本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种从高乌头中提取的二萜类生物碱化合物，本发明还涉及一种从高乌头中提取的二萜类生物碱化合物的制备方法和应用。
背景技术
中药高乌头来源于毛茛科(ranunculaceae)乌头属植物，又叫麻布七，是我国中西部地区著名“七药”之一，主要分布于陕西、青海、甘肃、四川、河南、云南等地。本属植物是一类极具药用价值的植物，其根在我国有着悠久的药用历史，具有具祛风除湿、理气止痛、活血散瘀之功效；用于治疗风湿痹痛、关节肿痛、跌打劳伤、急慢性菌痢、急慢性肠炎、瘰疬、疮疖等。现代药理学研究表明其具有抗炎镇痛、抗心律失常、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等作用。
本发明通过对高乌头总生物碱进行了系统分离，获得了一种新的二萜类生物碱化合物，其化学结构和抗氧化活性未见有过报道。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种从高乌头中提取的二萜类生物碱化合物。
本发明的第二个目的是提供一种从高乌头中提取的二萜类生物碱化合物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供从高乌头中提取的二萜类生物碱化合物的应用。
本发明所采用的第一个技术方案是，从高乌头中提取的二萜类生物碱化合物，分子式为c23h37no7、化学结构式如下：
化学结构式命名为：1α，4β，7β，8β-四羟基-6β，14α，16β-三甲氧基-19-氨乙基-乌头碱。
本发明所采用的第二个技术方案是，从高乌头中提取的二萜类生物碱化合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，总生物碱的制备
步骤1.1，取原材料麻布七的根部，干燥后粉碎得到粗粉，以体积分数为80％的乙醇为溶剂，进行粗粉的回流提取若干次，随后合并每次的提取液，减压回收溶剂，得到浸膏；
步骤1.2，将步骤1.1得到的浸膏分散于盐酸水溶液，并用石油醚萃取，萃取后水相用氨水调节，得到碱水相，再用三氯甲烷萃取碱水相得到总生物碱；
步骤2，总生物碱混合物样品的制备
将步骤1.2得到的总生物碱进行硅胶柱层析，使用梯度溶剂体系进行洗脱，按照500ml为一个流份接收，并第一次使用硅胶薄层层析检测，收集比移值rf＝0.65-1.0时显示黄色斑点的流份，得到总生物碱混合物样品；
步骤3，二萜类生物碱化合物粗品的制备
将步骤2得到的总生物碱混合物样品再次进行硅胶柱层析分离，使用梯度溶剂体系进行洗脱，按250ml为一个流份接收，并第二次使用硅胶薄层层析检测，收集比移值rf＝0.75-1.0时显示黄色斑点的流份，得到总生物碱混合物样品；
步骤4，纯化
将步骤3得到总生物碱混合物样品经高效液相色谱仪分离纯化，得到二萜类生物碱化合物。
本发明的特征在于，
步骤1.1中每千克的粗粉需要11-13升的80％的乙醇溶剂；
步骤1.1中回流提取的参数为：提取次数不少于3次，每次2h；
步骤1.2中盐酸水溶液的ph＝0.8，碱水相的ph＝10.26。
步骤2和3中梯度溶剂体系具体为：石油醚、丙酮、二乙胺三者的混合物，且石油醚、丙酮、二乙胺的体积比为50:1:0.1-1:1:0.1；
步骤2中第一次使用硅胶薄层层析检测的参数为：展开剂为石油醚-丙酮-二乙胺按照体积比为＝3:1:0.1的混合物、显色剂为碘化铋钾。
步骤3中第二次使用硅胶薄层层析检测的参数为：展开剂为石油醚-丙酮-二乙胺按照体积比＝2:1:0.1的混合物、显色剂为碘化铋钾。
步骤4中高效液相色谱仪分离纯化的条件为：
ch3oh/0.1％二乙胺h2o的体积比为30:70，色谱柱ymc-packr&dods-aymc-pack-ods-a，10mm×250mm，粒径5μm，流速1.0ml·min-1，20℃，207nm紫外检测。
本发明所采用的第三个技术方案是，从高乌头中提取的二萜类生物碱化合物在制备抗氧化药物中的应用。
本发明所采用的第四个技术方案是，从高乌头中提取的二萜类生物碱化合物在制备治疗关节炎的药物中的应用。
本发明所采用的第五个技术方案是，一种免疫抑制剂，主要组成成分为二萜类生物碱化合物，其分子式为c23h37no7、化学结构式如下：
化学结构式命名为：1α，4β，7β，8β-四羟基-6β，14α，16β-三甲氧基-19-氨乙基-乌头碱。
本发明的特征还在于
二萜类生物碱化合物能单独使用；也能与其他药物混合，制备成注射剂、或散剂、或丸剂、或片剂、或微囊剂、或软胶囊剂、或膜剂、或膏剂、或酊剂、或颗粒剂、或气雾剂。
本发明的有益效果是：本发明从高乌头中通过回流提取、萃取、硅胶柱层析和纯化等步骤首次提取出二萜类生物碱化合物，该化合物的活性实验显示其为治疗以关节炎为特征的自身免疫性疾病的潜在免疫抑制剂，表明其可以进一步作为新的免疫抑制剂进行研究开发，有很好实用价值。
附图说明
图1是本发明二萜类生物碱化合物的红外光谱图；
图2是本发明二萜类生物碱化合物的hmbc(h→c)和
其中图2a为hmbc(h→c)的示意图，图2b为
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种从高乌头中提取的二萜类生物碱化合物，分子式为c23h37no7、化学结构式如下：
化学结构式命名为：
1α，4β，7β，8β-tetrahydroxy-6β，14α，16β-trimethoxy-19-en-aconitane，
即1α，4β，7β，8β-四羟基-6β，14α，16β-三甲氧基-19-氨乙基-乌头碱。
一、本发明从高乌头中提取的二萜类生物碱化合物的制备过程如下：
制备本发明的二萜类生物碱化合物(简称gwtj1)的原料为采自陕西省宝鸡市太白县麻布七根，将原料经粉碎成粗粉后，取5.0公斤，加入体积60升、浓度为80％的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得浸膏。将浸膏分散于盐酸水溶液(ph0.8)中，用石油醚萃取该水溶液，萃取后水相用氨水调至ph＝10.26，再用三氯甲烷萃取碱水相得到总生物碱(256g)。
将总生物碱进行硅胶柱层析，梯度溶剂体系(石油醚/丙酮/二乙胺＝50:1:0.1-1:1:0.1)进行洗脱，按500ml为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检测(展开剂：石油醚-丙酮-二乙胺体积比为＝3:1:0.1，显色剂为碘化铋钾)，收集rf值在0.65-1.0处显示黄色斑点的流份，即为含化合物gwtj1的总生物碱混合物，减压蒸干溶剂后得40克样品。
将样品采用硅胶柱层析分离，按250ml为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检测(展开剂：石油醚-丙酮-二乙胺体积比＝2:1:0.1，显色剂为碘化铋钾)，收集rf值在0.75-1.0处显示黄色斑点的流份，即为化合物gwtj1粗品，减压蒸干溶剂后得50克样品。
最后将50g样品经高效液相色谱仪(戴安公司)分离纯化，hplc条件为：ch3oh/0.1％二乙胺h2o＝30:70，色谱柱ymc-packr&dods-aymc-pack-ods-a，10mm×250mm，粒径5μm，流速1.0ml·min-1，20℃，207nm紫外检测，得到gwtj1的纯品20.8mg。
二、对于上述制备的纯品二萜类生物碱化合物(gwtj1)的结构进行鉴定：
1.红外光谱鉴定
化合物gwtj1为白色无定形粉末，碘化铋钾反应阳性，雷式铵盐反应阳性，硅钨酸反应阳性，如图1所示，为化合物gwtj1的红外光谱图，图1表明：红外光谱在3127cm-1、2946cm-1、2835cm-1、1454cm-1和1028cm-1的特征吸收谱带，表明该化合物为二萜类c-18型生物碱。
2.高分辨质谱鉴定
高分辨质谱(hr-esi-ms)得到分子量440.2653[m+h]+，结合表1的核磁共振数据13c-nmr(125mhz，cdcl3)，确定其分子式为c23h37no7。
3.核磁共振鉴定
分析化合物gwtj1的1hnmr谱数据，如表1所示：
δh1.08(3h，t，j＝7.25)，δh2.81(1h，m)，δh2.97(1h，m)表明化合物结构中有一个-nhch2ch3；
δh3.33(3h，s)，3.36(3h，s)和3.39(3h，s)表明化合物结构中含有三个-och3；
δh3.61(1h，dd，j＝4.08，4.41)表明化合物中有hβ-c(14)。
同时，结合13c-nmr的信号，显示共有24个c原子。其中，δc56.5，57.9和58.3归于三个-och3，剩下的信号显示此化合物为乌头类生物碱。δc50.6，δc13.8归于-nhch2ch3上c原子的信号，δc70.4，72.6，78.7和88.2归于四个连-oh的c原子。
结合该化合物gwtj1的二维谱图(hsqc，hmbc，noesy及1h-1hcosy)归属了其苷元上所有的碳、氢信号。如图2所示，在hmbc谱中，h-3(δh1.83，2.15)，h-5(δh1.76)，h-17(δh2.75)，h-20(δha2.81，δhb2.98)与c-19(δc61.3)相关，推测c-19与-nh-ch2-ch3相连；-och3(δh3.36)与c-6(δc90.3)、-och3(δh3.39)与c-14(δc84.7)、-och3(δh3.33)与c-16(δc83.2)相关，推测三个-och3分别连接在c-6、c-14和c-16上；h-3(δha1.83，δhb2.15)，h-5(δh1.76)和h-17(δh2.75)与c-1(δc72.7)相关，h-3(δha1.83，δhb2.15)、h-5(δh1.76)、h-6(δh4.12)和h-19(δh2.70)与c-4(δc70.4)相关，h-5(δh1.76)、h-6(δh4.12)和h-15(δha1.73，δhb2.60)与c-7(δc88.2)相关，h-6(δh4.12)、h-9(δh2.92)、h-10(δh1.97)、h-14(δh3.61)、h-15(δha1.73，δhb2.60)和h-17(δh2.75)与c-8(δc78.4)相关，推测四个-oh分别连接在c-1，c-4，c-7和c-8上。
同时，在rosey谱中，h1/h-3，h-1/h-5，h-1/h-10，h-10/h-14和h-14/h-9的roe关联式表明了h-1，h-9，h-10和h-14为β-构型，1-oh和14-och3为α-构型；h-6/h-17和h-16/h-7的roe关联式表明h-6和h-16为α-构型，6-och3和16-och3为β-构型。
表1式ι化合物的1h和13c核磁共振数据(测试溶剂：cdcl3)
综上数据分析：化合物gwtj1的化学结构确定为1α，4β，7β，8β-四羟基-6β，14α，16β-三甲氧基-19-乙氨基-乌头碱。
三、对于制备的纯品二萜类生物碱化合物(gwtj1)进行体外抗炎试验
1.mtt法检测细胞毒性作用
小鼠脾脏淋巴细胞4×105个/孔接种于96孔板中，分别加入100、20、0.8、0.4、0.16μmol/l五种不同浓度的样品，给药100μl/孔，每个浓度设3个复孔。
另设溶剂对照及培养液本地对照。37℃，5％co2培养箱中培养48h。结束培养前4小时加入20μl5mg/mlmtt，培养结束时吸出150μl培养液，上清液再加入150μldmso，作用10min后，酶标仪于570nm处测定od值。采用spss16.0计算半数细胞死亡时浓度(cc50)为702.2μmol/l。
2.cona诱导脾淋巴细胞活性测定
小鼠脾脏淋巴细胞4×105个/孔接种于96孔板中，分别加入100、20、0.8、0.4、0.16μmol/l不同浓度的样品，给药50μl/孔，同时加入cona(终浓度2μg/ml)，每个浓度设3个复孔，总体积200μl，另设相应的溶剂对照及无刺激本底对照。37℃，5％co2培养箱中培养48h，培养结束前8h掺入0.25μlci3h-thymidine，培养结束时，将培养板冻存于-20℃冰箱。测定时将冻融的细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于beta计数仪读取掺入细胞dna的3h-thymidine，以cpm值代表细胞增殖情况。
采用spss16.0计算半数有效抑制浓度(ic50值)为1.515μmol/l。
3.lps诱导脾淋巴细胞活性测定
小鼠脾脏淋巴细胞4×105个/孔接种于96孔板中，分别加入100、20、0.8、0.4、0.16μmol/l不同浓度的样品，给药50μl/孔，同时加入lps(终浓度1μg/ml)，每个浓度设3个复孔，总体积200μl，另设相应的溶剂对照及无刺激本底对照。37℃，5％co2培养箱中培养48h，培养结束前8h掺入0.25μlci3h-thymidine，培养结束时，将培养板冻存于-20℃冰箱。测定时将冻融的细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于beta计数仪读取掺入细胞dna的3h-thymidine，以cpm值代表细胞增殖情况。
采用spss16.0计算半数有效抑制浓度(ic50值)为4.417μmol/l。
由上可知，二萜类生物碱化合物在制备抗氧化药物中的应用；该化合物的活性实验显示该化合物是治疗以关节炎为特征的自身免疫性疾病的潜在免疫抑制剂，表明其可以进一步作为新的免疫抑制剂进行研究开发。
二萜类生物化合物可单独使用或与其他药物混合，配制成注射剂、或散剂、或丸剂、或片剂、或微囊剂、或软胶囊剂、或膜剂、或膏剂、或酊剂、或颗粒剂、或气雾剂。