本发明涉及人mmp13基因干扰序列、shrna-mmp13病毒及低表达mmp13蛋白的细胞系。
背景技术：
股骨头坏死(osteonecrosisofthefemoralhead,onfh)是一种常见的骨科疑难疾病。股骨头坏死以骨组织缺血坏死为特征性病理表现，进而造成股骨头塌陷变性，并最终发展成为骨性关节炎。基质金属蛋白酶-13(matrixmetalloproteinases-13，mmp13)是在骨关节炎(osteoarthritis,oa)发生发展过程中的一种关键介质。在正常滑膜组织中，其表达很低，但在骨性关节炎的滑膜中广泛表达(matrixmetalloproteinasesinvolvementinpathologicconditions,2010)。金属基质蛋白酶家族其他亚型降解ⅱ型胶原也需要通过mmp13起作用。而ⅱ型胶原是构成软骨基质中最具特征性且含量最多的成分。因此在oa的疾病发展过程中，mmp13启动了早期的软骨破坏机制(istherearoleforinatrialfibrillation,2009)。正常滑膜组织中，mmps(基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases)与组织蛋白酶抑制剂(tissueinhibitorsofmetalloproteinases,timps)的表达呈动态平衡。在滑膜炎症时，mmps与timps之间的平衡被打破，mmps将会在滑膜细胞中大量表达，mmp13的表达明显增高(matrixmetalloproteinasesinvolvementinpathologicconditions，2010)。目前，大都通过动物模型来研究骨关节炎的病理发生过程，实验周期长，操作不方便。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种人mmp13基因干扰序列、shrna-mmp13病毒及低表达mmp13蛋白的细胞系。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种人mmp13基因干扰序列，如seqidno1所示。
一种人shrna-mmp13病毒，为权利要求1的序列构建到plkd-cmv-g&pr-u6-shrna质粒中，然后包装成病毒。
以及一种低表达mmp13蛋白的细胞系，为被上述shrna-mmp13病毒感染的sw1353细胞。
优选的，所述软骨细胞为sw1353细胞系或humanchondrocyte细胞系。
基于mmp13抑制剂在治疗oa方面已取得了显著进步(newhopeforthetreatmentofosteoarthritisthroughselectiveinhibitionofmmp13,2011)、以及onfh与oa滑膜具有的相似病理现象，以mmp13为靶点，进行onfh的相关研究，有望为提供临床的诊断及开展相关治疗提供新的理论及实验依据。本发明以慢病毒为载体构建表达干扰mmp13蛋白表达的shrna。慢病毒基因组可以整合到宿主基因组中，从而稳定表达外源基因。质粒中含有puromycin抗性基因和gfp基因，可在药物压力和荧光蛋白双重条件下筛选，更方便阳性克隆的筛选。本发明提供的在软骨细胞中低表达mmp13的稳定细胞系，可用于研究低表达mmp13所引起的相关蛋白表达量的变化，从而找出与onfh发生发展相关的机理，为临床和治疗提供更多的靶点。在细胞水平上研究骨关节炎的病理发生过程，可以缩短实验周期，更便利地进行科学研究。
附图说明
图1为plkd-cmv-g&pr-u6-shrna质粒的结构示意图。
图2为plkd-cmv-g&pr-u6-shrna(mmp13)干扰质粒的结构示意图。
具体实施方式
实施例1
1)根据人mmp13(ncbireferencesequence:nm_002427.3)基因设计shrna作用位点ctgatatgactcattctgaagt(seqidno1)。引物合成，将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入agei和ecori双酶切线性化的plkd-cmv-g&pr-u6-shrna(和元生物技术(上海)股份有限公司)干扰载体，替换掉原来的ccdb毒性基因。菌落pcr筛选转化子，筛选的阳性克隆进行测序验证。测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。
2)病毒包装。构建好的质粒由和元生物技术(上海)股份有限公司进行病毒包装：将提取的高纯度目的质粒与包装质粒plp1-gag/pol、plp2-rev和plp/vsvg(和元生物技术(上海)股份有限公司)共转入293t细胞；显微镜下观察转染效率；转染72h后收集含病毒的上清液，过滤纯化，滴度测定后-80℃保存。
3)24孔板培养sw1353细胞(北京北纳创联研究院)，37℃，co2培养箱培养过夜；当细胞汇合度达到50％时，从-80°冰箱取出shrna-mmp13病毒于冰上融化；
4)用无抗无血dmem以1:10,1:100,1:1000分别稀释以上病毒，每个24孔分别加入各稀释度的病毒500ul，于37°co2培养箱培养过夜后用10％fbs+dmem+双抗换液；
5)换液48h后于荧光显微镜下观察感染效率，选择感染效率高且荧光强的孔，胰酶消化后终止，制备的单细胞悬液600转，离心5min；
6)配置10％fbs+dmem+双抗+puro培养基，用该培养基悬浮细胞沉淀，每个24孔的细胞铺6个24孔，3-5天更换新鲜的上述培养基；(整个病毒操作过程严格遵照慢病毒操作手册)
7)挑选荧光强的单克隆孔，胰酶消化，血清终止后，用10％fbs+dmem+双抗+puro培养基扩培，直至10cmdish长满，1/3细胞冷冻保藏，1/3收细胞沉淀用于westernblot检测，1/3收细胞沉淀加1mltrizol混合均匀用于rt-pcr检测
8)确定阳性克隆株。westernblot确定阳性克隆株：以gapdh蛋白为内参，比较感染干扰质粒的细胞与对照细胞中mmp13蛋白表达量的变化。干扰细胞中mmp13蛋白表达量比对照细胞低的为阳性克隆株；rt-pcr确定阳性克隆株：以18srrna基因为内参，比较感染干扰质粒的细胞与对照细胞中mmp13基因表达量的变化。干扰细胞中mmp13基因表达量比对照细胞低的为阳性克隆株。westernblot和rt-pcr检测均为阳性的细胞株，即低表达mmp13稳定细胞株。
步骤3)中也可用humanchondrocyte细胞系(妙通(上海)生物科技有限公司)来替代sw1353细胞系。
序列表
<110>天德悦（北京）生物科技有限责任公司
<120>人mmp13基因干扰序列、shrna-mmp13病毒及其低表达细胞系
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>homosapiens
<400>1
ctgatatgactcattctgaagt22