本发明涉及一种病毒检测试剂盒及其应用，特别涉及一种用于同时检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的一步直扩taqman实时荧光定量rt-pcr(探针法实时-定量聚合酶链反应)试剂盒，本发明还涉及该试剂盒在检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒中的应用。本发明属于分子生物学检测技术领域。
背景技术：
口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus,fmdv)与塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirus，svv)感染猪能引起猪的原发性水泡病，临床症状类似，二者无法区别。svv先后在美国(2015、2016、2017年)、加拿大(2007、2011、2015、2016年)、巴西(2014、2015年)、哥伦比亚(2016年)、中国(2015、2016、2017年)和泰国(2016年)等国家引发疫情。2015年，传入中国以来，2015-2016年呈散发，2017年以来，svv先后在福建、广东、广西、河南(11个县区)、河北、山东、辽宁等省迅速扩散开来，引起大量猪场发病，且存在svv和fmdv混合感染病例。然而，至今svv的流行原因仍然不明，还没有商品化的疫苗和诊断试剂可用，svv仍然处于失控状态，svv防控形式严峻。并且因临床发病症状与口蹄疫相似，且能混合感染，对口蹄疫防控形成严重干扰。
常规的病原学诊断方法主要有病毒的分离与鉴定、病毒抗原检测等，每种诊断方法都有其适用的范围。用常规病原学方法对血液、淋巴结等病毒含量低微的样品进行检测，往往得不到正确的结果。已有的rt-pcr检测方法只能进行定性检测不能做精确定量分析，且扩增后需要经过电泳判断结果，每次检测的样品数量较少、对低含量的样品分辨率不足。
本发明针对目前的现状，在长期研究的基础上，建立并优化出一种简捷、廉价、敏感的可用于口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒检测的real-timert-pcr方法，并组装成试剂盒。该方法无需体外使用rna提取试剂盒提取rna、无需反转录，在同一反应管内就可完成反转录和pcr的过程，通过荧光信号的变化实时检测pcr扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，结果更为准确直观，且无需电泳观察结果。大大缩短了时间和减少了污染的机率。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术不能适应快速、敏感和准确及定量检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的缺点，从而提供一种能够快速、敏感、准确以及定量地检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的taqman实时荧光定量rt-pcr试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用方法。
为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：
本发明的一种用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的一步直扩taqman实时荧光定量rt-pcr试剂盒，其包含分别用于检测口蹄疫病毒以及塞尼卡谷病毒的引物以及探针，其中用于检测塞尼卡谷病毒的引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，下游引物的的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述的探针的核苷酸序列如seqidno.5所示；用于检测口蹄疫病毒的引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示，下游引物的的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述的探针的核苷酸序列如seqidno.6所示。
其中，优选的，所述的试剂盒中还包含核酸提取液、2×directqrt-pcrmix、酶混合液、阳性对照以及阴性对照。
其中，优选的，所述探针的5’端标记荧光报告基团；所述探针的3’端标记小沟结合物和荧光淬灭基团。
其中，优选的，用于检测口蹄疫病毒以及塞尼卡谷病毒的引物以及探针按照摩尔比1:1:1:1:1:1混合，其终浓度均为10pmol/μl。
其中，优选的，用于检测塞尼卡谷病毒的探针的5’端标记荧光报告基团hex；所述探针的3’端标记小沟结合物mgb和荧光淬灭基团bhq-1，用于检测口蹄疫病毒的探针的5’端标记荧光报告基团fam；所述探针的3’端标记小沟结合物mgb和荧光淬灭基团bhq-1。
其中，优选的，所述的核酸提取液按照以下方法制备得到：将异硫氰酸胍25g溶于33mlcsb缓冲液中，混合至完全溶解，其中csb缓冲液中含有：42mm柠檬酸钠；0.83％w/vn-laurylsarcosine(十二烷基肌氨酸钠)；0.2mmβ-巯基乙醇。
其中，优选的，所述的阳性对照为含有seqidno.7以及seqidno.8所示序列的质粒，所述的阴性对照为无rna酶水。
进一步的，使用本发明所述的taqman实时荧光定量rt-pcr试剂盒检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒时，按照以下步骤进行：
(1)pcr总体系为50μl，包括：
a.2×directqrt-pcrmix：37μl；b.混合酶液:2μl；c.浓度均为10pmol/μl的引物以及探针的混合液：6μl，将上述成分分别依次加入到0.2ml扩增管中；
(2)向步骤(1)的扩增管中加入加待检样本5μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环，同时设立阴性对照以及阳性对照，直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果；
(3)结果分析
根据扩增结果判定：单独选取fam，在阴性对照没有ct值的情况下，ct值≤35判为口蹄疫病毒阳性；ct值>35为口蹄疫病毒阴性；单独选取hex，在阴性对照没有ct值的情况下，ct值≤35判为塞尼卡谷病毒阳性；ct值>35为塞尼卡谷病毒阴性。
其中，优选的，所述的待检样本为经过核酸提取液处理后的样本。
更进一步的，本发明还提出了所述的taqman实时荧光定量rt-pcr试剂盒在制备同时检测口蹄疫病毒以及塞尼卡谷病毒试剂中的用途。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明建立了一种用于同时检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的一步直扩taqman实时荧光定量rt-pcr试剂盒，具有简单快速、易操作、结果直观、灵敏度高、稳定性好、实时定量等优点。主要体现在以下方面：
(1)本发明试剂盒包含了快速制备rna的试剂，适用于从动物血液中和组织病料中直接提取病毒rna，并用于后续的qrt-pcr扩增和检测，整个提取过程无需有机溶剂抽提，无需乙醇沉淀，简便，快捷，而且质量稳定可靠；
(2)使用本发明的试剂盒检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒，用户无需额外提取病毒rna，无需反转录，只需将待检样品加入反应管中，利用荧光信号的变化实时检测pcr扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，即可计算待检样品拷贝数，结果更为准确直观，省时省力，成本较低，时间由原来的3-4小时缩短到1-1.5小时。并且比普通pcr的灵敏度高，最低检测量为13拷贝，可用于检测低微含量样品的口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒；
(3)与sybr等染料法荧光定量pcr技术相比，taqmanqpcr具有更好的特异性，并能缩短反应时间；一般探针的淬灭基团为tamra，tamra本身为荧光染料，在淬灭报告基团的同时，自身会在更高波长处发射荧光，此发射荧光会对报告基团的检测造成影响，探针荧光本底相对较高，本发明使用的淬灭基团bhq-1为非荧光染料，自身身不发射荧光，因此，探针荧光本底低，信噪比更大，检测灵敏度更高；
(4)同时本发明使用了mgb，能提高探针tm值，从而可缩短探针长度，有利于探针设计，且提高了配对与非配对模板间的tm值差异，使实验结果更稳定和精确；
(5)本发明参照genbank(基因库)查找svv和fmdv毒株，经序列比对寻找每个序列上均保守的区域，选取保守区域分别设计并筛选出一对扩增引物，一条探针引物，然后本发明通过反复试验以及引物浓度和探针浓度的优化，使得：1)制作标准曲线的相关系数r2大于0.98；斜率位于-3--3.5之间；pcr扩增效率e位于0.9-1.2之间，符合线性关系、扩增效率要求；2)35cycles内可得到好的定量结果，符合灵敏度要求；3)阴性对照35cycles内无引物二聚体产生，符合阴性要求。
本发明的试剂盒不仅适用于科研单位定量分析，而且适合于各级防控单位，基层兽医站，大中型养殖场等的病原检测分析，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明制作的标准曲线；
图2为本发明试剂盒的敏感性分析结果；
梯度稀释阳性质粒：1:10-5稀释；2:10-6稀释；3:10-7稀释；4:10-8稀释；5:10-9稀释；6:10-10稀释；7:ntc；
图3为本发明试剂盒的特异性检测fam荧光信号；
1.口蹄疫与塞尼卡谷病毒混合物；2.口蹄疫o型；3.口蹄疫a型；4.口蹄疫asia1型；5.塞尼卡谷病毒；
图4为本发明试剂盒的特异性检测hex荧光信号。
1.口蹄疫与塞尼卡谷病毒混合物；2.口蹄疫o型；3.口蹄疫a型；4.口蹄疫asia1型；5.塞尼卡谷病毒。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的对骨质疏松症的预防和治疗作用的优点和特点。但实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1引物以及探针的设计和制备
参照genbank(基因库)查找svv毒株和fmdv毒株，经序列比对寻找每个序列上均保守的区域，选取保守区域分别设计并筛选出一对扩增引物，一条探针引物，序列如下：
扩增svv毒株的引物序列为：
上游引物：5’-ggccgccacgctatctaaccaa-3’(seqidno.1所示)，
下游引物：5’-cacgggcccgagcttcttcatc-3’(seqidno.2所示)。
探针引物序列为：5’-cttcagtgaaagctc-3’(seqidno.5所示)。
扩增fmdv毒株的引物序列为：
上游引物：5’-tccggaccagacgagta-3’(seqidno.3所示)，
下游引物：5’-cccaacgcaggtagagtg-3’(seqidno.4所示)。
探针引物序列为：5’-cggcgtctctttga-3’(seqidno.6所示)。
上述引物及探针序列由大连宝生物工程有限公司合成并进行标记，用于检测塞尼卡谷病毒的探针的5’端标记荧光报告基团hex；所述探针的3’端标记小沟结合物mgb和荧光淬灭基团bhq-1，用于检测口蹄疫病毒的探针的5’端标记荧光报告基团fam；所述探针的3’端标记小沟结合物mgb和荧光淬灭基团bhq-1。
实施例2用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的一步直扩taqman实时荧光定量rt-pcr试剂盒的组装
1、将实施例1制备的seqidno.1-4所示的引物和seqidno.5-6所示的探针按照摩尔比1:1:1:1:1:1混合，且引物以及探针的浓度均为10pmol/μl。
2、核酸提取液：
将异硫氰酸胍25g溶于33mlcsb缓冲液中，混合至完全溶解。其中csb缓冲液中含有：42mm柠檬酸钠；0.83w/v％n-laurylsarcosine(十二烷基肌氨酸钠)；0.2mmβ-巯基乙醇。
3、2×directqrt-pcrmix
4、混合酶液
5、标准阳性质粒
标准阳性质粒按照以下步骤制备得到：
a.在上述引物(seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3、seqidno:4)两侧的基因组序列上，分别设计一对扩增引物svv-f、svv-r和fmdv-f、fmdv-r，其扩增片段长度分别为397bp和109bp，用于构建阳性对照及标准曲线制作，涵盖了荧光定量引物扩增片段的全部，克隆引物如下：
svv-f：5’-cttggccgccacgctatct-3’(seqidno.7所示)；
svv-r：5’-atgagccaaagccacgggc-3’(seqidno.8所示)。
fmdv-f：5’-ctgtggcaggactcgccgt-3’(seqidno.9所示)；
fmdv-r：5’-caacgcaggtagagtgatct-3’(seqidno.10所示)。
b.以塞尼卡谷病毒阳性样品rna(即命名为ch-fj-2017株ky747510)为模板，利用seqidno.4及seqidno.5作为引物进行扩增，获得的产物用于构建标准阳性质粒；其中50μl反应体系为：primescriptonestepenzymemix：2μl，2×onestepbuffer：25μl，seqidno:4(10μm)：2μl，seqidno:5(10μm)：2μl，模板rna：5μl，无核酸酶蒸馏水：补足至50μl。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性50s,55℃退火30s,72℃延伸1min,共30个循环；72℃再延伸10min，4℃5min。pcr产物于10g/l的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。所述扩增引物扩增出的条带序列为seqidno.11所示。
以口蹄疫病毒阳性样品rna(o/mya98/by/2010株)为模板，利用fmdv-f及fmdv-r作为引物进行扩增，获得的产物用于构建标准阳性质粒；其中50μl反应体系为：primescriptonestepenzymemix：2μl，2×onestepbuffer：25μl，fmdv-f(10μm)：2μl，fmdv-r(10μm)：2μl，模板rna：5μl，无核酸酶蒸馏水：补足至50μl。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性50s,55℃退火30s,72℃延伸1min,共30个循环；72℃再延伸10min，4℃5min。pcr产物于10g/l的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。所述扩增引物扩增出的条带序列为seqidno.12所示。
c.pcr产物的克隆及序列分析
pcr产物用胶回收试剂盒回收，与pmd-18t克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，涂布于含100mg/l氨苄青霉素的lb培养基平板上，37℃培养12～16h。经蓝白斑筛选后，用质粒提取试剂盒提取质粒，将序列测定为阳性的质粒命名pmd-397以及pmd-109，即为标准阳性质粒。
6、阴性对照：无rna酶水。
实施例3本发明的taqman实时荧光定量rt-pcr试剂盒在检测fmdv和svv中的应用
1、标准曲线的制作
a.对pmd-397以及pmd-109标准阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其为：10-1-10-15，每个梯度重复三次进行定量pcr。
b.根据扩增情况从中选取5-6个点制作适合标准曲线要求的标准曲线。如图1所示。
2、样本检测
(1)pcr总体系为50μl：
a.2×directqrt-pcrmix：37μl；b.混合酶液:2μl；c.浓度均为10pmol/μl的引物与探针的混合液：6μl，将上述成分分别依次加入到0.2ml扩增管中；
(2)向上述扩增管中加入加待检猪蹄部水泡液5μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环，同时设立阴性对照以及阳性对照。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
3、结果分析
根据扩增结果判定：单独选取fam，在ntc没有ct值的情况下，ct值≤35判为口蹄疫病毒阳性；ct值>35为口蹄疫病毒阴性；单独选取hex，在ntc没有ct值的情况下，ct值≤35判为塞尼卡谷病毒阳性；ct值>35为塞尼卡谷病毒阴性。
实施例4本发明的taqman实时荧光定量rt-pcr试剂盒在检测svv中的应用
1、标准曲线的制作
同实施例3
2、样本检测
(1)用核酸提取液处理待检猪水泡皮
向1.5mlep管中加入5-10mg猪吻突部水泡皮(约与半个绿豆相当)，然后加入100μl核酸提取液，并用组织研磨器充分研磨。研磨结束后，继续向研磨液中加入100μl核酸提取液，涡旋混匀，之后将提取物于常温下12000rpm离心2min，取100-150μl上清于干净的ep管中。此上清液作为模板即可进行后续的qpcr检测，必须现处理现用。
(2)pcr总体系为50μl
a.2×directqrt-pcrmix：37μl；b.混合酶液:2μl；c.引物和探针浓度均为10pmol/μl的引物和探针的混合液：6μl，将上述成分分别依次加入到0.2ml扩增管中；
(3)分别向上述不同扩增管中加入直接加用核酸提取液处理的待检猪吻突部水泡皮液5μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
(4)结果分析
根据扩增结果判定：根据扩增结果判定：单独选取fam，在ntc没有ct值的情况下，ct值≤35判为口蹄疫病毒阳性；ct值>35为口蹄疫病毒阴性；单独选取hex，在ntc没有ct值的情况下，ct值≤35判为塞尼卡谷病毒阳性；ct值>35为塞尼卡谷病毒阴性。
实施例5本发明试剂盒的敏感性检测
(1)pcr总体系为50μl：
a.2×directqrt-pcrmix：37μl；b.混合酶液:2μl；c.浓度均为10pmol/μl的引物与探针的混合液：6μl，将上述成分分别依次加入到0.2ml扩增管中；
(2)分别向上述不同扩增管中加入梯度稀释(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10)的标准阳性质粒pmd-397或pmd-1095μl，无rna酶水5μl(阴性对照)，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增:50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
(3)结果分析
根据扩增结果判定：根据扩增结果判定：单独选取fam，在ntc没有ct值的情况下，ct值≤35判为口蹄疫病毒阳性；ct值>35为口蹄疫病毒阴性；单独选取hex，在ntc没有ct值的情况下，ct值≤35判为塞尼卡谷病毒阳性；ct值>35为塞尼卡谷病毒阴性。
由图2可以看出，阳性对照(1.9×1010拷贝/微升)在10-9稀释的条件，按照试剂盒的判定标准，仍为阳性，说明该方法最低检测量为19拷贝。
实施例6本发明试剂盒的特异性检测
(1)pcr总体系为50μl
a.2×directqrt-pcrmix：37μl；b.混合酶液:2μl；c.浓度均为10pmol/μl的引物与探针的混合液：6μl，将上述成分分别依次加入到0.2ml扩增管中；
(2)分别向上述不同扩增管中加入口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒灭活抗原的混合物、口蹄疫o型灭活抗原、口蹄疫a型灭活抗原、口蹄疫asia1型灭活抗原、塞尼卡谷病毒灭活抗原5μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增:50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环，同时设立阴性对照以及阳性对照。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
(3)结果分析
根据扩增结果判定：单独选取fam，在ntc没有ct值的情况下，ct值≤35判为口蹄疫病毒阳性；ct值>35为口蹄疫病毒阴性；单独选取hex，在ntc没有ct值的情况下，ct值≤35判为塞尼卡谷病毒阳性；ct值>35为塞尼卡谷病毒阴性。
由图3和图4可以看出，该方法在检测混合有口蹄疫和svv的抗原中，均有fam和hex荧光信号；在检测口蹄疫o型、a型及asia1型灭活抗原中，只有fam荧光信号；在检测svv灭活抗原中，只有hex荧光信号，说明该方法具有良好的有特异性。
序列表
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的实时荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用
<130>klpi180234
<160>12
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