检测眼部微量生物样本中CMV感染的试剂盒和方法与流程

本发明涉及病毒感染的分子检测技术，特别是检测眼部微量生物样本中cmv感染的试剂盒和方法。

技术背景

由于眼部结构复杂，且受血脑屏障影响，眼部组织标本的很多检测指标与血液的检测指标相关性很低，大量临床数据研究发现，血液检查不能准确反映眼部的真实病因，特别是感染性眼病的病因；另一方面，眼部标本体积微小，标本种类多种多样，包括各种组织、各种体液(玻璃体、房水、泪液等)、各种膜类(视网膜、角膜内皮等)、多部位分泌物等，眼部液体类样本中病毒dna含量极低，而固体样本中病毒dna难以提出，且样本内容物及其复杂，同时受限于取样量极小(其中固体标本一般不超过1mm³；除了泪液，眼部液体标本一般能取的量约为20-100ul，最多不超过200ul)很难满足血液、尿液检验所要求的大体积和均一种类，因此对眼部标本采用常规血液检测方法进行检测，假阴性比例非常高，常常延误治疗。目前尚未见到适合于微量标本，特别是取自眼部的微量标本的病毒检测技术。

人疱疹病毒5型cmv(humanherpesvirus5cytomegalovirus)，其感染十分常见,血液学检查证实60％-90％的成人都曾感染过巨细胞病毒，但通常这一感染并不引起任何临床症状。严重感染仅发生于出生前感染的婴儿和免疫系统功能受损者，如艾滋病患者和器官移植者。器官移植者易感染巨细胞病毒是由于治疗过程中为预防移植排异反应使用免疫抑制剂引起免疫功能下降，比如角膜移植术中术后常发生cmv感染导致移植失败。再如肿瘤移植病人术后，cmv感染成高发趋势，目前临床只注重于血液检测和全身给药，因对眼内检测手段的缺乏，眼内感染cmv往往被忽视，继发cmv眼内感染，导致视力丧失的病例也日趋多见

目前做眼部病毒感染的检测，依然采用血液检测，但是大量临床数据研究发现，血液检查不能准确反映眼部的真实病因，特别是感染性眼病的病因，易漏诊误诊。

获得眼部感染的准确检测结果，是后序采取正确治疗手段的前提；但是目前尚缺乏专门针对眼部组织病毒感染的高灵敏检测手段，也未见到以眼部微量样本为标本，采用常规pcr高灵敏度地检测病毒感染的报道。

技术实现要素：

根据上述领域的空白，临床上急需开发一种适合于眼部微量且多样标本的病毒dna提取方法和高灵敏度病毒检测试剂盒，鉴于此，本发明提供一种适合于眼部各类标本进行cmv病毒检测的方法、荧光探针检测试剂盒及dna提取方法，本发明请求保护的技术方案如下：

一种微量生物样本dna模板的制备方法，包括如下步骤：

(1)将待测微量生物样本放入容器中，加入10-30μl蛋白酶k、100-300μl裂解缓冲液al，于56℃处理至少10分钟；所述微量生物样本指体积不超10ul-200ul的液体状样本或体积不超过1mm³的固体状样本；

(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；

(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；

如果样本量＞140μl，重复上述步骤(3)；

(4)加入300-600μl洗脱缓冲液1,6000-9000rpm，0.5-2min，弃滤液及收集管，换新的收集管；

(5)加入300-600μl洗脱缓冲液2,10000-15000rpm，离心1-5min，弃滤液及收集管；

(6)换新的1.5ml液离心管，空离10000-15000rpm，离心0.5-2min,弃滤液及离心管；

(7)换一新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置0.5-2min，离心6000-9000rpm，0.5-2min得到待测微量生物样本的dna；

其中：

所述裂解缓冲液为含10％sds的tris饱和酚；

所述洗脱缓冲液1的配方为：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；

所述洗脱缓冲液2为无水乙醇；

所述洗脱缓冲液3为ph8.0，含1mmol/ledta的10mmol/ltris-hcl溶液。

优选地，所述所述步骤如下：

(1)将待测微量生物样本放入容器中，加入20μl蛋白酶k、200μl裂解缓冲液，于56℃处理至少10分钟；

(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；

(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；如果样本量＞140μl，重复上述步骤(3)；

(4)加入500μl洗脱缓冲液1,8000rpm，离心1min，弃滤液及收集管，新的收集管；

(5)加入500μl洗脱缓冲液2,14000rpm，离心3min，弃滤液及收集管；

(6)换新的1.5ml液离心管，空离14000rpm，离心1min,弃滤液及离心管；

(7)换新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置1min，8000rpm离心1min得到待测微量生物样本的dna。

优选地，所述测微量生物样本为液体状样本，步骤(1)中于56℃处理10min之后，再放入70℃环境中处理10min。

优选地，所述测微量生物样本为固体状组织，步骤(1)中于56℃处理5-12个小时。

优选地，所述液体样本指眼部分泌物、房水、泪液和/或玻璃体；所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。

本发明还提供一种用于制备微量生物样本dna模板的试剂组合，其特征在于，包含如下试剂；

裂解缓冲液：含10％sds的tris饱和酚,

洗脱缓冲液1：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；

洗脱缓冲液2：无水乙醇,

洗脱缓冲液3：ph8.0,含1mmol/ledta的10mmol/ltris-hcl溶液，

所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1mm³的固体类样本；

所述液体样本指眼部分泌物、房水、泪液和/或玻璃体；

所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。

本发明进一步提供一种用于检测眼部微量样本cmv感染的pcr扩增试剂，其特征在于：包含以下引物探针组，序列如下：

primer-f：tcgtgaaacacgctcgcttt

primer-r：tggtcggtacacggtccctt

探针：gacccggtgttccttggaga

所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1mm3的固体类样本；

所述液体样本指眼部分泌物、房水、泪液和/或玻璃体；

所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。

进一步地，用于每个反应的pcr扩增体系含有：

所述pcr扩增试剂在使用前加入眼部微量样本dna模板及蒸馏水使反应总体积达到20个体积单位。

优选地，所述体积单位可以是1微升、1.5微升、2微升或2.5微升。

进一步地，用于每个反应的pcr扩增体系含有：

本发明另一方面，还提供一种用于通过眼部微量样本检测眼部cmv感染的试剂盒，其特征在于，包含

上述任一用于检测眼部微量样本cmv感染的扩增试剂，

以及上述用于制备用于制备眼部微量样本dna模板的试剂组，

其中所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1×1mm的固体类样本。

优选地，所述试剂盒还包含为每个检测反应设置对照反应的对照模版，具体如下：

阳性对照模版:cmv病毒dna片段；

阳性对照模版:阳性眼部体液；

空白对照模版：超纯水；

阴性对照模版：阴性眼部液体样本；

弱阳性对照模版：阳性眼部体液的稀释液，其临界值设置在△t＝38-40。

本发明的再一方面，提供一种用于通过眼部微量样本检测眼部cmv感染的pcr方法，其特征在于，

包括制备眼部微量样本dna模板，然后采用任一所述的pcr扩增试剂对所述眼部微量样本dna模板进行实时定量pcr检测；

所述制备眼部微量样本dna模板的步骤如下：

(1)将待测微量生物样本放入容器中，加入10-30μl蛋白酶k、100-300μl裂解缓冲液al，于56℃处理至少10分钟；所述微量生物样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1×1mm的固体类样本；

(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；

(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；

如果样本量＞140μl，重复上述步骤(3)；

(4)加入300-600μl洗脱缓冲液1,6000-9000rpm，0.5-2min，弃滤液及收集管，换新的收集管；

(5)加入300-600μl洗脱缓冲液2,10000-15000rpm，离心1-5min，弃滤液及收集管；

(6)换新的1.5ml液离心管，空离10000-15000rpm，离心0.5-2min,弃滤液及离心管；

(7)换一新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置0.5-2min，离心6000-9000rpm，0.5-2min得到待测微量生物样本的dna模板。

其中：

所述裂解缓冲液为含10％sds的tris饱和酚；

所述洗脱缓冲液1的配方为：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；

所述洗脱缓冲液2为无水乙醇；

所述洗脱缓冲液3为ph8.0，含1mmol/ledta的10mmol/ltris-hcl溶液；

所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1mm³的固体类样本；所述液体样本指眼部分泌物、房水、泪液和/或玻璃体；所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。

优选地，所述制备眼部微量样本dna模板的步骤如下：

(1)将待测微量生物样本放入容器中，加入20μl蛋白酶k、200μl裂解缓冲液，于56℃处理至少10分钟；

(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；

(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；如果样本量＞140μl，重复上述步骤(3)；

(4)加入500μl洗脱缓冲液1,8000rpm，离心1min，弃滤液及收集管，换新的收集管；

(5)加入500μl洗脱缓冲液2,14000rpm，离心3min，弃滤液及收集管；

(6)换新的1.5ml液离心管，空离14000rpm，离心1min,弃滤液及离心管；

(7)换新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置1min，离心8000rpm，1min得到待测微量生物样本的dna。

优选地，所述测微量生物样本为液体时，步骤(1)中于56℃处理10min之后，再放入70℃环境中处理10min。

优选地，所述测微量生物样本为固体组织时，步骤(1)中于56℃处理5-12个小时。

优选地，pcr反应的程序如下：

37℃×2min

94℃×2min，上述两个温度和时间循环40次

93℃×15sec，

60℃检测荧光。

本发明一个主要的贡献在于，提出了以取自眼部的微量样本为材料提取dna制备pcr模板，并采用实时定量pcr(realtime-pcr)检测眼部病毒感染。

由于眼部结构复杂，且受血脑屏障影响，眼部组织标本的很多检测指标与血液的检测指标相关性很低，大量临床数据研究发现，血液检查不能准确反映眼部的真实病因，特别是感染性眼病的病因；另一方面，眼部标本体积微小，标本种类多种多样，包括各种组织、各种体液(玻璃体、房水、泪液等)、各种膜类(视网膜、角膜内皮等)、多部位分泌物等，其中固体标本一般不超过1mm³；除了泪液，眼部液体标本一般能取的量约为20-100ul，最多不超过200ul，很难满足血液、尿液检验所要求的大体积和均一种类，因此对眼部标本采用常规血液检测方法进行检测，假阴性比例非常高，常常延误治疗。目前尚未见到适合于微量标本，特别是取自眼部的微量标本的病毒检测技术。

基于此，发明人摸索了适合微量组织样本的dna提取方法，从提取试剂如蛋白酶k、裂解液、洗脱缓冲液的体积、时间、温度，用量方面进行了摸，提出一种简便易于操作的提取微量组织dna的方法，该方法适合提取眼部多种临床标本的dna模版，所得模板用于本发明的pcr检测，能够高灵敏地检测出眼部微量组织中的cmv病毒感染情况。

比如10ul泪液中的dna，其足够作为4个pcr反应的模版，并且成功地通过泪液检测了解到眼部的病毒感染情况。该方法该dna提取方法，不仅仅适用于眼部多种微量标本，对于难以获得的其它生物标本，比如取自婴儿的组织样本，微小生物的组织样本，都非常适合，对患者无创或者创伤最小化。

本发明另一个主要的贡献在于，还提供一种用于检测病毒感染，特别是cmv感染的试剂盒，以及提供了检测cmv的pcr扩增试剂，引物探针组，结合上述dna提取方法，进行检测。实验数据显示，无论是当时采集的临床眼部微量样品，还是采集24-48小时以上从其它城市医院或医院送来的多种眼部微量样品，都能够稳定、灵敏地检测cmv感染情况，方法具有良好的稳定性和可靠性。

鉴于眼部样本的微量、珍贵，为了减少检测过程中由于人为操作失误、试剂污染、失效等原因引起的结果误判以及样本浪费。本发明的试剂盒优选实施例中，为每个检测反应设置了多个对照模版，其中：

阳性对照模版:已知病毒cmvdna；作用是质控检测体系，试剂及设备的有效性，防止假阴性结果

阳性对照模版:阳性眼部体液；用于提示眼部标本检测体系的有效性，从而排除假阴性。

空白对照模版：超纯水；用于提示反应试剂中是否存在污染，从而同时结果是否存在提示假阳性。

阴性对照模版：阴性眼部液体样本；用于显示眼部标本正常存在的噪音，并提示是否有污染导致的假阳性。

弱阳性对照模版：由于眼部标本体积微小，阳性弱，因此要做弱阳性对照，来判定检测的灵敏度。

本发明的再一个主要的贡献在于，提供一种检测微量组织样本中cmv感染的pcr方法，在pcr体系和程序上作出了调整，能够准确检测到微量样本中的cmv感染情况。

附图说明

图1.眼部感染cmv病毒患者的角膜照片，采用临床常用cmv检测试剂盒检测血液结果呈阴性，并且全身给抗cmv药无疗效。

图2.图1同一患者，经本发明的方法及试剂盒检测眼部房水cmv感染情况，结果阳性，移植角膜后，对眼球给予抗cmv药治疗后的眼球。

图3.其中一例待测样本的cmv感染pcr检测结果示意图。

具体实施方式

以下通过具体实施例示例性说明本发明的技术方案，但不作为对本发明专利权范围的限制。

裂解缓冲液：含10％sds的tris饱和酚,

洗脱缓冲液1：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；

洗脱缓冲液2：无水乙醇,

洗脱缓冲液3：ph8.0,含1mmol/ledta的10mmol/ltris-hcl溶液。

对照核酸提取试剂盒：购自达安基因股份有限公司。

对照血清cmv检测试剂盒：购自达安基因股份有限公司。

实施例1.眼部微量液体待测标本dna提取方法

材料：

待测标本：采集自收治患者，泪液、房水2、玻璃体。

(1)将采集的待测标本放入容器中，加入10-30μl蛋白酶k、100-300μl裂解缓冲液al，于56℃处理10分钟以上；

(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；

(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；

如果样本量＞140μl，重复步骤(3)；

(4)加入300-600μl洗脱缓冲液1,6000-9000rpm，0.5-2min，弃滤液及收集管，换新的收集管；

(5)加入300-600μl洗脱缓冲液2,10000-15000rpm，离心1-5min，弃滤液及收集管；

(6)换新的1.5ml液离心管，空离10000-15000rpm，离心0.5-2min,弃滤液及离心管；

(7)换一新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置0.5-2min，

离心6000-9000rpm，0.5-2min得到待测微量生物样本的dna模版，最终能获得50-100μldna模版。

(8)取1ul样品，通过dna含量检测仪器nanodrop2000检测od260、od280，计算得到dna浓度为30-70ng/μl)

对照：采用核酸提取试剂盒购自达安基因。作为对照试剂，根据其说明书操作dna提取以及pcr扩增。

检测结果

可以看出，采用常规试剂盒提取眼部微量样本，所得dna纯度显著低于本发明方法所得提取物。特别是对照方法所得提取物的od280值明显高于本发明方法所得提取物的od280值。说明本发明提供的dna提取方法能够有效地将dna与其它细胞成分及蛋白分离，针对微量样本的特殊性，该步骤的改进是检测方法灵敏度、特异性高的保障。

实施例2.眼部微量固体待测标本dna提取方法

材料：

待测标本：采集自收治患者，采集视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜、眼部肿物，采集量1×1mm；

步骤：

(1)将采集的待测标本放入容器中，加入10-30μl蛋白酶k、100-300μl裂解缓冲液al，于56℃处理6-12小时；

(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；

(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；

(4)加入300-600μl洗脱缓冲液1,6000-9000rpm，0.5-2min，弃滤液及收集管，换新的收集管；

(5)加入300-600μl洗脱缓冲液2,10000-15000rpm，离心1-5min，弃滤液及收集管；

(6)换新的1.5ml液离心管，空离10000-15000rpm，离心0.5-2min,弃滤液及离心管；

(7)换一新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置0.5-2min，离心6000-9000rpm，0.5-2min得到待测微量生物样本的dna80μl。

(8)取1ul样品，通过dna含量检测仪器nanodrop2000检测od260、od280。

对照：采用核酸提取试剂盒购自达安基因。作为对照试剂，根据其说明书操作dna提取。

检测结果：

可以看出，采用常规试剂盒提取眼部微量样本，所得dna纯度比本发明方法所提得提取物的低。对照方法提取结膜囊分泌物，眼部肿物所得的提取物的od280值得明显高于本发明，即提取物中蛋白质或氨基酸含量较高，用作扩增模版，容易影响扩增的灵敏度。而本发明的方法对于取自眼部的各种组织微量样本，都能够获得高纯度模版。

实施例3.用于通过眼部微量样本检测眼部cmv感染的试剂盒

dna提取试剂组：

裂解缓冲液：含10％sds的tris饱和酚,

洗脱缓冲液1：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；

洗脱缓冲液2：无水乙醇,

洗脱缓冲液3：ph8.0,含1mmol/ledta的10mmol/ltris-hcl溶液。

用于pcr扩增的特异性引物和探针

primer-f：tcgtgaaacacgctcgcttt

primer-r：tggtcggtacacggtccctt

探针：gacccggtgttccttggaga

实施例4.用于通过眼部微量样本检测眼部cmv感染的试剂盒

dna提取试剂组：

裂解缓冲液：含10％sds的tris饱和酚,

洗脱缓冲液1：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；

洗脱缓冲液2：无水乙醇,

洗脱缓冲液3：ph8.0,含1mmol/ledta的10mmol/ltris-hcl溶液。

用于pcr扩增的特异性引物和探针：

primer-f：tcgtgaaacacgctcgcttt

primer-r：tggtcggtacacggtccctt

探针：gacccggtgttccttggaga

pcr扩增对照模版：

阳性对照模版:已知cmv病毒dna片段，对照试剂盒自带，作用是对检测体系和仪器的质量控制，保证结果的准确性，避免假阴性结果；

阳性对照模版:阳性眼部液体样本；

弱阳性对照模版：阳性眼部体液的稀释液，其临界值设置在△t＝38-40。

空白对照模版：超纯水；

阴性对照模版：阴性眼部液体样本；

实施例5.标本中cmv病毒的检测方法的建立

标本为临床诊断为血液中感染cmv的患者血清，共5例例。

步骤1.采用实施例1中的方法制备样本dna模板

步骤2.引物探针设计和合成

primer-f：tcgtgaaacacgctcgcttt

primer-r：tggtcggtacacggtccctt

探针：gacccggtgttccttggaga

步骤3:反应体系配制

并设置5个对照反应管，反应体系同上，模板分别为：

阳性对照模版:已知cmv病毒dna片段对照试剂盒自带

阳性对照模版:阳性眼部液体样本；

弱阳性对照模版：阳性眼部体液的稀释液，其临界值设置在△t＝38-40。

空白对照模版：超纯水；

阴性对照模版：阴性眼部液体样本；

步骤4.pcr程序：

37℃2min

94℃2min

循环上述两个温度和时间,循环30-40次

93℃15sec,60℃检测荧光

对照方法：

试剂：

对照提取方法：采用核酸提取试剂盒购自达安基因。作为对照试剂，根据其说明书操作dna提取。

对照检测方法：以医院常用的血清cmv检测试剂盒作为对照方法，购自达安基因，步骤为试剂盒内附实验步骤。

检测结果如下表：

上面表格中，随着血清标本量递减至10微升，本发明的方法对于液体标本的最低检测限为10ul；可见本发明的检测方法检测准确性为4/5＝0.80,即80％。

对照试剂盒仅仅能检测2ml血清标本量，随着样本量递减，无法获得有意义的检测结果。

同样也进行了“对照提取方法+本发明pcr方法”：结果与“对照提取方法+对照检测方法”的结果一致，说明现有常规方法提取大量样本所得模板液可以进行有效检测，但是当样本量无法达到毫升级别时，提取所得模板液不能进行有效检测。

实施例6临床眼部标本检测验证

dna来自临床收治患者眼部标本，提取方法见实施例1.

pcr扩增方法同实施例3。

对照方法：医院常用的血清cmv检测试剂盒作为对照方法，购自达安基因，步骤为试剂盒内附的实验操作步骤。

检测结果如下：

图3示意了其中一例阳性样本的检测结果：阳性检测样本与弱阳性对照相近。

实施例7眼部病毒感染和血液中病毒感染有较大差异

样本：来自1名临床收治患者不同阶段的房水和血液

检测方法：本发明方法：dna来自临床收治患者的眼部标本和血液，提取方法见实施例1。

对照方法：采用医院常用的血清cmv检测试剂盒作为对照方法，购自达安基因，步骤为试剂盒内附实验步骤。

样本检测结果

第一阶段治疗前：眼部和静脉血均检出cmv阳性；

第二阶段：是根据常规治疗方法，对患者给予全身抗cmv病毒药－1％醋酸泼尼松龙一个月后改用0.1％艾氟治疗两个月之后对眼部标本和静脉血检测，结果显示经治疗后血液中cmv转阴，但是全身抗病毒治疗对眼部cmv感染无效。

第三阶段：三个月之后复查，对眼部标本和静脉血检测，眼部cmv感染转阴。

以上数据显示，眼部感染情况和血液感染并不同步。如果按照目前医院常用检测方法仅仅检测血液感染，根据检测结果对全身整用抗病毒药，对于眼部感染并不管用。因此，准确检出眼部感染是有效治疗的关键。

而采用常规方法和试剂盒检测眼部标本，检测不到眼部cmv感染，也就无法对其眼部进行对应的治疗。

检测后治疗

采样本发明检测方法检测呈cmv感染阳性的患者，对其给予针对cmv的个体化治疗方案，如给予感染部位局部更昔洛韦、阿昔洛韦等抗病毒药物注射，并于给药后定期采集眼部标本进行病毒检测，检测用药后病毒dna情况，根据检测结果进行用药周期、浓度的调整，直至检测结果转阴，如图1-2所示：

图1多次移植角膜均因病毒感染而发生图1的症状而造成移植失败，疑似cmv感染，检测血液阴性，全身给抗cmv无疗效。

图2最后一次移植角膜之前，采用本发明的方法检测到眼部存在cmv感染，对眼部局部采取抗cmv病毒治疗，移植后持续给予局部抗病毒治疗，不再发生图1所示的症状，移植成功。

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<110>北京大学第三医院

<120>检测眼部微量生物样本中cmv感染的试剂盒和方法

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