本发明涉及农业生物技术领域，具体地，本发明涉及一种来源于真菌葡萄糖淀粉酶tlga15及其基因和应用。
背景技术：
淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，作用于淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，生成糊精和低聚糖。β-淀粉酶为外切酶，它从淀粉非还原性顺次切下麦芽糖。葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1，4糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。葡萄糖淀粉酶底物专一性较低，既能够切断α-1,4-糖苷键，对α-1,6-糖苷键和α-1,3-糖苷键也有轻微的水解能力。葡萄糖淀粉酶是工业上用量最大的生物酶制剂之一，被广泛地应用于食品、医药和发酵等工业，是我国产量和用量最大的生物酶产品之一，具有很高的商业价值。
葡萄糖淀粉酶(ec.3.2.1.3)又称糖化酶，是淀粉制糖工业的重要用酶。葡萄糖的工业生产主要分两步：(1)淀粉的液化，在高温α-淀粉酶作用下将糊化的淀粉分解成寡糖和麦芽糖，降低粘度；(2)糖化，液化结束后将温度降至60-65℃，ph调至4.0-4.5，加入适量的葡萄糖淀粉酶保温至葡萄糖浓度达到最高。葡萄糖淀粉酶的作用主要是分解寡糖和麦芽糖，生成葡萄糖。
制糖反应中，较高的反应温度有利于整个反应的进行。较高的反应温度更有利于糖化过程进行，主要体现在以下几个方面：(1)高温利于底物溶解，增加底物浓度；(2)降低底物黏度，利于搅拌；(3)降低染菌的风险；(4)增加反应速率，减少反应时间(5)降低酶纯化的成本；(6)延长酶的催化半衰期。
当前，工业上应用的糖化酶主要来源于黑曲霉(aspergillusniger)、泡盛曲霉(asperillusawamori)和米根霉(rhizopusoryzae)。淀粉液化的温度通常在95℃条件下进行，第一步在高温条件下进行的，整个反应体系温度较高，因此生产上要求糖化酶也要有较好的温度稳定性，而常见的糖化酶通常只能在60℃下稳定。因此，耐高温糖化酶的选育是本领域亟待解决的问题。
技术实现要素：
根据现有技术中淀粉酶热稳定性不好的问题，本发明的目的是提供一种酸性、热稳定性提高、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的葡萄糖淀粉酶tlga15。
本发明的再一目的是提供上述葡萄糖淀粉酶tlga15的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖淀粉酶tlga15的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖淀粉酶tlga15基因的重组菌株。
本发明的再一目的是提供一种制备葡萄糖淀粉酶tlga15的方法。
本发明的再一目的是提供上述葡萄糖淀粉酶tlga15的应用。
根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶tlga15的氨基酸序列如seqidno.1所示：
该酶全长636个氨基酸，n端20个氨基酸为信号肽序列“mtarlasalcalafgqavva”。
根据本发明的具体实施方式，成熟的葡萄糖淀粉酶tlga15氨基酸序列如seqidno.2所示：
根据本发明的具体实施方式，编码上述葡萄糖淀粉酶的基因序列如seqidno.3所示：
根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶基因tlga15结构基因全长2186bp，含有4个内含子，cdna长1911bp，其cdna序列如seqidno.4所示：
成熟蛋白理论分子量为65.8kda，该酶属于糖基水解酶第15家族，一种新的葡萄糖淀粉酶。
去除信号肽后的cdna序列如seqidno.5所示
本发明还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶tlga15基因的重组载体，优选为ppic9-tlga15。将本发明的葡萄糖淀粉酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将葡萄糖淀粉酶基因插入到质粒ppic9上的ecori和noti限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于aoxl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒ppic9-tlga15。
本发明还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶tlga15基因的重组菌株，优选为重组菌株gs115/tlga15。
根据本发明的具体实施方式，制备葡萄糖淀粉酶tlga15的方法包括以下步骤：
(1)用上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
(2)培养重组菌株，诱导重组葡萄糖淀粉酶tlga15的表达；
(3)以及回收并纯化所表达的葡萄糖淀粉酶tlga15。
根据本发明的具体实施方式，所述宿主细胞为毕赤酵母(pichiapastoris)细胞、啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(hansenulapolymorpha)细胞。
根据本发明的具体实施方式，将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(pichicpastoris)gs115，得到重组菌株gs115/tlga15。
本发明的葡萄糖淀粉酶tlga15最适ph为4.5，在ph4.0-ph5.5范围内，其能够维持其70％以上的酶活力；最适温度75℃，在70℃时依然具有80％以上的酶活力，在65℃下处理60min，剩余酶活在80％以上，在70℃下处理10min，依然能够保持70％的酶活力，具有良好的稳定性。
本发明的葡萄糖淀粉酶tlga15可以利用基因工程手段来产业化生产。本发明的葡萄糖淀粉酶tlga15基因可应用于饲料、食品、医药等领域。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的葡萄糖淀粉酶tlga15。
附图说明
图1显示本发明的重组葡萄糖淀粉酶tlga15的最适ph值。
图2显示本发明的葡萄糖淀粉酶tlga15的ph稳定性。
图3显示本发明的葡萄糖淀粉酶tlga15的最适反应温度。
图4显示本发明的葡萄糖淀粉酶tlga15的热稳定性。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：毕赤酵母(pichiapastorisgs115)、毕赤酵母表达载体ppic9及菌株gs115购自于生化试剂公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶、连接酶及其它生化试剂均购自试剂公司。
3、培养基：
(1)产酶培养基：30g/l麦麸，30g/l玉米芯粉，30g/l豆粕，5g/l大麦葡聚糖，5g/l(nh4)so4，1g/lkh2po4，0.5g/lmgso4·7h2o，0.01g/lfeso4·7h2o，0.2g/lcacl2于1l去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min
(2)大肠杆菌培养基lb(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126nacl，ph7.0)。
(3)bmgy培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.000049<biotin，1％甘油(v/v)。
(4)bmmy培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与bmgy相同，ph4.0。
实施例1葡萄糖淀粉酶编码基因tlga15的克隆
提取talaromycesleycettanusjcm12802基因组dna设计克隆引物，以talaromycesleycettanusjcm12802总dna为模板进行pcr扩增。pcr反应参数为：95℃5min；94℃30sec,60℃30sec,72℃2min,35个循环，72℃10min，得到约2000bp片段。
实施例2葡萄糖淀粉酶cdna的获得
提取talaromycesleycettanusjcm12802的总rna，利用oligo(dt)20和反转录酶得到cdna的一条链，然后设计扩增开放阅读框的的引物12802gh15-3f和12802gh15-3r(见表1)，扩增该单链cdna，获得葡萄糖淀粉酶的cdna序列。
表1基因克隆本实验所需的引物
通过对葡萄糖淀粉酶的基因组序列和cdna序列比对后发现该基因有含有4个内含子，cdna长1911bp，编码636个氨基酸和一个终止密码子，n端20个氨基酸为其信号肽序列，从talaromycesleycettanusjcm12802中分离克隆得到的编码葡萄糖淀粉酶的基因为新基因。
实施例3葡萄糖淀粉酶工程菌株的构建
(1)表达载体的构建及在酵母的表达
以测序正确的葡萄糖淀粉酶编码基因tlga15的cdna为模板，设计合成了带有ecori和noti限制性酶切位点的引物12802gh15-3-f和12802gh15-3-r(见表1)，对tlga15的成熟蛋白的编码区进行扩增，并利用ecori和noti酶切pcr产物，连接进入表达载体ppic9(invitrogen,sandiego)，葡萄糖淀粉酶tlga15成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体ppic9-tlga15，转化大肠杆菌感受态细胞trans1。阳性转化子进行dna测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶drai进行线性化表达质粒载体dna，电击转化酵母gs115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在md平板上生长的转化子进行进一步的表达实验。
以同样的方式构建含tlga15信号肽序列的cdna的表达载体，并转化。
(2)葡萄糖淀粉酶高活性转化子的筛选
用灭过菌的牙签从长有转化子的md板上挑取单菌落，按照编号先点到md平板上，将md平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从md平板上挑取转化子接种于装有3mlbmgy培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1ml含有0.5％甲醇的bmmy培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出葡萄糖淀粉酶活性最高的转化子。
实施例4重组葡萄糖淀粉酶的制备
(1)葡萄糖淀粉酶基因tlga15在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达
筛选出酶活较高的转化子，接种于400mlbmgy液体培养基的1l三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；4500rpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入200ml含有0.5％甲醇的bmmy液体培养基，30℃，220rpm诱导培养48h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；(3)12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行sds-page蛋白电泳分析。
(2)重组葡萄糖淀粉酶的纯化
收集摇瓶表达的重组葡萄糖淀粉酶上清液，通过10kda膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kda超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组tlga15，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取tlga15浓缩液2.0ml经预先用20mmtris-hcl(ph7.5)平衡过的hitrapqsepharosexl阴离子柱，然后用0-1mol/l的nacl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。
实施例5重组葡萄糖淀粉酶部分性质分析
采用dns法对本发明的葡萄糖淀粉酶进行活性分析。具体方法如下：在ph4.5，75℃条件下，1ml的反应体系包括l00μl适当的稀释酶液，900μl底物，反应10min，加入1.5mldns终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定od值。葡萄糖淀粉酶活性单位定义：在75℃ph4.5条件下，每分钟内催化水解底物释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位。
(1)葡萄糖淀粉酶tlga15的最适ph及ph稳定性
经纯化的实施例3表达的葡萄糖淀粉酶tlga15在不同的ph下进行酶促反应以测定其最适ph。所用缓冲液为ph1.0-3.0甘氨酸-盐酸缓冲液，ph3.0-8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液及ph8.0-10.0为tris-hcl缓冲液。
纯化的葡萄糖淀粉酶tlga15在不同ph的缓冲体系.如图1所示，75℃下测定的ph适性结果表明：tlga15的最适ph为4.5，在ph4.0-ph5.5范围内，该酶能够维持其70％以上的酶活力。
将酶液在不同ph值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶的剩余活性以研究酶的ph稳定性。如图2所示，分析结果表明ph3.0-ph7.0之间能够维持85％以上的酶活力，说明该酶具有优良的ph稳定性。
(2)葡萄糖淀粉酶tlga15反应最适温度及热稳定性
如图3所示，纯化的葡萄糖淀粉酶在ph4.5条件下，测定不同温度(40-90℃)下的酶活性，实验结果表明显示，该酶的最适反应温度为75℃，在65-75℃时依然具有80％以上的酶活力。
如图4所示，温度耐受性测定为葡萄糖淀粉酶在不同温度下处理不同时间，再在75℃下进行酶活性测定。热稳定性实验表明：该葡萄糖淀粉酶在65℃下处理60min，剩余酶活在80％以上，即使该酶在70℃下处理10min，依然能够保持70％的酶活力，这表明该酶具有较好的稳定性。
序列表
<110>中国农业科学院饲料研究所
<120>葡萄糖淀粉酶tlga15及其基因和应用
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