本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种番茄抗晚疫病外显子circrna45及其克隆方法与应用方法。
背景技术：
番茄是一种世界范围内广泛种植的园艺作物并且是双子叶模式茄科植物。由晚疫病菌侵染所造成的晚疫病在世界范围内对番茄生产造成了巨大的经济损失。虽然化学农药的使用能减缓疾病的发生和蔓延，但随之而来的农药残留、环境污染、病原菌抗药性等问题日益严峻。虽然存在针对晚疫病菌抗性基因研究出的适宜栽培种，但晚疫病菌毒力结构复杂，已知的番茄抗病基因容易丧失抗性，因此寻找新的抵御病原菌侵染途径迫在眉睫。
环状rna(ciucularrna，circrna)是区别于传统线性rna的非编码rna家族新成员，是以共价键化合形成环状结构的内源性rna分子。1976年sanger团队提出高等植物中的类病毒为一种单链环状闭合的rna病毒，并将这种rna称为环状rna，由此环状rna的概念第一次被提出(sangetal.,1976)。另外在1991年nigro等发现人类的促癌基因存在显著的反式剪接现象可以生成circrna产物(nigroetal.,1991)。尽管circrna在许多物种中保守存在，但以前一直被视为错误剪接产物而不被重视(qianetal.,1992)。并且由于技术的限制，circrna的研究一直处于比较低迷的状态。
近年来随着测序技术的进步，使得circrna的研究成为可能。2012年首次证实在人体细胞的基因表达程序中发现circrna分子的存在比线性rna更普遍(salzmanetal.,2012)。随着时间的发展，利用高通量测序技术又分别在人、小鼠和线虫中证实了1950、1903、724个circrna的存在(memczaketal.,2013)。另外circrna常常在体内表现为组织或者发育阶段特异性(szaboetal.,2015)。近几年研究发现circrna能够吸附mirna从而存在相应的生物学功能，这一功能使得circrna引起了研究者的广泛重视(hansenetal.,2013)。
circrna主要通过非典型可变剪切加工产生，目前发现的circrna主要来源于基因外显子，但多项研究表明circrna的类型比想象的要复杂，根据组成不同，circrna可分为外显子circrna(exoncircularrnas,ecircrna)，内含子circrna(introncircularrnas,icircrna)及外显子-内含子circrna(exon-introncircularrnas,eicircrna)，研究发现最多的是ecircrna。目前环状rna的鉴定主要是先确定环状rna的反向剪接位，需要跨反向剪接位点设计引物进行pcr扩增，将pcr扩增产物进行测序，如果所扩增的序列中含有反向剪接序列，则证明此序列为circrna。但该方法的主要关键点是要确定circrna的准确环化位置，然后才能设计引物。而数据分析得到的反向剪接位点通常范围较广，因此如何选择合适的剪接位点变得很重要。
已有研究显示circrna可以作为“海绵”吸附mirna，阻断mirna对其靶基因的抑制作用(wangetal.,2016)。对circrna的功能和调控机制研究的一个必不可少的手段就是在体内过表达circrna。为了使克隆的circrna在机体中大量表达，需要构建circrna的表达框架。过表达线性的基因技术方法已经非常成熟，但是过表达环状的rna分子还存在问题，比如：如何使rna分子在特定位点发生准确环化，然后能在机体内生成环状的rna。动物中已有研究表明能够通过合适的人工载体或者注射的方式进行circrna的过表达，但植物中还没有出现特殊的能够介导circrna进行体内环化表达的特殊载体。
技术实现要素：
鉴于上述番茄晚疫病的危害程度，急需寻找一种新的途径提高番茄的抗病性，本发明的目的即为提供一种有效过表达番茄晚疫病相关circrna的方法，并由此提高了番茄抗病性。
为了达到上述目的，本发明提供了一种番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45，其序列如seqidno.1所示。
本发明还提供了上述番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45的克隆方法，以ecircrna45-c-fp、ecircrna45-c-rp和ecircrna45-d-fp、ecircrna45-d-rp为特异性引物，其中，ecircrna45-c-fp和ecircrna45-c-rp所示的dna序列组成正向引物对，ecircrna45-d-fp和ecircrna45-d-rp所示的dna序列组成反向引物对；
所述的特异性引物ecircrna45-c-fp、ecircrna45-c-rp、ecircrna45-d-fp和ecircrna45-d-rp序列分别如seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5所示。
优选方式下，以番茄l3708的gdna和cdna为模板，分别以ecircrna45-c-fp、ecircrna45-c-rp、ecircrna45-d-fp和ecircrna45-d-rp为特异性引物，进行pcr扩增，即可得到番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45。
另外，本发明还提供了一种有效检测番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45表达量的方法，即在番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45的反向剪接位点两端进行qrt-pcr的引物设计，设计的引物分别为qrt-ecircrna45-fp和qrt-ecircrna45-rp；
所述设计的引物qrt-ecircrna45-fp和qrt-ecircrna45-rp序列分别如seqidno:6、seqidno:7所示。
这种设计及检测方法可以有效降低假阳性，用该对引物进行qrt-pcr实验可以准确得到番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45的表达量。
本发明还提供了番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45的应用方法，用于番茄抵御病原菌侵染。
优选方式下，上述番茄抵御病原菌侵染通过调控番茄晚疫病抗性基因表达实现，即在番茄中过表达所述番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45。
进一步优化，具体方法为：
s1、对番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45序列两端进行延长，最终在其序列的上游和下游引入反向剪接位点；
s2、根据新序列进行引物设计并在引物两端分别添加bamhi和saci酶切位点与保护碱基后得到最终引物，所述最终引物为ecircrna45-fp和ecircrna45-rp；
ecircrna45-fp序列如seqidno:12所示，ecircrna45-rp序列如seqidno:13所示；
s3、用步骤s2获得的最终引物进行番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45序列扩增并连接pbi121载体，得到最终表达载体pbi121-ecircrna45；
s4、将步骤s3制得的最终表达载体pbi121-ecircrna45导入根癌农杆菌gv3101感受态细胞，摇菌培养，得到pbi121-ecircrna45过表达载体菌液；
s5、取六叶期番茄作为处理对象，以注射的方式向所述六叶期番茄叶片内导入的步骤s4制得的pbi121-ecircrna45过表达载体菌液，进而实现番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45的过表达。
番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45的过表达可以有效降低mir477-3p和mir9478-5p的表达量，而mir477-3p和mir9478-5p的靶基因为植物nbs-lrr类抗病基因，因此mir477-3p和mir9478-5p的表达量降低可以使植物nbs-lrr类抗病基因的表达量提高，从而提高植物的抗病性。
本发明的技术创新在于：
(1)本发明首先设计特异的环状rna引物进行pcr、一代测序实验证实番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45的客观存在；
(2)本发明还提供了一种有效检测番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45的特异qrt-pcr引物，减少了假阳性的存在。
(3)藉由本发明外显子环状rna-ecircrna45的过表达，可以实现对番茄晚疫病抗性基因的调控。具体地，外显子环状rna-ecircrna45的过表达可以抑制植物体内mir477-3p和mir9478-5p的表达，而mir477-3p和mir9478-5p的靶基因为植物nbs-lrr类抗病基因，因此过表达外显子环状rna-ecircrna45能间接提高抗性基因的表达量，从而提高植物的抗性。另外，外显子环状rna-ecircrna45在植物体内存在比较稳定，因此相较于其他线性rna，更有利于遗传调控。
附图说明
图1为本发明实施例1中circrna两对引物的设计原则示意图，其中箭头指示方向为引物设计方向。
图2为本发明实施例1中外显子环状rna-ecircrna45的鉴定结果。
图3为本发明实施例1中外显子环状rna-ecircrna45在晚疫病菌处理下的表达特性差异。
图4为本发明实施例1中外显子环状rna-ecircrna45的梯度pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
图5为构建成功的pbi121-ecircrna45过表达载体的双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图。
图6为本发明实施例1中成功建立的pbi121-ecircrna45瞬时表达体系在晚疫病菌处理下不同时间外显子环状rna-ecircrna45的表达量变化。
图7为本发明实施例1中成功建立的pbi121-ecircrna45瞬时表达体系在晚疫病菌处理下不同时间mirmir477-3p的表达量变化。
图8为本发明实施例1中成功建立的pbi121-ecircrna45瞬时表达体系在晚疫病菌处理下不同时间mir9478-5p的表达量变化。
图9为本发明实施例1中成功建立的pbi121-ecircrna45(tg)和pbi121空载(cg)瞬时表达体系在晚疫病菌接种不同时间下的叶片病斑面积表现。
具体实施方式
如上所述，当前对circrna的研究非常有限，基本都是对circrna的生物信息学和分子生物学方面的鉴定。目前对circrna的研究主要集中在人和动物中，如前文所述，番茄晚疫病会对番茄生产造成巨大的经济损失，因此对晚疫病相关circrna进行研究具有重要的应用意义。另外circrna的功能研究目前刚起步，对circrna进行生物学功能的研究有利于后续的应用。
下面参照附图对本发明示例性实施方式进行详细描述。对示例性实施方式的描述仅仅是出于示范目的，而绝不是对本发明及其应用或用法的限制。
实施例1
1.外显子环状rna-ecircrna45的挖掘和鉴定
1.1外显子环状rna-ecircrna45的生物信息学与分子生物学鉴定
番茄果实中circrna的深度测序：采用trizol(lifetechnologies)分别提取未处理和晚疫病菌处理后野生型番茄(solanumlycopersicum)品种(l3708)叶片的总rna，再利用dnasei(fermentas)消化，以去除残留基因组dna。之后，利用ribo-zeromagnetickit-plantleaf(epicentre)去除核糖体rna。最后分析circrna的每个样品有效数据量6g以上。
circrna位点的提取与分析：深度测序数据去除接头和低质量数据后，分别提取外显子环状rna-ecircrna45反向剪接位点信息。
1.2ecircrna的引物设计
对circrna进行鉴定之前，需要设计两对引物，正向引物需要在circrna序列两端设计；反向引物需要跨剪接位点设计，即将circrna的3’端下游剪接位点与circrna的5’端上游剪接位点连接组成一个新的序列，并且在5’端上游剪接位点和3’端下游剪接位点的两端要分别存在ag和gt位点，且ag和gt位点距离circrna不能超过300bp。将满足以上条件的新序列进行引物设计，将会得到circrna的反向引物，具体引物设计过程如图1所示。
1.3外显子环状rna-ecircrna45的鉴定
用两种引物分别在gdna和cdna中对外显子环状rna-ecircrna45进行鉴定，若用正向引物能在gdna和cdna中都得到扩增产物，而用反向引物只能在cdna中得到扩增产物，那么circrna就被成功鉴定出来。
结果：本发明人通过上述实验鉴定出部分circrna，由此证明通过生物信息学方式检测到的circrna确实存在，并且进行反向引物设计时其跳跃位点的选择也具有合理性。对外显子环状rna-ecircrna45的鉴定结果示于图2。外显子环状rna-ecircrna45是采用正向引物seqidno:2(5’-3’:tttcccttttgctcaatcggta)、seqidno:3(5’-3’:atgaagccggggtcctct)和反向引物seqidno:4(5’-3’:tgaacgacttggactaaatggg)、seqidno:5(5’-3’:agaaatacagcaaaaaagggtt)进行特异性pcr扩增的，经测序发现其序列为：
tacaagtgtttatgaagaaggtgatgctcgttctgctcttattactatgcttcagtcacttcatcatgccaaaaatggtgtagacattgtttctggcacgagagttaagtcacactttgctaagcctaattggagaaacgtctacaaacgcattgctctcaaccacccagaggctaaagttgg*gcatccattttccatgcatccattttccattacttcggccccaggagatgactatctcagtgtccatattagaactcttggtgattggaccagacaacttaaaactgttttctccgaggtttgccagccaccacctaatgggaaaagtggactccttagagctgactacttgcaaggagagaataatcctaatttcccaagagtgttaattgatggaccatacggagcaccagcacaagactacaagcagtatgaggtggttttattggtgggtcttggaattggagctacaccaatgatcagtatcgttaaagacattgtcaacaacatgaaggccatggacgaagaagaaaattccttggaaaatgggcacgggatgtccaatgcagcacaaaatgctagcccaaatatggcacagaagaggggtaaatcaggttcagcaagtggaagaaatagcttcaatacaaggagggcatatttctattgggtcacaagagaacaaggttcatttgactggttcaaaggtataatgaatgaagctgctgaaatggatcataagggagtaattgaaatgcacaattattg
本文中标注为seqidno:1的序列为该段序列的线性形式，其中符号“*”所示位置之间为反向剪接位点，外显子环状rna-ecircrna45共768个碱基。
2.circrna及其沉默mirna的表达特性分析
由于选择性环化现象的存在，因此需要跨越反向剪接位点设计circrna的特殊实时定量引物，以保证扩增的特异性，其余设计理念与普通实时定量pcr一样。另外circrna所吸附的mir477-3p和mir9478-5p的实时定量引物设计理念也同普通实时定量pcr一样。
将由此设计理念获得的外显子环状rna-ecircrna45(5’-3’:ggtggtatagatgatgtgaa,seqidno:6；5’-3’:cctaagactagctgaaga,seqidno:7)、mir477-3p(5’-3’:ggtggtatagatgatgtg,seqidno:8；5’-3’:cctaagactagctgaata,seqidno:9)和mir9478-5p(5’-3’:gctatgctagtagtctgtagaat,seqidno:10；5’-3’:gtcttatattacgttgaat,seqidno:11)的qrt-pcr引物用于后续实验。
表达特性分析：提取由晚疫病菌处理后的野生型番茄(l3708)叶片总rna，去除基因组dna残留，之后用随机引物(randomhexamerprimer，fermentas)将rna逆转录为cdna，再利用qrt-pcr(sybrgreen)分析各时期外显子环状rna-ecircrna45及其吸附mirna的相对表达量，该实时pcr所采用的引物如上所述。
结果：对外显子环状rna-ecircrna45及其吸附mirna在各处理时期的表达特性分析结果示于图3中。从该图中可以看出，外显子环状rna-ecircrna45的表达趋势与其吸附mir9478-5p和mir477-3p的表达趋势是相反的。
3.circrna的过表达载体构建与瞬时侵染体系的建立
3.1外显子环状rna-ecircrna45的克隆载体构建
将seqidno:1的序列两端各延长至下一个ag/gt为止，即人为加入介导环化的反向剪接位点，然后对新序列进行引物设计。之后在引物两端分别添加bamhi和saci酶切位点与保护碱基后得到最终引物：
外显子环状rna-ecircrna45：
上游引物(5’-3’):cgggatcccttcaagtcccaa(seqidno:12)；
下游引物(5’-3’):cgagctctaattcatcttccc(seqidno:13)。
结果：外显子环状rna-ecircrna45的pcr产物电泳结果如图4所示，说明这两段序列被成功克隆。之后将外显子环状rna-ecircrna45的克隆序列分别连接于pmd19-t(simple)载体上，测序反馈结果显示存在序列1所示的碱基序列，将测序正确的质粒命名为pmd19-t-ecircrna45。
3.2pbi-circrna载体的构建
取步骤3.1的pmd19-t-ecircrna45用于后续实验，用bamhi和saci限制性内切酶酶切，酶切体系为：质粒10ul、10×酶切缓冲液1ul、saci1ul(10u/ul)、bamhi1ul(10u/ul)、加ddh2o补充反应体系至20ul，37℃酶切12小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收外显子环状rna-ecircrna45小片段。
同时用限制性内切酶saci和bamhi对质粒pbi121进行双酶切，酶切体系为：质粒15ul、10×酶切缓冲液1ul、saci1ul(10u/ul)、bamhi1ul(10u/ul)、加ddh2o补充反应体系至20ul，37℃酶切过夜。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，然后用大连宝生物公司的dna凝胶回收试剂盒回收pbi121大片段，溶于30ulddh2o中。
将6ul回收的小片段溶液、2ul回收的pbi121大片段、1ul(350u/ul)t4连接酶、2ul10×连接缓冲液、加ddh2o补充反应体系至20ul，16℃连接过夜，得到的连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，经抗性平板筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆中的重组质粒，进行测序验证。
结果：从图5的双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图可以看出，pbi121-ecircrna45过表达载体构建成功。
3.3瞬时侵染体系的建立与相关检测
分别挑取pbi121-ecircrna45根癌农杆菌的单菌落至5ml的yeb液体培养基(含100mg/l利福平，50mg/l卡那霉素)，于28℃，180rpm振荡培养过夜。吸取1ml上述菌液加入100ml的yeb液体培养基(含100mg/l利福平，50mg/l卡那霉素，一水吗啉乙磺酸10mmol/l，乙酰丁香酮20μmol/l和硫酸镁2mmol/l，ph＝5.6)，于28℃，180rpm振荡培养过夜。之后于4℃，4000r/min离心10min收集根癌农杆菌菌体，重悬菌体于悬浮液mma(含一水吗啉乙磺酸10mmol/l，乙酰丁香酮20μmol/l和氯化镁10mmol/l，ph＝5.6)中，调节od至1.0，25℃，180rpm振荡培养3h以上。
转化前，将六叶期番茄置于弱光条件下，用细砂纸打磨叶背面表皮，将上述菌液渗透叶片，取过表达4d后的叶片，将处理好的晚疫病菌液活体喷洒于处理后的番茄叶片上，要达到聚滴流下的状态。取处理后0h，12h，24h，36h，48h，72h，96h的叶片检测相关指标。
结果：图6显示与对照组即晚疫病菌处理0h相比，在瞬时侵染后的番茄叶片的不同时期，外显子环状rna-ecircrna45高度表达，这表明本发明人成功地构建了pbi121-ecircrna45过表达载体，且成功地在番茄中过表达了circrna，并且从图7和图8可以看出mir9478-5p和mir477-3p的表达量呈下降趋势，说明外显子环状rna-ecircrna45很可能是通过吸附mirna而产生作用的。图9可以看到番茄叶片的病斑面积有显著的改善，与对照组相比过表达外显子环状rna-ecircrna45能显著降低植物的致病性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>大连理工大学
<120>番茄抗晚疫病外显子环状rna-ecircrna45及其克隆、检测与应用方法
<130>2018
<160>13
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>768
<212>dna
<213>solanumlycopersicum
<400>1
tacaagtgtttatgaagaaggtgatgctcgttctgctcttattactatgcttcagtcact60
tcatcatgccaaaaatggtgtagacattgtttctggcacgagagttaagtcacactttgc120
taagcctaattggagaaacgtctacaaacgcattgctctcaaccacccagaggctaaagt180
tgggcatccattttccatgcatccattttccattacttcggccccaggagatgactatct240
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<211>23
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