本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种cyp6ab9基因和干扰棉铃虫棉酚代谢的dsrna及二者在防治棉铃虫中的应用。
背景技术：
棉酚是棉属植物特有的植物次生代谢产物，对许多棉属植物的害虫具有一定的抗性。游离的棉酚有比较大的毒性，它不仅是一种天然杀虫剂，还是一种抑菌活性物质。棉酚含有两个高活性的醛基可以与蛋白质的氨基酸相互作用形成席夫碱结构使蛋白质发生交联反应，进而使蛋白质失去活性。棉铃虫是以棉花为主要寄主的重要农业害虫，棉铃虫体内的细胞色素p450(cyp)参与棉酚解毒代谢途径，因此，棉铃虫对棉酚具有一定的抗性。
棉铃虫，属于鳞翅目、夜蛾科，是一种世界性害虫。因其寄主范围广、适应能力强、易产生抗药性还兼具迁飞性等特点，使得棉铃虫成为一种危害严重且较难防治的杂食性农业害虫。早期的防治手段主要是通过化学农药对棉铃虫进行防治，随着农药的滥用，田间的棉铃虫出现了抗药性，污染环境的同时防治效果也越来越差。后期，将bt杀虫蛋白基因转入棉花，得到表达bt杀虫蛋白的转基因棉，可以高抗棉铃虫等鳞翅目害虫，可以降低农药的使用量和频率，这在很大程度上缓解了棉铃虫的抗性问题。但随着bt棉的广泛种植，棉铃虫对bt棉也产生了一定程度的抗药性，目前仍然需要结合使用化学农药来对防治棉铃虫。因此，面对棉铃虫防治越来越难的问题，探索新的药剂靶标已经迫在眉睫。
rna干扰(rnai)是指外源或内源的双链rna(dsrna)特异性地引起基因表达沉默的现象。dsrna进入细胞后可被dicer酶切割成21-23bp的小分子rna即sirna，然后rna在诱导沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex，risc)的作用下sirna被解螺旋成单链，反义链特异性地与同源靶标mrna结合，最终导致基因表达沉默。由于rnai特异性较高，制作成本较低等特点，已经作为一种新方法在农业害虫防治中得到应用。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种dsrna，可以诱导棉铃虫cyp6ab9基因表达沉默，进而棉铃虫对棉酚的抗性；
本发明的第二目的在于提供上述dsrna的制备方法，提供一种制备防治棉铃虫产品的制备方法；
本发明的第三目的在于提供上述dsrna的应用，利用cyp6ab9基因参与棉铃虫棉酚代谢这一功能，通过rnai技术防治棉铃虫；
本发明的第四目的在于提供用于防治棉铃虫的产品，以缓解现有技术中棉铃虫对农药和bt棉的抗性越来越强，棉铃虫的防治工作越来越困难的问题；
本发明的第五目的在于提供cyp6ab9基因在防治棉铃虫或制备防治棉铃虫的产品中的应用，利用cyp6ab9基因参与的代谢途径降低棉铃虫的棉酚抗性；
本发明的第六目的在于提供含有seqidno.2序列的表达盒、重组载体、重组菌株或转基因系细胞系，提供多种可以快速制备防治棉铃虫dsrna的产品；
本发明的第七目的在于提供一种防治棉铃虫的方法，以缓解现有技术中棉铃虫对农药和bt棉的抗性越来越强，棉铃虫的防治工作越来越困难的问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供一种dsrna，为如下a)或b)：
a)由seqidno.1所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成的双链rna；
b)与a)限定的双链rna具有80％以上同源性且具有相同功能的双链rna。
进一步地，编码a)中dsrna的dna序列为seqidno.2所示的核苷酸序列；
优选地，扩增得到所述编码a)中dsrna的dna序列的上游引物为seqidno.3所示的核苷酸序列，扩增得到所述编码a)中dsrna的dna序列的下游引物为seqidno.4所示的核苷酸序列。
本发明提供上述dsrna的制备方法，所述制备方法包括：根据cyp6ab9基因的序列设计rna干扰引物，扩增棉铃虫基因组模板得到编码dsrna的dna序列，进而合成得到dsrna。
进一步地，所述rna干扰引物的上游引物为seqidno.3所示的核苷酸序列，所述rna干扰引物的下游引物为seqidno.4所示的核苷酸序列；
优选地，所述编码dsrna的dna序列为seqidno.2所示的核苷酸序列，所述dsrna中的正义链为seqidno.1所示的核苷酸序列。
本发明提供上述dsrna在如下(a)-(e)任一项中的应用：
(a)降低棉铃虫在棉酚存在时的存活率或制备降低棉铃虫在棉酚存在时的存活率的产品；
(b)抑制棉铃虫在棉酚存在时的生长或制备抑制棉铃虫在棉酚存在时的生长的产品；
(c)抑制棉铃虫棉酚代谢或制备抑制棉铃虫棉酚代谢的产品；
(d)降低棉铃虫cyp6ab9基因表达量或制备降低棉铃虫cyp6ab9基因表达量的产品；
(e)防治棉铃虫或制备防治棉铃虫的产品。
本发明提供用于防治棉铃虫的产品，其活性成分包括上述dsrna。
本发明提供cyp6ab9基因在防治棉铃虫或制备防治棉铃虫的产品中的应用，所述cyp6ab9基因的序列为seqidno.5所示的核苷酸序列。
本发明提供含有上述编码dsrna的dna序列的表达盒、重组载体、重组菌株或转基因系细胞系。
本发明提供一种防治棉铃虫的方法，通过抑制cyp6ab9基因的表达对棉铃虫的棉酚代谢进行干扰，从而实现防治棉铃虫。
进一步地，通过将上述dsrna导入棉铃虫来抑制cyp6ab9基因表达；
优选地，所述导入的方式包括注射或饲喂；
优选地，所述饲喂为：直接饲喂dsrna、表达dsrna的菌株或含有dsrna的饲料；
优选地，所述注射为：通过拉针仪拉出的毛细管将dsrna注射到幼虫的腹部倒数第二与第三足节间处；
优选地，所述幼虫为2-3龄幼虫时，dsrna的注射量为2-3μg。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一种dsrna，利用rnai技术，根据棉铃虫cyp6ab9基因设计得到的dsrna，再将dsrna导入棉铃虫，实际上是利用rnai技术对cyp6ab9基因的表达进行干扰。结果显示，从mrna水平上检测注射dsrna后的棉铃虫cyp6ab9基因有显著的降低，说明dsrna进入棉铃虫的细胞内发生了rnai级联反应，目的基因cyp6ab9基因的表达受到了干扰。从形态学角度来看，在棉酚存在时，注射cyp6ab9基因dsrna的棉铃虫的体重均比对照组明显的降低，棉铃虫基因cyp6ab9基因确实参与了棉酚的解毒代谢过程，本发明提供的dsrna确实能够干扰棉铃虫的棉酚解毒代谢过程；但是当没有棉酚胁迫时，注射cyp6ab9基因dsrna的棉铃虫和对照组一样正常生长发育，排除了cyp6ab9基因自身参与调节棉铃虫幼虫生长发育的可能。这表明cyp6ab9基因dsrna可以用于棉铃虫的防治，本发明为下一步利用rnai技术创建新品种的转基因棉奠定了基础，后期可以利用cyp6ab9基因或本申请提供的dsrna制备转基因棉，结合现有种植的bt抗虫棉实现棉铃虫物种特异的绿色防控，减缓靶标害虫抗性的产生。
附图说明
图1为本发明实施例4的注射dsrna后棉铃虫取食棉酚饲料体重增长测定中实验组和对照组在0.1％棉酚胁迫下72h后的体重变化量结果示意图；
图2为本发明实施例4的沉默效率检测中实验组和对照组分别在24h和72h时体内cyp6ab9基因在rna水平上表达量变化结果示意图；
图3为本发明实施例4的cyp6ab9基因对昆虫生长发育的影响中实验组和对照组在正常条件下饲养72h后的体重变化量结果示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明提供一种dsrna，为如下a)或b)：
a)由seqidno.1所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成的双链rna；
b)与a)限定的双链rna具有80％以上同源性且具有相同功能的双链rna。
该dsrna可以引起棉铃虫cyp6ab9基因的表达沉默，进而抑制棉铃虫对棉酚的代谢途径，降低棉铃虫对棉酚的抗性，从而降低棉铃虫的成活率，达到防治棉铃虫的目的。
在本发明的一个实施方式中，编码a)中dsrna的dna序列为seqidno.2所示的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方式中，扩增得到编码a)中dsrna的dna序列的上游引物为seqidno.3所示的核苷酸序列，下游引物为seqidno.4所示的核苷酸序列。上述引物对特异性好，扩增效率高。
本发明的一个实施方式中，含有上述编码dsrna的dna序列的表达盒、重组载体、重组菌株或转基因系细胞系均属于本发明的范围。通过表达盒、重组载体、重组菌株或转基因系细胞系均独立地可以快速得到上述的dsrna，或均独立地可以用于载体介导的rnai技术，或均独立地可以用于制备抗棉铃虫的转基因棉。
本发明又提供上述dsran的制备方法，上述dsrna通过下述方法得到：利用rna干扰技术，根据cyp6ab9基因的序列设计rna干扰引物，利用rna干扰引物扩增棉铃虫基因组模板得到编码dsrna的dna序列，进而合成得到dsrna。该方法针对cyp6ab9基因的序列制备得到dsrna，制备得到的dsran特异性高，可以高效地抑制cyp6ab9基因的表达，诱导cyp6ab9基因沉默。
在本发明的一个实施方式中，rna干扰引物的上游引物为seqidno.3所示的核苷酸序列，rna干扰引物的下游引物为seqidno.4所示的核苷酸序列。该引物特异性好，扩增效率高。
在本发明的一个实施方式中，rna干扰引物扩增得到的dna序列为seqidno.2所示的核苷酸序列，dna序列制备得到的dsrna中的正义链为seqidno.1所示的核苷酸序列。
本发明又提供上述的dsrna在如下(a)-(e)任一项中的应用：
(a)降低棉铃虫在棉酚存在时的存活率或制备降低棉铃虫在棉酚存在时的存活率的产品；
(b)抑制棉铃虫在棉酚存在时的生长或制备抑制棉铃虫在棉酚存在时的生长的产品；
(c)抑制棉铃虫棉酚代谢或制备抑制棉铃虫棉酚代谢的产品；
(d)降低棉铃虫cyp6ab9基因表达量或制备降低棉铃虫cyp6ab9基因表达量的产品；
(e)防治棉铃虫或制备防治棉铃虫的产品。
棉酚是棉属植物特有的植物次生代谢产物，对许多棉属植物的害虫具有一定的抗性。而棉铃虫是以棉花作为主要寄主的重要农业害虫，可以通过体内解毒代谢酶对棉酚进行代谢，其中细胞色素p450(cyp)在其中起到重要作用。因此，通过干扰关键cyp基因的表达，使棉铃虫对棉酚的抗性显著降低，可以达到防控棉铃虫的目的。本发明的dsrna针对cyp6ab9基因制备得到，可以特性性高效率地抑制棉铃虫cyp6ab9基因的表达，在棉酚胁迫条件下，棉铃虫的棉酚代谢途径收到抑制，棉铃虫的棉酚抗性降低，进而一直棉铃虫的生长，降低棉铃虫的存活率，达到防治棉铃虫的目的。
本发明又提供用于防治棉铃虫的产品，其活性成分包括上述的dsrna。
本发明提供棉铃虫cyp6ab9基因在防治棉铃虫或制备防治棉铃虫的产品中的应用，其中，cyp6ab9基因的序列为seqidno.5所示的核苷酸序列。本发明通过实验验证得到棉铃虫cyp6ab9基因不是棉铃虫正常生长所需的必要基因，但是参与棉铃虫的棉酚代谢途径，利用这一功能可以通过诱导cyp6ab9基因沉默，抑制棉铃虫棉酚代谢，达到防治棉铃虫的目的。cyp6ab9基因参与棉铃虫棉酚代谢这一功能可以应用到棉花抗棉铃虫的工作中。
本发明最后提供一种防治棉铃虫的方法，通过抑制cyp6ab9基因的表达对棉铃虫的棉酚代谢进行干扰，从而实现防治棉铃虫。
在本发明的一个实施方式中，将上述dsrna导入棉铃虫来抑制cyp6ab9基因表达。
在本发明的一个实施方式中，导入的方式包括注射或饲喂。
在本发明的一个实施方式中，饲喂为：直接饲喂dsrna、表达dsrna的菌株或含有dsrna的饲料。饲喂法操作方便且简单，对棉铃虫影响小。
在本发明的一个实施方式中，注射为：通过拉针仪拉出的毛细管将dsrna注射到幼虫的腹部倒数第二与第三足节间处。注射法效率高，可以缩短导入周期。
在本发明的一个实施方式中，幼虫为2-3龄幼虫时，dsrna的注射量为2-3μg。随着虫龄的增加，相应的dsrna导入量也要增加，当干扰效率达到40％-50％或以上时为干扰成功。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中利用生物信息学技术，分析了本实验室已经测定的棉铃虫取食棉花、大豆、玉米和辣椒四种不同寄主植物条件下的转录组，再结合ncbiblast等程序，确定了棉铃虫cyp6ab9基因。
棉铃虫室内饲养品系(96s)最初于1996年采集自中国农业科学院新乡实验基地。人工饲料饲养至今，饲养条件为温度27±2℃，相对湿度75％±10％，光周期14hl：10hd，成虫羽化后饲喂配制的10％糖水。
实施例1rna的提取
(a)将收集的棉铃虫幼虫、蛹和成虫，用液氮进行研磨，取50-100mg粉末转移至1.5mlrnase-free离心管中，加入1mltrizol充分混匀。室温孵育5min，以利于匀浆样品中核蛋白体完全分离。
(b)加入200μl氯仿，震荡15s，室温静置5min，然后在12000rpm、4℃条件下离心15min。
(c)取上清400μl于新的离心管中，随后加入等体积的异丙醇，上下颠倒至充分混匀，室温静置10min，在12000rpm、4℃条件下离心10min。
(d)弃上清，加入1ml75％乙醇轻轻洗涤，随后12000rpm、4℃条件下离心5min。
(e)去除上清液，室温干燥沉淀后，加入50-150μl无核酶水充分溶解。
实施例2cdna的合成
使用反转录试剂盒(transscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix)，按照其操作说明对实施例1中提取的总rna逆转录合成cdna。具体操作如下：
配置体系如下表：
轻轻混匀，42℃下孵育15min；85℃加热5s失活反转录酶。反应完毕后，于-80℃超低温冰箱保存。
实施例3dsrna的制备
选取gfp基因(绿色荧光蛋白)作为对照基因，该基因在昆虫体内并不存在，且大量研究均采用gfp作为对照基因合成dsrna。
1)cyp6ab9基因引物的设计：
根据靶标基因cyp6ab9基因(seqidno.5)的序列，采用引物设计软件primerpremier5设计带有t7启动子的引物，送至上海生工进行引物合成。引物序列如下：
2)目的片段pcr扩增及dsrna的制备
以棉铃虫cdna为模板，用fastpfu酶扩增基因。反应体系如下：
以上反应液混匀之后，短暂离心，然后于pcr仪中按如下程序进行反应：
pcr扩增完成后，按照wizardsvgelandpcrclean-upsystem试剂盒说明书回收pcr产物。随后，参照南京诺唯赞公司的t7highyieldrnatranscriptionkit使用说明书合成dsrna，dsrna中正义链的序列为seqidno.1所示：
移液枪轻轻混匀各组分，短暂离心，37℃孵育4h。在反应体系中加入1μl的dnasei，37℃孵育15min，消化转录的dna模板。合成的dsrna电泳分析、纯化后保存备用。
实施例4dsrna注射
挑选同一天体型均匀的3龄幼虫，置于冰上。通过拉针仪拉出的毛细管将2.5μg的实施例3中的dsrna注射到幼虫的腹部倒数第二与第三足节间处作为实验组，注射dsgfp作为对照组。
1)注射dsrna后棉铃虫取食棉酚饲料体重增长测定
注射后的幼虫单头放置在装有正常饲料的24孔板中恢复24h，然后随机选取实验组和对照组棉铃虫样本各8只，称取体重记录m1，转移至含有0.1％的棉酚饲料中，72h后称取记录m2，试验重复3次。将3次试验的结果汇总统计，结果图1所示，可以看出，注射cyp6ab9基因dsrna的幼虫体重增长与对照组(dsgfp)相比明显受到抑制(*表示p<0.05)。说明在棉酚胁迫条件下，cyp6ab9基因dsrna会导致棉铃虫的生长受到明显的抑制。
2)沉默效率检测
在实验组和对照组分别注射dsrna和dsgfp的24h和72h，准备样品并利用qpcr技术检测cyp6ab9基因的沉默效率，内参基因选择β-actin。所有检测包括3个生物学重复，每个重复包含5个样品，利用spss软件的独立样本t测验进行差异显著性分析。结果如图2所示，本发明提供的dsrna明显抑制了cyp6ab9基因的表达，24h时抑制效果明显，结果说明在生测时间内cyp6ab9基因的表达被抑制的效果明显，72h后因为dsrna在体内会有降解，抑制效果有所下降。
其中，内参基因β-actin的引物为：β-actin-f：5’-cctggtattgctgaccgtatgc-3’(seqidno.8)，β-actin-r：5’-ctgttggaaggtggagagggaa-3’(seqidno.9)。
3)cyp6ab9基因对昆虫生长发育的影响
将实验组和对照组的样本一起饲喂正常饲料，选取实验组和对照组棉铃虫样本各8只，重复试验3次，观察体重变化，结果如图3所示，72h后发现两种体重增长无显著差异，排除了cyp6ab9基因自身参与调节棉铃虫幼虫生长发育的可能。
上述结果表明，棉铃虫cyp6ab9基因参与了棉酚的解毒代谢过程。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
sequencelisting
<110>中国农业科学院深圳农业基因组研究所
<120>cyp6ab9基因和干扰棉铃虫棉酚代谢的dsrna及二者在防治棉铃虫中的应用
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