本发明属于微生物发酵工程技术领域，涉及一种能够实现纤维素酶高产的密丝明孢曲霉以及采用该密丝明孢曲霉进行发酵生产纤维素酶的方法。
背景技术：
秸秆等木质纤维素废弃物的资源化利用不仅能够降低其对环境的负面影响，还能成为可再生、可持续能源的有效来源。对于第二代生物乙醇生产，木质纤维素已成为最可行的技术选择(belal,e.b.bioethanolproductionfromricestrawresidues.brazjmicrobiol.2013,44(1):225-234)。木质纤维素乙醇化过程中，利用纤维素酶对木质纤维素进行水解，并将水解产物发酵制备生物乙醇；其中，纤维素酶的生产直接影响到木质纤维素的水解以及后续发酵过程，是乙醇化技术大规模应用的主要限制环节(novyv,longusk,nidetzkyb.2015)。
纤维素由一千个左右的葡萄糖分子聚合而成，而纤维素酶能水解纤维素生成小分子的葡萄糖(周俊强邱忠平韩云平等，纤维素降解菌的筛选及其产酶特性.环境工程学报,2010,(03):705-708)。目前，生产纤维素酶的菌种主要有真菌和细菌两大类，其中真菌所产纤维素酶具有较高的催化效率(谢占玲，吴润,纤维素酶的研究进展.草业科学，2004,21(4):72-76)，和细菌不同的是，绝大多数真菌所产纤维素酶都是胞外酶，这又使得低成本分离活性液态酶变为可能(韩学易陈惠吴琦,等.产纤维素酶枯草芽孢杆菌c-36的产酶条件研究.四川农业大学学报,2006,(02):178-181)。利用真菌产纤维素酶正被广泛地应用于发酵产糖和生物乙醇的工业生产中(f.talebnia,d.karakashev,i.angelidaki,productionofbioethanolfromwheatstraw:anoverviewonpretreatment,hydrolysisandfermentation.bioresourtechnol,2010,101:4744-4753)。已分离筛选的多种产纤维素酶的真菌菌种包括孢霉属、毛壳霉属、绿色木霉、康氏木霉、青霉、白腐菌、镰刀菌和根霉等(murashimak,nishimurat,nakamuray,etal.，2002purificationandcharacterizationofnewendo-1,4-β-d-glucanasesfromrhizopusoryzae.enzymemicrobtech30:319–326；兰时乐陈娴李慧，2003产纤维素酶菌种tp1202的选育及产酶条件研究,2003,13(2):12-13；kovacsk,marcellis,szakacsgetal.，2009enzymatichydrolysisofsteam-pretreatedlignocellulosicmaterialswithtrichodermaatrovirideenzymesproducedin-house，《biotechnologyforbiofuels》,2009,2(1):14)。
然而现有生产纤维素酶的真菌多以复合菌剂为主，其生产过程中有时需要同时添加纤维素酶以提升对木质纤维素的酶解率，从而提高最终的乙醇得率，这必将增加生产成本，影响企业经济效益。
因此，研究一种可以实现纤维素酶高产的单一真菌菌株是很有意义的。
技术实现要素：
本发明的目的旨在，针对目前缺少制备纤维素酶单一菌株的技术现状，提供一种可以实现高纤维素酶高产的密丝明孢曲霉sartoryavuillw-10。
上述密丝明孢曲霉，已于2016年1月7日提交保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chniageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保存编号为cgmccno.11991，分类命名为密丝明孢曲霉sartoryavuillw-10。
上述密丝明孢曲霉，可以本领域常规手段确定其种属。
经研究发现，上述密丝明孢曲霉在种子(pda，potatodextroseagar)培养基上生长较快，在30℃条件下恒温培养2-3天菌落直径达3-4cm。菌丝层较薄，初生菌丝为白色，后期菌落呈灰褐色，菌落背面无色；密丝明孢曲霉具有双层小梗的分生孢子头，分生孢子呈长链状，子囊果呈菌核状，子囊孢子呈扁球形或球形，子囊孢子无色。
本发明采用的种子培养基的制备过程为：蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母膏10g、氯化钠0.5g，七水硫酸亚铁0.005g、氯化钙0.3g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾2g的比例配制得到种子培养基预混物，用去离子水定容到1000ml，并利用1mol/l的盐酸和1mol/l的氢氧化钠溶液调节种子培养基预混物的ph值为7，然后于121℃灭菌20min，冷却后即得种子培养基；获得的种子培养基可以放置于4℃进行贮存备用。
本发明的另一目的在于提供一种采用上述密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法，具体步骤如下：
(1)配制培养基：按照硝酸钾4g、乳糖或葡萄糖4g、尿素0.2g、磷酸氢二钾1.5g、mandel’s营养液2～6ml、麸皮4～12g、硫酸镁0.5g、氯化钙0.3g、氢氧化钠预处理后的秸秆粉30g的比例配制得到培养基，用去离子水定容至1000ml，并利用无机酸调节培养基的ph值为2.5～3.5；
(2)接种密丝明孢曲霉种子液：按照培养基体积的8～15％，将密丝明孢曲霉种子液接种于步骤(1)制备的培养基中；
(3)制备纤维素酶：将接种密丝明孢曲霉的培养基于45～55℃、180r/m条件下发酵6～8天即得含有纤维素酶的粗酶液。
上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法，以硝酸钾、尿素为氮源，以乳糖或葡萄糖、麸皮、秸秆粉为碳源，以磷酸二氢钾为磷源，以磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙作为无机盐来源。
上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法，可以采用本领域已经披露的常规手段获得mandel’s营养液(参考文献糖蜜酒精扉页诱导康氏木霉产纤维素酶的研究，林元山，广西大学，硕士学位论文，2004)。
上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法，可以采用本领域已经披露的常规手段获得氢氧化钠预处理后的秸秆粉(参考文献yliu，zqiu，gwangoptimizedalkalinepretreatmenttechnologyofricestrawforethanolproduction[j]advancesinengineeringresearch2015，1169-1173)。
上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法，所述无机酸为盐酸、硝酸或硫酸，其浓度为1mol/l～5mol/l。
上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法，所述步骤(1)中，按照40～60ml/250ml的装瓶量，将配制的培养基分装到发酵容器中。
上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法，所述步骤(2)中，可以采用本领域已经披露的常规手段获得密丝明孢曲霉种子液(参考文献王梅；石璟；谭德水，等，枯草芽孢杆菌msj-5产β-甘露聚糖酶的性质研究[j]福建农业学报，2015年第03期)
上述采用密丝明孢曲霉发酵产纤维素酶的方法，所述步骤(3)中，可以进一步对发酵所得产物进行离心以去除固形物；离心转速3500～4000r/min，离心时间为5～10min。
本发明进一步提供了上述方法制备的纤维素酶在制备生物乙醇中的应用，并进一步说明了采用上述纤维素酶制备生物乙醇的制备过程，分别由密丝明孢曲霉(sartoryavuillw-10)和黑曲霉(aspergillusniger)发酵分别得到含有纤维素酶和纤维二糖酶的粗酶液；再利用纤维素酶和纤维二糖酶共同酶解经2％氢氧化钠预处理后的秸秆；同时利用酿酒酵母对秸秆进行同步糖化发酵，即可制得生物乙醇。具体的生物乙醇的制备过程为：以秸秆残渣作为底物，将底物、含有纤维素酶的粗酶液加入到发酵容器中得到底物浓度为40～100g/l的混合液，并利用无机酸(与前述一样)和氢氧化钠溶液调节混合液的ph值为5～6，于30～50℃、120～180r/min条件下添加吐温-80非离子型表面活性剂、含有纤维素二糖酶的粗酶液和酿酒酵母，同步糖化发酵3～4天，即得生物乙醇；所述吐温-80的终浓度为1～10g/l；每克底物中纤维素酶的纸滤酶活力为5～15fpu、纤维二糖酶酶活力为5～15cbu；所述酿酒酵母终浓度为8g/l。
上述生物乙醇的制备过程中，所述氢氧化钠处理后的秸秆粉(也即秸秆残渣)是由秸秆通过本领域已经披露的常规手段处理得到(参考文献yliu，zqiu，gwangoptimizedalkalinepretreatmenttechnologyofricestrawforethanolproduction[j]advancesinengineeringresearch2015，1169-117)。本发明采用的处理方法为：先将秸秆粉碎后过20目筛，过筛后产物于60℃风干至恒重，再用浓度为2％的naoh溶液于100℃条件下预处理2h后分离出残渣，即可。
上述生物乙醇的制备过程中，所述含有纤维素二糖酶的粗酶液是由黑曲霉发酵得到，其发酵过程可以采用本领域已经披露的常规手段(参考文献孟勇，王忠彦，苗艳芳，胡承关于黑曲霉生产纤维二糖酶发酵条件的研究，《四川大学学报(自然科学版)》，2002,39(5)；938～942)。
本发明采用的秸秆为水稻秸秆或/和小麦秸秆。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过提供的密丝明孢曲霉(sartoryavuillw-10)单一菌株发酵便可以获得纤维素酶，不需要额外添加用于提升木质纤维素酶得率的纤维素酶，有助于降低生产成本，提升企业经济效益；
2、本发明通过密丝明孢曲霉(sartoryavuillw-10)发酵获得的粗酶液中纤维素酶的滤纸酶活力可达到1.26u/ml，具有较高的产酶效率；
3、本发明将通过密丝明孢曲霉(sartoryavuillw-10)发酵得到的纤维素酶应用于生物乙醇制备中，促进酶解过程，提升还原糖中葡萄糖的比例，秸秆残渣酶解率可以达到87％，乙醇产量可以高达20.93dm，不仅提高了秸秆残渣的酶解率，而且提高了生物乙醇产量，具有一定的应用价值；
4、本发明不仅生产成本低，乙醇得率高，有利于生物乙醇的商业化应用与实施，同时也为废弃生物的综合利用提供了一条途径。
附图说明
图1为密丝明孢曲霉形貌示意图；其中(a)为密丝明孢曲霉菌落特征，(b)为密丝明孢曲霉培养的镜下形态1，(c)为密丝明孢曲霉培养的镜下形态2，(d)为密丝明孢曲霉孢子。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步解释。
以下实施例1～3中采用的密丝明孢曲霉种子液的制备过程为：将一环密丝明孢曲霉孢子从斜面培养基中接种于50ml种子培养基上，于30℃、180r/min条件下培养36h，即得密丝明孢曲霉种子液，得到的种子液浓度为od6002.0(参考文献王梅；石璟；谭德水，等，枯草芽孢杆菌msj-5产β-甘露聚糖酶的性质研究[j]福建农业学报，2015年第03期)。采用的种子培养基的制备过程为：将蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母膏10g、氯化钠0.5g，七水硫酸亚铁0.005g、氯化钙0.3g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾2g的比例配制得到种子培养基预混物，用去离子水定容到1000ml，并利用1mol/l的盐酸和1mol/l的氢氧化钠溶液调节种子培养基预混物的ph值为7，然后于121℃灭菌20min，冷却后即得种子培养基；获得的种子培养基可以放置于4℃进行贮存备用。
以下实施例1～3中采用的mandel’s营养液是按照《糖蜜酒精扉页诱导康氏木霉产纤维素酶的研究》(林元山，广西大学，硕士学位论文，2004)中有关mandel’s营养液的制备过程制备得到的。
以下实施例1～3中采用的氢氧化钠预处理后的秸秆粉【也即实施例4～18中底物(秸秆残渣】制备过程相同，均是按照《optimizedalkalinepretreatmenttechnologyofricestrawforethanolproduction》(yliu，zqiu，gwang，[j]advancesinengineeringresearch2015，1169-1173)中有关氢氧化钠预处理秸秆粉的过程制备得到的，具体制备过程为：先将水稻秸秆粉碎后过20目筛，过筛后产物于60℃风干至恒重，再用浓度为2％的naoh溶液于100℃条件下预处理2h后分离出残渣，即可。
以下实施例8～18中采用的含有纤维二糖酶的粗酶液是按照《关于黑曲霉生产纤维二糖酶发酵条件的研究》(孟勇，王忠彦，苗艳芳，胡承，《四川大学学报(自然科学版)》，2002,39(5)；938～942)中有关纤维二糖酶的制备过程制备得到的。
以下实施例1～3中纤维素酶活性测试方法为：在试管中加入50mg的新华滤纸条，加入1ml的柠檬酸缓冲液(ph4.8，缓冲液中柠檬酸浓度为0.05mol/l)，后加入0.5ml适当稀释的粗酶液，在50℃水浴的条件下反应30min，反应结束后加入2mldns试剂，沸水浴5min，加蒸馏水稀释至20ml后混匀，在520nm条件下比色，测得吸光度值经葡萄糖标曲计算出反应结束后还原糖的量，扣除酶液和底物还原糖(可以通过与酶空白及底物空白的对照实验组比对获得)后计算酶活力。
一个滤纸酶活力单位(fpu)定义为：酶促反应中每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量。
式中，稀释倍数是指将实施例1～3中所得粗酶液稀释后体积与稀释前体积之比。
本发明提供了一种可以实现高纤维素酶高产的密丝明孢曲霉sartoryavuillw-10。上述密丝明孢曲霉，已于2016年1月7日提交保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chniageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保存编号为cgmccno.11991，分类命名为密丝明孢曲霉sartoryavuillw-10。
如图1所示，上述密丝明孢曲霉具有以下特点：菌丝层较薄，初生菌丝为白色，后期菌落呈灰褐色，菌落背面无色；密丝明孢曲霉具有双层小梗的分生孢子头，分生孢子呈长链状，子囊果呈菌核状，子囊孢子呈扁球形或球形，子囊孢子无色。
实施例1
采用密丝明孢曲霉(sartoryavuillw-10)制备纤维素酶的具体制备过程如下：
(1)配制培养基：按照硝酸钾4g、乳糖4g、尿素0.2g、磷酸氢二钾1.5g、mandel’s营养液3ml、麸皮6g、硫酸镁0.5g、氯化钙0.3g、氢氧化钠预处理后的秸秆粉30g的比例配制得到培养基，用去离子水定容至1000ml，并利用1mol/l的盐酸调节培养基的ph值为3；然后按照43ml/250ml的装瓶量，将配制的培养基分装到发酵容器中；
(2)接种密丝明孢曲霉种子液：按照培养基体积的10％，将密丝明孢曲霉种子液接种于盛有培养基的发酵容器中；
(3)制备纤维素酶：将接种密丝明孢曲霉的培养基于50℃、180r/m条件下发酵6天，然后将发酵产物于4000r/min离心5min，即得含有纤维素酶的粗酶液。
对得到的粗酶液进行纤维素酶活性测试，得到纤维素酶的滤纸酶活力为1.26fpu/ml。
实施例2
采用密丝明孢曲霉(sartoryavuillw-10)制备纤维素酶的具体制备过程如下：
(1)配制培养基：按照硝酸钾4g、乳糖4g、尿素0.2g、磷酸氢二钾1.5g、mandel’s营养液6ml、麸皮12g、硫酸镁0.5g、氯化钙0.3g、氢氧化钠预处理后的秸秆粉30g的比例配制得到培养基，用去离子水定容至1000ml，并利用1mol/l的盐酸调节培养基的ph值为2.5；然后按照60ml/250ml的装瓶量，将配制的培养基分装到发酵容器中；
(2)接种密丝明孢曲霉种子液：按照培养基体积的8％，将密丝明孢曲霉种子液接种于盛有培养基的发酵容器中；
(3)制备纤维素酶：将接种密丝明孢曲霉的培养基于45℃、180r/m条件下发酵7天，然后将发酵产物于3500r/min离心10min，即得含有纤维素酶的粗酶液。
对得到的粗酶液进行纤维素酶活性测试，得到纤维素酶的滤纸酶活力为0.92u/ml。
实施例3
采用密丝明孢曲霉(sartoryavuillw-10)制备纤维素酶的具体制备过程如下：
(1)配制培养基：按照硝酸钾4g、乳糖4g、尿素0.2g、磷酸氢二钾1.5g、mandel’s营养液2ml、麸皮4g、硫酸镁0.5g、氯化钙0.3g、氢氧化钠预处理后的秸秆粉30g的比例配制得到培养基，用去离子水定容至1000ml，并利用3mol/l的盐酸调节培养基的ph值为3.5；然后按照40ml/250ml的装瓶量，将配制的培养基分装到发酵容器中；
(2)接种密丝明孢曲霉种子液：按照培养基体积的15％，将密丝明孢曲霉种子液接种于盛有培养基的发酵容器中；
(3)制备纤维素酶：将接种密丝明孢曲霉的培养基于55℃、180r/m条件下发酵8天，然后将发酵产物于4000r/min离心5min，即得含有纤维素酶的粗酶液。
对得到的粗酶液进行纤维素酶活性测试，得到纤维素酶的滤纸酶活力为1.15u/ml。
实施例4-7
将实施例1制备的粗酶液加入到四个盛有底物的容器中进行不同底物浓度的糖化实验：常温下，在摇床中以120r/min的速率酶解72小时。配制的底物浓度及实验结果如表1所示。
表1实施例4-7不同底物浓度对应的糖化实验结果
从表1中可以看出，随着底物浓度的增加，酶解得率在不断下降；为了保证后续发酵所产的乙醇浓度，还要求酶解液具有比较高的还原糖浓度，因此综合考虑酶解得率和还原糖浓度，在制备生物乙醇时，优选选择80g/l底物浓度为宜。
实施例8-12
将实施例1制备的粗酶液加入到五个盛有底物的容器中，配制成底物浓度为80g/l的混合液,再向混合液中加入含有纤维二塘酶的粗酶液(用量以纤维二糖酶的酶活力计)和吐温-80分别对底物进行酶解实验：常温下，在摇床中以120r/min酶解72小时。实验原料配比及实验结果如表2所示。
表2实施例8-12酶解实验原料配比及实验结果
注：上述吐温-80浓度是以吐温-80在容器混合液中的浓度计。
从表2中可以看出，底物酶解率随着吐温-80的浓度增加而上升，在吐温-80浓度达到5g/l时稻草秸秆72h的酶解得率达到最大值，为81.8％；但是，当吐温-80浓度增加到10g/l时，酶解得率为81％。因此，在制备生物乙醇时，吐温-80添加量优选以5g/l为宜。
实施例13-15
将实施例1制备的粗酶液加入到三个盛有底物的容器中，配制成底物浓度为80g/l的混合液,再向混合液中加入含有纤维二糖霉的粗酶液(用量以纤维二糖酶的酶活力计)和吐温-80分别对底物进行酶解实验：常温下，在摇床中以120r/min酶解72小时。实验原料配比及实验结果如表3所示。
表3实施例13-15酶解实验原料配比及实验结果
注：上述吐温-80浓度是以吐温-80在容器混合液中的浓度计。
从表3中可以看出，底物酶解率随着纤维二糖酶活力增加而上升，最大增幅达2.3％,但当纤维二糖酶活力超过10cbu/每克底物时,酶解得率的提升就不再十分明显,因此，在制备生物乙醇时，综合考虑成本和酶解得率,采用酶活力为10cbu/每克底物的纤维二糖酶为宜。
实施例16-18
将实施例1制备的粗酶液加入到三个盛有底物的发酵容器中，配制成底物浓度为80g/l的混合液,并利用1mol/l的盐酸和1mol/l的氢氧化钠溶液调节混合液的ph值为5-6，于30～50℃、120～180r/min条件下添加吐温-80、含有纤维素二糖酶的粗酶液和酿酒酵母，对上述物料进行同步糖化发酵3-4天，即得生物乙醇。试验原料配比及测试结果如表4所示。
表4实施例16-18生物乙醇制备试验原料配比及测试结果
注：(1)上述吐温-80浓度是以吐温-80在容器混合液中的浓度计；
(2)乙醇产量％dm是指每100g干秸秆生产酒精的产率。
从表4可以看出，将本发明提供的密丝明孢曲霉发酵得到的纤维素酶应用于生物乙醇制备中，可以促进酶解过程，提升还原糖中葡萄糖的比例，且生产成本低，制备的乙醇得率高，从而有助于生物乙醇的商业化应用和实施。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。