本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种id1基因的sgrna、id1基因的敲除方法、bhk-21细胞系及其用途。
背景技术：
口蹄疫(foot-and-mouthdisease，fmd)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，fmdv)引起的猪、牛和羊等偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病。fmdv具有a、o、asia1、c、sat1、sat2和sat3共7个不同的血清型，血清型间无交叉保护。
多年来，o型和a型两种血清型的口蹄疫疫情严重危害我国养殖业。asia1型口蹄疫在2007年更换疫苗毒株以后，疫情迅速得以控制，2009年之后未见临床报道，目前已经趋于消亡。2010年，o型mya-98毒株传入我国，引发严重疫情，使得流行于我国的o型口蹄疫更为复杂；a型sea-97g1毒株和g2毒株自2009年和2013年先后传入我国，已致我国多省爆发疫情，造成巨大经济损失。
目前，我国主要流行的是o型和a型两个血清型，流行毒株主要有o型mya-98毒株、panasia毒株和a型sea-97g2毒株，鉴于国内和周边国家口蹄疫流行的复杂现状及口蹄疫各血清型之间无交叉免疫的现象，现急需研制针对o型和a型流行毒株的针对性疫苗，且要求该疫苗具备高效性，广谱性，能同时预防多个毒株，对当前流行毒株都能有效保护等特点，为我国和周边流行国家提供一种高效的疫苗。
目前在口蹄疫疫苗的生产过程中使用的是野生型的bhk-21细胞系，而野生型bhk-21细胞系中的病毒滴度较低，这使得口蹄疫疫苗的生产成本较高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种id1基因的sgrna、一种敲除bhk-21细胞中id1基因的方法、一种id1敲除的bhk-21细胞系、一种bhk-21细胞系在制备口蹄疫疫苗中的用途，使其用于口蹄疫疫苗的生产，从而降低口蹄疫疫苗的生产成本。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供了一种id1基因的sgrna，其序列如seqidno：1～2或seqidno：3～4任一对所示；
seqidno：1：caccgggcgcgggcgaggttgtgct；
seqidno：2：aaacagcacaacctcgcccgcgccc；
seqidno：3：caccgcgccctgctggacgagcagc；
seqidno：4：aaacgctgctcgtccagcagggcgc，
其中，seqidno：1和seqidno：3为正向引物；
seqidno：2和seqidno：4为正向引物。
另外，本发明的实施例还提供了一种敲除bhk-21细胞中id1基因的方法，包括如下步骤：
(1)在genbank中找到id1的基因序列，然后使用软件设计并获得id1基因的sgrna；sgrna的序列如seqidno：1～2或seqidno：3～4所示；
(2)将步骤(1)中的sgrna序列构建到pspcas9(bb)-2a质粒中，获得阳性质粒，备用；
(3)培养bhk-21细胞，待bhk-21的细胞密度达到60％～80％时进行转染，备用；
(4)将步骤(2)中的质粒用培养基稀释，备用；
(5)将预设摩尔量的培养基与预设摩尔量的转染试剂混合均匀，静置，备用；
(6)将步骤(4)和(5)中的备用试剂混合均匀，即为转染混合物；
(7)将步骤(6)中转染混合物加入步骤(3)中的bhk-21细胞并混合均匀，并置于培养箱中培养，筛选获得敲除id1基因的bhk-21细胞。
另外，本发明的实施例还提供了一种id1敲除的bhk-21细胞系。
另外，本发明的实施例还提供了一种id1敲除的bhk-21细胞系在制备口蹄疫疫苗中的用途。
本发明实施例相对于现有技术而言，由于id1在体内可以抑制病毒增殖，通过crispr-cas9敲除bhk-21细胞中的id1基因，使得口蹄疫病毒在该bhk-21细胞系中的病毒滴度增加，从而降低了口蹄疫疫苗的生产成本。
另外，步骤(3)包括：向bhk-21细胞中加入5～10ml灭菌pbs溶液，轻轻晃动，漂洗细胞，弃去pbs溶液，重复2～4次；加入2～4ml胰蛋白酶消化，消化1～3min后弃胰蛋白酶；加入10～15ml含10～15％胎牛血清的完全培养基调整bhk-21细胞密度，重新接种于60mm细胞培养皿中，继续培养，待bhk-21细胞密度60～80％时进行转染。
另外，步骤(4)包括：取2～4μg步骤(2)中的备用质粒加入250～300μlopti-mem溶液中稀释，备用。
另外，步骤(5)包括：取4～8μllipofectamine2000加入250～300μl的opti-mem溶液混合均匀，静置，备用。
另外，步骤(6)包括：将步骤(4)和(5)中的备用物混合均匀，室温孵育20min，得到转染混合物。
另外，在步骤(6)与(7)之间还包括：用pbs溶液漂洗步骤(3)中的bhk-21细胞，重复2～4次，加入2mlopti-mem溶液。
另外，步骤(7)包括：将步骤(6)中的转染混合物加入步骤(3)中的bhk-21细胞并混合均匀，放置于细胞培养箱中培养；培养6～8h后弃去培养基，每盘细胞加入pbs溶液，洗去残留的转染混合物；每盘细胞加入含10～15％胎牛血清的dmem细胞培养基3ml，放置于培养箱内继续培养24～48h后，加嘌呤霉素筛选后即可得到敲除id1基因的bhk-21细胞。
附图说明
图1是根据本发明实施例3中westernblot鉴定id1敲除bhk-21细胞系的示意图；
图2是根据本发明实施例4westernblot鉴定id1敲除bhk-21细胞系促进口蹄疫病毒复制示意图；
图3是根据本发明实施例4口蹄疫病毒在id1敲除细胞系中的滴度增加示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施例进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施例的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
id(inhibitorofdifferentiation；inhibitorofdnabinding)蛋白家族包括id1、id2、id3和id4。id1蛋白本身没有dna结合活性，但它可以与bhlh蛋白形成异源二聚体，抑制bhlh蛋白的dna结合活性和转录激活能力。该蛋白是广泛存在于哺乳动物细胞中的核转录因子负调控蛋白，在细胞生长、衰老和分化中发挥作用，与肿瘤的发生和发展密切相关。
bhk细胞是指幼年叙利亚仓鼠肾细胞(babyhamstersyriankidney)，1961年建株。原始的细胞株是成纤维细胞，贴壁依赖性。1963年获得单细胞克隆细胞。后经无数次传代后细胞可悬浮生长，它广泛用于增殖各种病毒，生产兽用疫苗。最常用的是bhk-21的一个亚克隆细胞，即克隆13或c13。
另外，crispr-cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats-cas9)是一种日趋成熟的、新兴的基因编辑技术。使用一段序列特异性向导rna(sgrna)引导核酸内切酶(cas9)到切割靶点，从而完成对基因组的编辑过程。切开的dna可以通过非同源末端链接(nhej)的方式修复dna损伤，从而造成开放阅读框的改变，影响基因的转录与翻译过程。
在口蹄疫疫苗的制备过程中，我们也会经常用到bhk-21细胞系，由于id1在体内可以抑制病毒增殖，当bhk-21细胞系中的内源性id1被敲除后，bhk-21细胞系中的病毒滴度增加，从而在bhk-21细胞系中产生较高的病毒滴度，该细胞株的应用可以大大降低口蹄疫疫苗的生产成本。
实施例1
一种敲除bhk-21细胞中id1基因的方法，包括如下步骤：
在genbank中找到id1的基因序列(nw_004801816.1和xm_021223030)，利用sgrna设计网站http://crispr.mit.edu/获得id1基因的sgrna；sgrna序列如seqidno：1～2所示；
正向：seqidno：1：caccgggcgcgggcgaggttgtgct；
反向：seqidno：2：aaacagcacaacctcgcccgcgccc。
将步骤(1)中的sgrna序列构建到pspcas9(bb)-2a质粒(可购买得到)中，获得阳性质粒，备用；
需要说明的是，由于本步骤中的构建方法均为本领域比较常见的方法，故在此不一一叙述。
培养bhk-21细胞，待bhk-21的细胞密度达到60％～80％时进行转染，备用；
具体地，向bhk-21细胞中加入5～10ml灭菌pbs溶液，轻轻晃动，漂洗细胞，弃去pbs溶液，重复2次；加入3ml胰蛋白酶消化，消化1～3min后弃胰蛋白酶；
加入10ml含10％胎牛血清的完全培养基调整bhk-21细胞密度，重新接种于60mm细胞培养皿中，继续培养，待bhk-21细胞密度60％时进行转染。
将步骤(2)中的质粒用250μl减血清培养基稀释，备用；
具体地，取2μg步骤(2)中的质粒加入250μlopti-mem溶液中稀释，备用。
(5)将250μl减血清培养基与4μl转染试剂混合均匀，静置，备用；
具体地，取4μllipofectamine2000加入250μl的opti-mem溶液混合均匀，静置，备用。
(6)将步骤(4)和(5)中的备用试剂混合均匀，即为转染混合物；
具体地，将步骤(4)和(5)中的备用试剂混合均匀，室温孵育20min，形成含dna和lipofectamine2000的转染混合物。
优选地，在步骤(6)与(7)之间还包括：
用pbs溶液漂洗步骤(3)中的bhk-21细胞，重复3次，加入2mlopti-mem溶液。
(7)将步骤(6)中转染混合物加入步骤(3)中的bhk-21细胞并混合均匀，置于培养箱中培养加嘌呤霉素筛选后即可得到敲除id1基因的bhk-21细胞。
具体地，将步骤(6)中的转染混合物加入步骤(3)中的bhk-21细胞并混合均匀，置于37℃,5％co2细胞培养箱培养；
培养6h后弃去培养基，每盘细胞加入pbs溶液，洗去残留的转染混合物；
每盘细胞加入含10％胎牛血清的dmem细胞培养基3ml，于37℃、5％co2培养箱内继续培养48h，加嘌呤霉素筛选即可得到敲除id1基因的bhk-21细胞。
与现有技术相比，由于id1在体内可以抑制病毒增殖，通过crispr-cas9敲除bhk-21细胞中的id1基因，使得bhk-21细胞系中的病毒滴度增加，从而降低了口蹄疫疫苗的生产成本。
实施例2
一种敲除bhk-21细胞中id1基因的方法，包括如下步骤：
(1)在genbank中找到id1的基因序列(nw_004801816.1和xm_021223030)，然后从http://crispr.mit.edu/网站设计获得id1基因的sgrna；sgrna的序列如seqidno：3～4所示；
正向：seqidno：3：caccgcgccctgctggacgagcagc；
反向：seqidno：4：aaacgctgctcgtccagcagggcgc。
(2)将步骤(1)中的sgrna序列构建到pspcas9(bb)-2a质粒(可购买得到)中，获得阳性质粒，备用；
需要说明的是，由于本步骤中的构建方法均为本领域比较常见的方法，故在此不一一叙述。
(3)培养bhk-21细胞，待bhk-21的细胞密度达到60％～80％时进行转染，备用；
具体地，向bhk-21细胞中加入5～10ml灭菌pbs溶液，轻轻晃动，漂洗细胞，弃去pbs溶液，重复3次；加入3ml胰蛋白酶消化，消化1～3min后弃胰蛋白酶；
加入10ml含10％胎牛血清的完全培养基调整bhk-21细胞密度，重新接种于60mm细胞培养皿中，继续培养，待bhk-21细胞密度60％时进行转染。
(4)将步骤(2)中的质粒用250μl减血清培养基稀释，备用；
具体地，取2μg步骤(2)中的质粒加入250μlopti-mem溶液中稀释，备用。
(5)将250μl减血清培养基与4μl转染试剂混合均匀，静置，备用；
具体地，取4μllipofectamine2000加入250μl的opti-mem溶液混合均匀，静置，备用。
(6)将步骤(4)和(5)中的备用试剂混合均匀，即为转染混合物；
具体地，将步骤(4)和(5)中的备用试剂混合均匀，室温孵育20min，形成含dna和lipofectamine2000的转染混合物。
优选地，在步骤(6)与(7)之间还包括：
用pbs溶液漂洗步骤(3)中的bhk-21细胞，重复3次，加入2mlopti-mem溶液。
(7)将步骤(6)中转染混合物加入步骤(3)中的bhk-21细胞并混合均匀，置于培养箱中培养，加嘌呤霉素筛选即可得到敲除id1基因的bhk-21细胞。
具体地，将步骤(6)中的转染混合物加入步骤(3)中的bhk-21细胞并混合均匀，置于37℃,5％co2细胞培养箱培养；
培养6h后弃去培养基，每盘细胞加入pbs溶液，洗去残留的转染混合物；
每盘细胞加入含10％胎牛血清的dmem细胞培养基3ml，于37℃、5％co2培养箱内继续培养48h，加嘌呤霉素筛选即可得到敲除id1基因的bhk-21细胞。
实施例3
crispr-cas9靶向敲除id1的bhk-21细胞系的筛选及鉴定，具体步骤如下：
取本发明第一实施例中的敲除id1基因的bhk-21细胞，加入终浓度3μg/ml的嘌呤霉素筛选5～7天后(转染进去质粒的阳性细胞中的抗嘌呤霉素的基因会表达，加入嘌呤霉素后不会被杀死；而未转进质粒的阴性细胞不表达嘌呤霉素，则会被杀死，经过筛选得到的最终存活的为阳性细胞)，进行细胞计数，分别铺100个和300个细胞，一周后单个细胞克隆形成后用克隆环挑取单克隆，转移至24孔板，扩大培养。提取细胞基因组dna和蛋白分别进行鉴定，然后用阳性克隆细胞系进行口蹄疫病毒感染，分别收取上清和细胞进行检测。
其中，基因组dna的鉴定步骤如下：
使用takara公司dna提取试剂盒，提取基因组dna，将dna产物进行pcr扩增，引物序列为：
正向引物
seqidno：5：cgcggatccatgaaggtcgccagtggtagca，
反向引物
seqidno：6：acgcgtcgactcagcgacacaagatgcgatc。
反应条件为95℃3min，95℃10s，53℃30s，72℃60s，从第二步开始循环39次。2％琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物，将目的条带回收，送测序公司测序。
另外，蛋白用westernblot鉴定，具体方法如下：使用蛋白质提取试剂盒提取细胞中总蛋白，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以β-actin为内参，检测id1的表达，结果如图1所示，在id1敲除的bhk-21中，即id1-ko.1和id1-ko.7，没有id1表达，其中，ctrl为只转染空载体的bhk-21。
实施例4
病毒感染实验
鉴定得到的阳性克隆细胞系大量扩增，按2.5*106铺6孔板，待细胞密度达80％时按0.01moi感染口蹄疫病毒，8h后观察病变，然后分别收集细胞和上清检测病毒复制情况，结果如图2和图3所示。图2为收集细胞后用westernblot检测口蹄疫病毒结构蛋白vp1的表达情况，结果显示id1敲除细胞系中vp1的表达丰度相比对照细胞系显著升高。图3为收集上清后检测口蹄疫病毒滴度的结果，与图2结果相一致，id1敲除细胞系中病毒滴度也显著提高。其中，图2和图3中的对照细胞系(ctrl)为只转染空载体的bhk-21。这些结果充分说明id1敲除后显著促进了口蹄疫病毒的复制。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施例是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
序列表
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>id1基因的sgrna、id1基因的敲除方法、bhk-21细胞系及其用途
<130>1
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
caccgggcgcgggcgaggttgtgct25
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
aaacagcacaacctcgcccgcgccc25
<210>3
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
caccgcgccctgctggacgagcagc25
<210>4
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
aaacgctgctcgtccagcagggcgc25
<210>5
<211>31
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
cgcggatccatgaaggtcgccagtggtagca31
<210>6
<211>31
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
acgcgtcgactcagcgacacaagatgcgatc31