体培养，200rpm,48h，培养至：各乳酸菌经平板计数活菌数达到1.0×1010个/ml以上。(3)根据接种量比例不同，各处理组如下所示：处理1：只接种嗜酸乳杆菌；处理2：只接胚芽乳杆菌；处理3：只接香肠乳杆菌；处理4：1/3嗜酸乳杆菌+1/3胚芽乳杆菌+1/3香肠乳杆菌；处理5：1/5嗜酸乳杆菌+2/5胚芽乳杆菌+2/5香肠乳杆菌；处理6：2/5嗜酸乳杆菌+1/5胚芽乳杆菌+2/5香肠乳杆菌；处理7：2/5嗜酸乳杆菌+2/5胚芽乳杆菌+1/5香肠乳杆菌。空白处理组：不接乳酸菌，其余操作与处理组相同。将上述各处理组和空白对照组，分别按5％(v/w)的接种量，接种到步骤(1)已完成好氧发酵的鸡粪中，使用上述发酵鸡粪中厌氧发酵的方法进行发酵，结果如表4所示。表4各组别的鸡粪组分对比根据现有技术教导，乳酸含量是发酵饲料抑菌的关键，快速产生乳酸最终形成较低的ph，在饲料发酵中尤为重要；ph≤4.5、乙酸含量＜40mmol/l、乳酸含量＞150mmol/l，是乳酸发酵成功的基本特征。由表4可以看出，除处理组3的乳酸含量略低外，其余处理组均能成功发酵；其中，处理组4乳酸含量明显高于其它组别，乙酸含量明显低于其它组别，ph也相对较低，发酵效果最佳。发明人推测，这可能是因为几种乳酸菌按特定比例联合使用时，产生了未知的协同作用，更有利于鸡粪发酵。因此，最终综合选择上述3种乳酸菌按1:1:1的比例混合使用。实施例3：鸡粪发酵效果展示1、按上述实施例1的处理组5制备菌剂a，实施例2的处理组4制备菌剂b。其中，按液体体积比，异常威克汉姆酵母：热带假丝酵母：产朊假丝酵母＝1:2:2；嗜酸乳杆菌：胚芽乳杆菌：香肠乳杆菌＝1:1:1。2、发酵底料的预处理：采集健康鸡排出的1～2d新鲜鸡粪，挑出大片鸡毛等异物后，将鸡粪分为等量的4组进行热处理：将鸡粪在100℃高温条件下热处理2h；将麸皮和玉米粉在80℃条件下干热处理6h。其中三组作为处理组，第四组作为厌氧对照组。3、发酵底料的混合：将含水率50％、预处理冷却至35℃的鸡粪、麸皮、玉米粉混匀。通过适当调节麸皮和水的量，使上述三者的混合物水分达到50％。4、对于各处理组，将菌剂a按照5％(v/w)添加入发酵底物中，将接种后的发酵底物置于通风处进行固体发酵36h，发酵至肉眼可见物料中长有白色菌丝，得好氧发酵物料。好氧发酵结束后，将好氧发酵物料与5％(v/w)的乳酸菌菌剂混合后装塑料袋或其它封闭容器中，逐层压实以排除空气，28℃条件下，密封厌氧发酵。发酵至：ph值达到4以下且具有浓郁的酒香味和乳香味，质地松散，即为发酵成功，得发酵鸡粪。5、对于厌氧对照组，将菌剂a按5％(v/w)、菌剂b按5％(v/w)，一起添加入发酵底物中，拌匀后装塑料袋或其它封闭容器中，逐层压实以排除空气，28℃条件下，密封厌氧固体发酵。6、上述各处理组和厌氧对照组对鸡粪的热处理条件、各原材料的添加量、好氧发酵的温度和时间、厌氧发酵的温度和时间，具体如表5所示。表5各组的具体条件7、结果检测(1)各处理组和厌氧对照组的鸡粪发酵前后组分对比如表6所示。表6各组鸡粪成分变化表从上表可以看出，鸡粪发酵后，与厌氧对照组相比，处理组的氨氮含量、尿酸含量、霉菌群明显减少，真蛋白含量明显提高。其中，处理组1的霉菌数量最少。(2)对发酵完成后的样品进行感官评定，从气味、质地和色泽分开评分，满分20分，分为4个等级：优等(16～20分)、尚好(10～15分)、中等(5～9分)、腐败(0～4分)。各处理组和厌氧对照组评分如表7所示。表7质量评分对比(3)饲喂效果将各处理组和厌氧对照组的发酵鸡粪添加到饲料中进行饲喂，饲料具体重量组分为：发酵鸡粪25份、豆粕30份、玉米粉20份、鱼粉5份、复合氨基酸0.03份、复合微量元素0.003份、复合维生素0.003份。同时，以相同组分，不添加发酵鸡粪，用12.5份豆粕+12.5份玉米粉替换25份发酵鸡粪，作为空白对照组。其中，猪用复合氨基酸、复合微量元素、复合维生素均购自山东启宏生物科技有限公司。用上述各组别饲料分别饲喂育肥猪(长白猪，2月龄，初始平均体重20kg，每个处理设置10个重复，各重复间体重±1kg)。各组别的饲喂次数、单次饲喂量相同。饲喂至出栏体重(100kg±2kg)时，停止饲养，记录饲养天数，根据重量和饲料用量计算料肉比。具体结果如表8所示。表8各组发酵鸡粪的饲料情况对比从上表可看出，添加了处理组发酵鸡粪的饲料，适口性好，动物喜食，采食后无不良症状；且5月龄时普遍可以出栏，比厌氧对照组提前出栏20余天，比空白对照组提前出栏25天左右；极大地节省了饲喂成本。另外，发明人在实践中发现，发酵鸡粪除做鲜饲使用外，将其脱水处理后，再饲喂猪牛羊，亦可得到良好的饲喂效果。因篇幅限制，在此不做详细说明。当前第1页12