本发明属于抗病育种技术领域，具体涉及一种甜瓜疫病抗性鉴定方法。
背景技术：
甜瓜(cucumismelol.)是葫芦科(cucurbitaceae)的一种重要的水果型蔬菜作物。自上世纪80年代以来，我国成为世界上甜瓜种植面积和产量最大的国家。甜瓜种质资源多样，具有丰富的遗传多样性，据考证至少有3000份。
甜瓜疫病又称死秧，由疫霉菌引起的一种具有毁灭性的土传病害，该病的发病周期短，传播速度快，一旦发病就很难治愈，在我国的甜瓜产区，尤其是广东、广西、海南等南方地区发生严重，病株率可达20％～40％，严重的甚至绝收，给瓜农造成严重的经济损失，成为甜瓜种植业发展的主要障碍之一。虽然通过化学、物理、农业等防治措施可以在一定程度上减轻疫病所造成的危害，但是这些方法并不能从根本上解决问题，甚至还会对环境造成破坏，而采用抗疫病的品种是一种经济、有效、环保的防治手段。
关于瓜类疫病病原菌的研究早在1968年就已展开，主要是根据病菌的形态学特性进行分类。据现有报道，侵染瓜类的疫霉菌主要有辣椒疫霉菌(phytophthoracapsici)、瓜类疫霉菌(p.melonis)、掘氏疫霉菌(p.drechsleritucker)、烟草疫霉菌(p.nicotianaebread)等4种，但是不同瓜类作物上疫霉菌的病原物有所不同，一种病菌又可侵染多种瓜类作物，从而导致同一作物可被多种病菌侵染。研究表明，引起甜瓜疫病的病原有辣椒疫霉菌、瓜类疫霉菌和掘氏疫霉菌。其中辣椒疫霉菌在世界各地的甜瓜产区均有报道，是用于甜瓜抗疫病研究的主要病原。
技术实现要素：
本发明提供一种甜瓜疫病抗性鉴定方法，该方法对166份甜瓜材料进行了疫病抗性鉴定，确定了更为直观、便于观察统计的甜瓜疫病的病情分级标准。
本发明的技术方案如下：一种甜瓜疫病抗性鉴定方法，包括以下步骤：
步骤1：甜瓜幼苗的培养：
在环境温度为20～30℃、营养土含水量为80％～90％的条件下，将甜瓜种子直播于装有营养土的穴盘中。种子萌发后，营养土含水量控制在60％～80％。待甜瓜幼苗的两片子叶完全展开后间苗，待甜瓜幼苗的两片真叶展平时，人工接种辣椒疫霉菌。
步骤2：接种液的制备：
制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基和胡萝卜琼脂培养基，将辣椒疫霉菌的菌丝先在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行活化培养，然后挑取菌落边缘的菌丝接种到胡萝卜琼脂培养基中进行产孢培养，接着向装有胡萝卜琼脂培养基的培养皿中加入无菌水，无菌水要没过菌丝，再将培养皿置于4℃冰箱中，30～60min后移至光照下放置，30～60min后将培养皿中的孢子悬浮液吸出，过滤去除菌丝，然后用无菌水稀释至每lml中有106个游动孢子。
步骤3：接种：
接种前将穴盘中的营养土用水浇透，然后向距离甜瓜幼苗茎基部1.0～1.5cm的营养土中注射1ml浓度为106个/ml的游动孢子悬浮液，注射深度为1～2cm，一天后重复接种一次，接种后环境温度控制在30℃，营养土含水量控制在90％。
步骤4：病情调查及统计：
接种10天后对甜瓜幼苗的抗病情况进行调查，根据病情分级标准进行分级，然后根据病情分级结果计算病情指数，进而划分抗性水平。所述病情分级标准以病斑是否超过甜瓜幼苗上的分级节点和甜瓜幼苗的生长状态为依据来进行划分，所述分级节点包括甜瓜幼苗的茎基部、子叶和全株。
进一步地，所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基的制备方法包括如下步骤：称取200g马铃薯，去皮后切成块，在去离子水中煮沸30min，然后过滤去除残渣，加入20g葡萄糖和15g琼脂粉，最后加水定容至1l，高压蒸汽灭菌30min。
进一步地，所述胡萝卜琼脂培养基的制备方法包括如下步骤：称取200g胡萝卜，捣碎后，过滤去除残渣，加入16g琼脂粉，定容至1l，高压蒸汽灭菌30min。
进一步地，所述活化培养的培养条件为：在25℃下暗培养5天。
进一步地，所述产孢培养的培养方法包括以下步骤：将活化培养得到的菌丝先在25℃条件下进行暗培养，待菌丝布满整个培养基后，光暗交替培养7天，所述光暗交替培养的光照培养时间为12h，黑暗培养时间为12h。
进一步地，所述病情分级标准为：
0级：无症状；
1级：幼苗茎基部出现水渍状褐色病斑，轻微缢缩，植株不倒伏，不萎蔫；
2级：幼苗茎基部缢缩，褐色病斑未超过子叶，植株倒伏，子叶不萎蔫，真叶不萎蔫；
3级：幼苗茎部褐色病斑超过子叶，子叶萎蔫，真叶不萎蔫；
4级：幼苗茎部褐色病斑蔓延至全株，子叶干枯，真叶萎蔫，生长点不萎蔫；
5级：植株枯萎死亡。
进一步地，所述抗性水平划分标准为：
免疫：病情指数为0；
高抗：病情指数为0<di≤10；
抗病：病情指数为10<di≤30；
中抗：病情指数为30<di≤50；
感病：病情指数为50<di≤70；
高感：病情指数为70<di≤100。
所述di为病情指数。
本发明还提供了上述方法在甜瓜育种中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、甜瓜疫病抗性鉴定是甜瓜育种工作和遗传学研究的重要环节，通过人工接种鉴定，可明确抗性种质，有助于亲本的选配，提高育种效率。
2、本发明的病情分级标准以病斑是否超过甜瓜幼苗上的分级节点和甜瓜幼苗的生长状态为依据来进行划分，所述分级节点包括甜瓜幼苗的茎基部、子叶和全株。这些节点显而易见，更为直观，便于统计者观察，不必再去测量病斑的面积或长度，节省了成本，提高了工作效率。
3、本发明在距离甜瓜幼苗1.0～1.5cm的营养土中注入辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液，注射深度为1～2cm，使甜瓜疫病在全株的发病情况得以观察，避免因为只接种单个组织而观察者需要计算病斑大小，从而增加工作难度和工作量。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明的保护内容并不局限于下述具体实施例。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例甜瓜种质资源对疫病的抗性分析
1.1试验材料
供试甜瓜种质资源166份，其中包括薄皮类型甜瓜(cucumismelol.subsp.agrestis)41份，厚皮类型甜瓜(cucumismelol.subsp.melo)104份，野生品种(cucumismelol.agrestis)15份，近缘种(cucumiszayherii)6份。辣椒疫霉菌菌株是从海南育种基地的甜瓜病株分离得到的。
1.2试验方法
1.2.1辣椒疫霉菌的分离与鉴定
从田间选取具有水渍状褐色病斑且植株缢缩或倒伏的甜瓜植株，采集果实或茎叶，用无菌水冲洗干净，切取病健交界处的组织3块，置于马铃薯蔗糖琼脂培养基平板上(含氨苄青霉素50ppm，利福平25ppm)，25℃条件下培养2天后，挑去菌落边缘的少许菌丝，转接到含抗生素的新的培养基中，2天后再挑去菌落边缘的少许菌丝转接至无抗生素的马铃薯蔗糖琼脂培养基平板上，培养5天后切取分离的病原物菌块回接到甜瓜植株茎基部，选取能表现出与田间症状相同的病原物进行后续形态学鉴定和分子生物学鉴定。
将上述病原菌进行产孢培养，观察其孢子囊和游动孢子形态。另外，利用已报道的特异引物对病原菌的核糖体基因内转录间隔区域(internaltranscribedspacer,its)进行pcr扩增、测序，将测序结果与已报到的疫霉菌its序列进行比对，确定该病原菌的种类(bonantsetal.,1997；zhangetal.,2006；wangetal.,2007)。
通过形态学观察发现该病原菌孢子囊顶端具有辣椒疫霉菌所特有的乳突结构。此外，通过比对发现，特异引物的扩增序列能完全比对到genbank中多个辣椒疫霉菌菌株的its序列，因此可认定该菌株为辣椒疫霉菌。
1.2.2甜瓜幼苗的培养
在环境温度20～30℃、营养土含水量为80％～90％的条件下，将供试甜瓜种子直播于装有营养土的50孔穴盘中，每个品种播25穴，每穴播2粒种子。种子萌发后，营养土含水量控制在70％左右。待甜瓜幼苗的两片子叶完全展开后间苗，每个品种留25株幼苗。待甜瓜幼苗的两片真叶展平时，人工接种辣椒疫霉菌。
1.2.3接种液的制备
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda培养基)的制备：称取200g马铃薯，去皮后切成小块，在去离子水中煮沸30min，用两层纱布过滤去除残渣，加入20g葡萄糖，15g琼脂粉，加水定容至1l，高压蒸汽灭菌30min。
胡萝卜琼脂培养基(ca培养基)的制备：称取200g胡萝卜，用榨汁机捣碎后，用两层纱布过滤去除残渣，加入16g琼脂粉，定容至1l，高压蒸汽灭菌30min。
将辣椒疫霉菌的菌丝先在pda培养基上进行活化培养，25℃暗培养5天，之后挑取菌落边缘的菌丝接种到ca培养基中进行产孢培养：先在25℃条件下进行暗培养，待菌丝布满整个培养基后，进行光暗交替培养(12h光照/12h黑暗)，7天后检测产孢情况。向培养皿中加入5ml无菌水，使菌丝完全被浸湿，将培养皿置于4℃冰箱中，45min后移至光照下，接着45min后游动孢子释放，将培养基中的孢子悬浮液吸出，并用两层纱布过滤去除菌丝，用血球计数板计算游动孢子的数量，并用无菌水稀释至每lml中l06个游动孢子。
1.2.4接种
接种前将穴盘中的营养土用水浇透，向距离甜瓜幼苗茎基部1cm的营养土中注射1ml浓度为1×106个/ml的游动孢子悬浮液，注射深度为1.5cm，一天后重复接种一次，接种后环境温度控制在30℃左右，营养土含水量控制在90％左右。
1.2.5病情调查及统计方法
接种10天后对植株的抗病情况进行调查并分为0～5级，具体如下：
0级：无症状；
1级：幼苗茎基部出现水渍状褐色病斑，轻微缢缩，植株不倒伏，不萎蔫；
2级：幼苗茎基部缢缩，褐色病斑未超过子叶，植株倒伏，子叶不萎蔫，真叶不萎蔫；
3级：幼苗茎部褐色病斑超过子叶，子叶萎蔫，真叶不萎蔫；
4级：幼苗茎部褐色病斑蔓延至全株，子叶干枯，真叶萎蔫，生长点不萎蔫；
5级：植株枯萎死亡。
病情指数(diseaseindex，di)计算方法如下：
公式中：di表示病情指数；s表示各级病情指数的代表数值；n表示各发病级别的植株数；n表示调查的植株总数；s表示最高病情级别的代表数值。
根据病情指数划分抗性水平：
免疫(i)：病情指数为0；
高抗(hr)：病情指数为0<di≤10；
抗病(r)：病情指数为10<di≤30；
中抗(mr)：病情指数为30<di≤50；
感病(s)：病情指数为50<di≤70；
高感(hs)：病情指数为70<di≤100。
3.甜瓜资源的抗疫病鉴定结果
通过苗期接种鉴定，166份甜瓜品种资源中，有4份免疫材料，占2.41％；高抗材料25份，占15.06％；抗病材料30份，占18.07％；中抗材料29份，占17.47％；感病材料25份，占15.06％；高感材料53份，占31.93％。zqk9、pi140637、pi165514和pi381772在接种后未出现发病症状，表现为免疫。表现为高抗的25份材料在接菌后只有个别单株下胚轴出现轻微病斑。有4份(黄香瓜、e31、pi165515和pi614395)在接菌后植株发病迅速，病株率100％，死亡率100％，表现为高感，可作为感病对照品种用于后续抗性鉴定试验，见表1。
表1供试甜瓜材料的种质类型、地理来源及抗性表现
本实施例对166份甜瓜材料进行了抗疫病鉴定，筛选出4份免疫材料和25份高抗材料。这些材料的抗性基因可以通过不同的育种方法转移到农艺性状优良但抗性差的甜瓜品种中。
以上所述之实施例，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。