本发明涉及一种树枝状dna组装体的制备方法及其用途，属于生物医药技术领域。
背景技术：
2004年danluo研究课题组首次报道了树枝状dna的组装结构和方法(naturematerials2004,3,38)，之后经过一些列的改进(biomacromolecules2015,16,1095；acsnano2014,8,6171；angew.chem.int.ed.2012,124,11433)，形成了现有的树枝状dna组装体(dnadendrimer)的方法。已有的技术通过三条单链dna(20mm每条链)在磷酸盐缓冲溶液中(50mm,ph8.0，withnacl100mm)升温到95℃，再以1℃/min的降温速率，降温到4℃，从而自组装(图1a)成基本的结构单元y0，y1，y2，y3。之后，经过一步一步的组装方法(step-by-step)，分别室温混合y0和y1(数量比1：3)1小时，得到第一代dnadendrimer(g1)；室温混合g1和y2(数量比1：6)1小时，得到第二代dnadendrimer(g2)；室温混合g2和y3(数量比1：12)1小时，得到第三代dnadendrimer(g3)，示意图和产物结构如图1b所示。该设计方法中y0的末端三个多余单链dna序列一致；y1，y2，y3的末端三个多余单链dna序列，其中一个为与yn-1互补配对，另外两个序列一致且与yn+1的同样位置互补配对；而y型重复单元的双链部分，对于y0，y1，y2，y3可以全部一样，也可以是不同序列。
上述方法主要有两个不足之处：
1.需要先制备基本单元(y结构)，再分步组装成dnadendrimer，过程繁琐，不适用于产业化制备；
2.制备出的最终产物是具有特定三维结构的刚性分子，因而不适用于需要柔性结构应用。
技术实现要素：
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种树枝状dna组装体的制备方法及其用途。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种树枝状dna组装体的制备方法，其包括如下步骤：
将若干条单链dna混合于缓冲液中，升温至90℃后，以不超过3.6℃/min的速率降温至4℃，得到所述树枝状dna组装体。
作为优选方案，所述短链dna在缓冲液中的浓度以树枝状dna组装体在缓冲液中的浓度为1nm～100mm为标准设置。
短链dna的序列可以完全不同，这样得到的产物是各向异性的；短链dna的序列也可以部分相同，这样得到的产物结构对称。制备该类树枝状组装体所需要的最少短链dna个数为每代4条dna，在这种情况下，第n代结构与第n-1代相连区域的序列为统一的两种(一种5’到3’,一种3’到5’)，与第n+1代相连的区域序列也是统一的两种一种5’到3’,一种3’到5’)。
作为优选方案，所述缓冲液中含有按如下浓度计的各组分：40mmtris、20mm乙酸、1mmedta、12.5mm～50mm的mgcl2。
作为优选方案，所述降温速率为2min/℃。
一种由前述制备方法得到的树枝状dna组装体作为分子载体在成像、诊断和治疗中的用途。
作为优选方案，所述分子包括小分子药物、核苷酸、蛋白质、多肽、多聚糖、基因编辑所用的crispr相关蛋白和核苷酸复合体中的一种。
本发明的方法制得的树枝状dna组装体结构细节如图1所示。一个典型的dna组装体由中心结构(图2c)和重复的树枝状分枝(图2a)构成。中心结构决定重复分枝的数量，例如，一个2号中心结构(core2)和两个分枝1(branch1)，两个分枝2(branch2)可以组装成一个完整的3代树枝状dna组装体(d2-3)。命名法则dn-g，d代表树枝状dna(dendrimer)，n代表组成中心结构的短链dna数量，g代表最终产物的代数。由于dna具有方向性(5‘到3’，或3‘到5’)，所以需要两种方向相反但结构完全相同的分支结构(branch1和branch2)。
本发明的树枝状dna组装体的结构设计与之前的结构设计最大的不同在于，本发明的设计中基本的组成单元是两条dna，一条相对短的，一条相对长的。短的dna一端的序列与长dna中间的序列完全互补配对，这样组成的重复单元gn(图2b红色部分)，一端有一条多余单链悬挂序列，与靠近中心的dna(gn-1)相连接，另一端有两个悬挂序列，与远离中心的dna(gn+1)相连接，以此方式成树枝状延伸。在此结构中，互补配对区域的碱基长度为≥10个碱基对；且此区域长度可调，从而可以调整产物尺度的大小。另外，如果需要制备更具柔性的树枝状dna组装体，每条短链dna互补配对区域都可以以一个腺嘌呤(adenine)隔开(图2b中黑色碱基)。因此，由于重复单元是两条单链dna，产物最终结构分叉部分为产物提供柔性，额外的腺嘌呤间隔又进一步增加产物的柔性。也正是由于这种结构设计，此方法只需将单链dna按一定比例混合，由90℃降温即可制得柔性树枝状dna组装体。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、只需对短链dna混合物一步淬火即可获得结构精确可控的树枝状dna结构；
2、该方法所的产品较现有技术所的产品柔性更高。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为现有技术的树枝状dna组装体的结构和制备方法；
图2为本发明所用树枝状dna组装体的结构和制备方法；(a)树枝状dna组装体分枝的结构示意图。(b)举例说明第一代dna分枝与第二代分枝之间连接的结构细节。(c)举例说明可用来做dna组装体中心结构的dna结构。(d)一步法制得树枝状dna组装体示意图。dna链之间的短线表示碱基互补配对。箭头方向表示从5’到3’方向；
图3为本发明中实施例1制备的树枝状dna组装体branch1和branch2的序列图谱；
图4为本发明中实施例1中的d2-3的序列图谱；
图5为本发明制备的树枝状dna组装体的三维模拟和凝胶电泳表征图；(a)为其三维结构示意图，(b)树枝状dna组装体凝胶电泳图，下方标注为产率；
图6为本发明制备的树枝状dna组装体中的d2-3的原子力显微镜(afm)图；(a)原子力显微镜总览图。(b)单独一个d2-3的原子力显微镜图。(c)单独一个d2-3的原子力显微镜三维图。(d)b图中虚线部分高度图；
图7为本发明制备的树枝状dna组装体靶向运输模型小干扰rna(smallinterferingrna,sirna)到宫颈癌肿瘤细胞(hela)；(a)具有肿瘤靶向小干扰rna输送功能的树枝状dna复合体结构示意图，及其凝胶电泳图。(b)alexa647荧光标记的复合体与hela细胞共培养16小时后的激光共聚焦显微镜图。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，dapi)标记，肌动蛋白用异硫氰酸荧光素标记的鬼比环肽(phaloidin-fitc)标记。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供了一种树枝状dna组装体的制备方法，具体包括如下步骤：
通过以下dna序列按一定比例混合在tae/mg2+(40mmtris，20mm乙酸，1mmedta，12.5mmmgcl2)缓冲液中，升温至90℃，以2min/℃的降温速率，降温至4℃，即可制得d1-3，d2-3，d3-3。图2为制备所得树枝状组装体的结构示意图。图3为该实例中所用两种树枝状分枝的序列图谱。图4以d2-3为例展示出该实例中树枝状dna组装体的序列图谱以及结构组成。
其短链dna序列为
core1-15’-atcgttaggactctgacggc-3’
core2-15’-atcgttaggaactgtatcggcagtataatactctgacggc-3’
core2-25’-atcgttaggaaattatactgccgatacagactctgacggc-3’
core3-15’-atcgttaggaagctcacgccagatggtgcggactctgacggc-3’
core3-25’-atcgttaggaaccgcaccatcctgctacggaactctgacggc-3’
core3-35’-atcgttaggaatccgtagcagtggcgtgagcactctgacggc-3’
g1-15’-atgtaactccaacggaagtgcc-3’
g1-25’-aggtcttgcaatggagttacatgccgtcagag-3’
g1-35’-tcctaacgatgttatgtggcgacggaagtgcc-3’
g1-45’-aggtcttgcaacgccacataac-3’
g2-15’-aagcaaggtaaaagtctaccga-3’
g2-25’-cgcttaagtcattaccttgcttggcacttccg-3’
g2-35’-tgcaagacctattagcgccaaaagtctaccga-3’
g2-45’-cgcttaagtcattggcgctaat-3’
g3-15’-gcagctttacgagccatggtag-3’
g3-25’-tggccatcgaacgtaaagctgctcggtagact-3’
g3-35’-gacttaagcgactcgtgagcaagccatggtag-3’
g3-45’-tggccatcgaatgctcacgagt-3’。
命名法则：coren-n，core代表中心结构，n为中心结构序号，n为该中心结构中第n条dna。gn-n，g代表generation，n为第n代树枝状结构，n为该代树枝状结构中的第n条dna。
图5为该实例所制备出的树枝状dna组装体的凝胶电泳图以及三位模拟的结构图。在该实例中，d2-3通过原子力显微镜直接表征出其形貌，大小和树枝状结构，结果如图6所示。
实施例2
按照实施例1制备d2-3的序列，结合以下具有肿瘤靶向功能的适配体(aptameras1411)和模型药物sirna，aptameras14115’-ggtggtggtggttgtggtggtggtggataccatggc-3’sirna
5’-cgatggccararcrcrarcrcrarurarurgrarararcrcrargrcrururcrcrurgrara-3’
5’-alex647-rcrargrgrarargrcrurgrgrurururcrarurarurgrgrurggt-3’
以core2-1为200nm的浓度，将所需dna混合在tae/mg2+(40mmtris，20mm乙酸，1mmedta，12.5mmmgcl2)缓冲液中，升温至90℃，以2min/℃的降温速率，降温至4℃，即可制得具有肿瘤靶向药物输送功能的复合体。
表1制备不同树枝状dna组装体所需短链dna组合及其数量比。
为便于统计，在基因序列表中，将实施例1和实施例2中各dna和rna序列均以seqidno.x的形式命名，具体为：
core1-1seqidno.1；core2-1seqidno.2；
core2-2seqidno.3；core3-1seqidno.4；
core3-2seqidno.5；core3-3seqidno.6；
g1-1seqidno.7；g1-2seqidno.8；
g1-3seqidno.9；g1-4seqidno.10；
g2-1seqidno.11；g2-2seqidno.12；
g2-3seqidno.13；g2-4seqidno.14；
g3-1seqidno.15；g3-2seqidno.16；
g3-3seqidno.17；g3-4seqidno.18；
aptameras1411seqidno.19
seqidno.20：
5’-cgatggccararcrcrarcrcrarurarurgrarararcrcrargrcrururcrcrurgrara-3’seqidno.21：
5’-alex647-rcrargrgrarargrcrurgrgrurururcrarurarurgrgrurggt-3’
实施例3
图7为应用实例之一，树枝状dna组装体d2-3，负载了肿瘤靶向因子as1411和模型药物sirna。其成功的将alexa647荧光标记的sirna靶向输送到癌细胞中。该组装体的应用为基体和载体，尤其是药物运输的载体，其负载的物质包括小分子药物，纳米粒子，多肽，蛋白，sirna/mirna，基因编辑所用的结合体(crispr-蛋白和核苷酸复合体)。这些负载了具有治疗，靶向，成像和基因编辑功能的树枝状dna组装体在生物医学和生物科技方面有广泛的应用前景。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110>上海交通大学医学院附属第九人民医院
<120>一种树枝状dna组装体的制备方法及其用途
<160>21
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atcgttaggactctgacggc20
<210>2
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
atcgttaggaactgtatcggcagtataatactctgacggc40
<210>3
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
atcgttaggaaattatactgccgatacagactctgacggc40
<210>4
<211>42
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
atcgttaggaagctcacgccagatggtgcggactctgacggc42
<210>5
<211>42
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
atcgttaggaaccgcaccatcctgctacggaactctgacggc42
<210>6
<211>42
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
atcgttaggaatccgtagcagtggcgtgagcactctgacggc42
<210>7
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
atgtaactccaacggaagtgcc22
<210>8
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
aggtcttgcaatggagttacatgccgtcagag32
<210>9
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
tcctaacgatgttatgtggcgacggaagtgcc32
<210>10
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
aggtcttgcaacgccacataac22
<210>11
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
aagcaaggtaaaagtctaccga22
<210>12
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>12
cgcttaagtcattaccttgcttggcacttccg32
<210>13
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>13
tgcaagacctattagcgccaaaagtctaccga32
<210>14
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>14
cgcttaagtcattggcgctaat22
<210>15
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>15
gcagctttacgagccatggtag22
<210>16
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>16
tggccatcgaacgtaaagctgctcggtagact32
<210>17
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>17
gacttaagcgactcgtgagcaagccatggtag32
<210>18
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>18
tggccatcgaatgctcacgagt22
<210>19
<211>36
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>19
ggtggtggtggttgtggtggtggtggataccatggc36
<210>20
<211>62
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>20
cgaggccararcrcrarcrcrarurarurgrarararcrcrargrcrururcrcrurgra60
ra62
<210>21
<211>47
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>21
rcrargrgrarargrcrurgrgrurururcrarurarurgrgrurgg47