本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种表达猪流行性腹泻病毒s基因的猪源bvdv重组病毒及其应用。
背景技术：
牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus，bvdv)和猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,csfv)同属于黄病毒科(flaviviridae)瘟病毒属(pestivirus)，在血清学上具有一定的交叉反应。
bvdv除了感染牛，还可感染猪，它引发的临床症状影响或隐性感染可以影响到养猪业生产的各个环节，如生长迟缓、繁殖障碍、继发感染和持续感染等等。该病几乎在国内各个省市均有流行，邓宇等利用套式rt-pcr在2007～2010年对国内部分地区的临床样品进行筛查，检出bvdv的阳性率分别为23.1％(2007年)、27.7％(2008年)、33.6％(2009年)和23.6％(2010年)。猪感染bvdv不表现出临床症状，或出现类似于猪瘟的症状，因而不仅给猪瘟的预防和控制带来了很大的困难，也使bvdv的防控难上加难。
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的以呕吐、腹泻、脱水和对哺乳仔猪致死率高为特征的一种高度接触性猪肠道传染病。s蛋白是pedv编码蛋白中的一种结构蛋白，它能把病毒粒子吸附在宿主细胞受体上，通过膜融合渗进细胞中，刺激宿主诱导产生中和抗体，具有pedv抗原的作用。pedv的核心表位抗原存在于s蛋白的编码基因中，被认为是pedv亚单位疫苗的重要靶标抗原。
2011年，猪流行性腹泻在我国大规模流行，给养猪业造成严重的经济损失，pedv毒株的变异，特别是s基因的变异，现有疫苗不能提供足够的免疫保护是引起此次流行的主要原因。
反向遗传学操作技术已成为新型疫苗研制的重要手段。目前，将pedv和bvdv进行结合的研究，尚未见有报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种表达猪流行性腹泻病毒s基因的猪源bvdv重组病毒及应用，该猪源bvdv重组病毒可表达pedvs外源蛋白，同时用于pedv和bvdv的防控。此外，猪源bvdv重组感染性克隆为其他外源基因提供了合适的插入位点，可用作重组病毒载体，为后续体外修饰rna、外源基因的插入、重组病毒的制备等研究提供有效的技术平台。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种表达猪流行性腹泻病毒s基因的猪源bvdv重组病毒，其在猪源bvdv的c核衣壳蛋白n端插入了猪流行性腹泻病毒s基因的中和抗原表位序列。
进一步，所述猪流行性腹泻病毒s基因的中和抗原表位序列的插入位点为猪源bvdv的c核衣壳蛋白n端的第7和第8个氨基酸之间。
又，所述猪源bvdv重组病毒的基因序列如seqidno.1所示。
本发明提供一种含有所述重组病毒基因的猪源bvdv重组感染性克隆质粒。
进一步，所述的猪源bvdv重组感染性克隆质粒为pash-ds312。
本发明所述猪源bvdv重组感染性克隆质粒的应用，所述猪源bvdv重组感染性克隆质粒线性化后，体外转录成rna，并转染mdbk细胞，拯救出表达猪流行性腹泻病毒s蛋白的猪源bvdv重组病毒。
本发明提供猪源bvdv重组感染性克隆质粒的构建方法，包括如下步骤：
1)根据猪源bvdv感染性克隆质粒的序列和pedv流行株的s基因序列，设计重叠延伸pcr引物；
2)利用重叠延伸pcr方法，将pedvs基因中长度为312bp的抗原表位片段串联在一起，获得ds312片段；
3)将ds312片段插入猪源bvdv感染性克隆质粒，插入位点为猪源bvdv感染性克隆质粒的c核衣壳基因n端第7和第8个氨基酸之间，获得猪源bvdv重组感染性克隆质粒。
进一步，所述猪源bvdv感染性克隆质粒为pash28。
又，步骤3)中，获得的猪源bvdv重组感染性克隆质粒为pash-ds312。
进一步，所述重叠延伸pcr引物包括四对引物对，分别为：xhoi-f和coe-r1、coe1-f1和coe1-r1、coe2-f2和coe2-r2、coe-f3和pmli-r，从5’端到3’端，引物对的具体序列如下：
xhoi-f：ggaagtcgtcaatggttcg；
coe-r1：tgatggcaaagtacccttacccccttc；
coe1-f1：agggggtaagggtactttgccatcattc；
coe1-r1：tgatggcaaagtgtaaccaaaaagat；
coe2-f2：ctttttggttacactttgccatcattca；
coe2-r2：cccttcatcagagtaaccaaaaagat；
coe-f3：tctttttggttactctgatgaaggg；
pmli-r：gtttgttccactcatgcctttg。
本发明的重组病毒包含了猪源bvdv的全长序列，插入了猪流行性腹泻病毒s基因的中和抗原表位序列，插入位点为bvdv的c核衣壳基因n端第7和第8个氨基酸之间，该猪源bvdv重组病毒可表达pedvs外源蛋白，同时用于pedv和bvdv的防控。
本发明以bvdv感染性克隆质粒作为重组病毒载体，在猪源bvdv感染性克隆质粒的衣壳蛋白基因n端插入猪流行性腹泻病毒s基因，获得重组感染性克隆质粒，该质粒线性化后，体外转录成rna，并转染mdbk细胞，能成功拯救出表达猪流行性腹泻病毒s蛋白的猪源bvdv重组病毒。由于pedv和bvdv都会导致猪腹泻，因此，以bvdv为载体构建的重组病毒，可以起到同时防治pedv和bvdv的作用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明将pedv的s基因插入猪源bvdv感染性克隆质粒的c核衣壳蛋白n端，获得重组感染性克隆质粒，拯救了表达pedvs蛋白的猪源bvdv重组病毒，该猪源bvdv重组病毒可表达pedvs外源蛋白，同时用于pedv和bvdv的防控。
本发明的猪源bvdv重组感染性克隆为其他外源基因提供了合适的插入位点，可用作重组病毒载体，为后续重组病毒疫苗研制提供契机和平台。
附图说明
图1为本发明实施例中pedvds312抗原的重叠延伸pcr结果。
图2本发明实施例中重组t载体质粒的鉴定。
图3本发明实施例中重组感染性克隆质粒的鉴定。
图4本发明实施例中重组病毒的rt-pcr检测。
图5本发明实施例中重组病毒的间接免疫荧光检测。
图6本发明实施例中重组病毒的sds-page电泳鉴定。
图7-8本发明实施例中重组病毒的westernblot鉴定。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
dl15,000dnamarker、pfu聚合酶、trizol、reversetranscriptasem-mlv(rnaseh-)、5×reversetranscriptasem-mlvbuffer、recominantrnaseinhibitor、dntpmixture(各2.5mm)、限制性内切酶均购自takara公司；dmem培养基和opti-mem培养基购自gibco公司；
实施例猪源bvdv-2重组感染性克隆质粒的构建和应用
1.引物设计
根据猪源bvdv-2感染性克隆质粒pash28的序列，以及pedv流行株js-2/2014的s基因序列，设计重叠延伸pcr引物。具体引物序列见表1。
表1
2.构建重组感染性克隆质粒
利用重叠延伸pcr方法，将s基因中的312bp片段进行串联，获得ds312片段，ds312抗原的pcr扩增产物长为1889bp，由大小分别为738、773、554bp的3个片段重叠延伸扩增而成，参见图1，其中，泳道1是利用xhoi-f/coe-r1引物对扩增的片段(738bp)，泳道2是利用coe1-f1/coe2-r2引物对扩增的pedv的部分s基因片段(773bp)，泳道3是利用coe-f/coe1-r1引物对扩增的片段(554bp)，泳道4是利用xhoi-f/pml-r引物对扩增的ds312全长片段(1889bp)。
然后，再利用重叠延伸pcr方法，将ds312片段插入xhoi-pmli片段中。将最终获得的扩增产物克隆入peasybluntzerovector，通过提质粒和测序鉴定，获得正确的重组t载体质粒peasy-xp/ds312。
进一步，利用xhoi和pmli限制性内切酶同时双酶切重组t载体质粒peasy-xp/ds312质粒和猪源bvdv-2感染性克隆载体质粒pash28。
重组t载体质粒peasy-xp/ds312大小为5845bp，利用xhoi和pmli双酶切鉴定，切成3956bp和1889bp两条带；酶切结果参见图2，其中，3956bp条带是peasy-bluntzerovector的线性片段，而1889bp条带是ds312片段。
重组感染性克隆质粒pash-ds312大小为16262bp；利用xhoi和pmli双酶切鉴定，切成14373bp和1889bp两条带，酶切结果参见图3，其中，14373bp条带是pash28质粒的线性片段，1889bp条带是ds312全长片段。
回收相应片段，并进行连接。通过提质粒、酶切和测序验证，筛选获得正确的猪源bvdv-2重组感染性克隆质粒pash-ds312，其中，所述猪源bvdv-2感染性克隆载体pash28为低致病性猪源bvdv-2感染性克隆。
3.体外转录
所述猪源bvdv-2重组感染性克隆质粒经线性化，纯化后体外转录成rna，具体如下：
首先用sbfi限制性内切酶单酶切重组感染性克隆质粒pash-ds312，使之线性化；然后终止酶切反应，即在上述酶切体系中加入1/20体积0.5medta、1/10体积3mnaac和2倍体积无水乙醇并置-20℃沉淀30min；13,000g离心15min，弃上清，干燥沉淀，然后用适量超纯水溶解沉淀，至终浓度为0.5～1μg/μl。
为了消除提质粒和酶切过程中可能产生或引进的rnase或其他转录抑制剂，进行以下处理：加入终浓度为100～200μg/ml蛋白酶k和0.5％sds，50℃水浴30min，然后用酚/氯仿抽提、酒精沉淀的方法纯化产物，最后用8μlrnase-freeh2o溶解沉淀。
按照megascriptt7试剂盒说明书，将经上述处理的线性化质粒进行体外转录，获得rna产物。
具体反应体系为：8μl线性化的感染性克隆质粒，atp、ctp、gtp、utp各2μl，2μl10×reactionbuffer，2μlenzymemix，充分混匀后，37℃孵育4h；加入1μlturbodnase，37℃作用15min；然后加入30μlrnase-freeh2o和30μllicl，-20℃沉淀30min以上；4℃13,000g离心15min；弃上清，70％乙醇洗一遍；干燥，最后用20μlrnase-freeh2o溶解沉淀备用。
4.病毒拯救及鉴定
4.1细胞转染
转染前24h，取生长状态良好的转染细胞293t细胞，用胰酶消化并调整细胞浓度，适量接种于24孔细胞培养板，置二氧化碳培养箱中培养。第二天待单层细胞融合度达80％左右时，将24孔细胞板内细胞上清弃去，pbs洗涤2次，加入opti-mem培养基。
然后参照lipofectamine2000说明书进行转染：首先配制dna-脂质体混悬液，取2个1.5ml指形管，其中一个指形管中加入100μlopti-mem和1μgrna，另一个指形管中加入100μlopti-mem和3μllipofectamine2000，轻轻混匀后室温静置5min；然后将两个指形管内的混悬液加到一起，轻柔混匀后室温静置25min；将24孔细胞板内细胞上清弃去，加入dna-脂质体混悬液，然后将24孔细胞板置于二氧化碳培养箱中；静置培养6h后，将细胞上清换成含10％hs的dmem完全培养基，然后将细胞置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养。培养48h后，收集细胞培养物，冻融一次，除去细胞碎片，收集上清，转接至mdbk细胞，进行盲传培养，得到猪源bvdv重组病毒vash-ds312。
该猪源bvdv重组病毒vash-ds312包含了猪源bvdv毒株sh-28的全长序列，插入了猪流行性腹泻病毒s基因的中和抗原表位序列，插入位点为bvdv毒株的c核衣壳基因n端第7和第8个氨基酸之间，具体序列如seqidno.1所示。
第5代vash-ds312重组病毒在mdbk细胞上的病毒滴度为105.5tcid50/0.1ml。
4.2检测及鉴定
4.2.1rt-pcr检测
收集第3代vash-ds312重组病毒，提取其总rna，利用xhoi-f/pmli-r引物对进行rt-pcr检测，以sh-28为对照病毒，并测序验证，rt-pcr检测结果如图4，1为对照病毒sh-28，2为重组病毒vash-ds312，对照病毒sh-28和重组病毒vash-ds312分别扩增出1168bp和1889bp条带，测序正确。
4.2.2间接免疫荧光检测
将第3代vash-ds312重组病毒种于96孔细胞板，48h后进行间接免疫荧光检测。
具体操作步骤为：弃去细胞上清，预冷的pbst洗涤3遍，拍干；加入70％乙醇，100μl/孔，37℃孵育1h；弃去上清，pbst洗涤3遍，拍干；加入bvdv单克隆抗体(1：1000倍稀释)，100μl/孔，37℃孵育1h；弃去上清，pbst洗涤3遍，拍干；加入fitc标记的羊抗鼠igg抗体，37℃孵育1h；弃去上清，pbst洗涤3遍，拍干；加入适量pbst液体，在荧光显微镜下观察。
结果参见图5，其中，vash-ds312为感染vash-ds312的mdbk细胞，sh-28为对照病毒，mock是空白细胞对照。可见，感染vash-ds312的mdbk细胞内发出特异性绿色荧光，说明重组病毒拯救成功。
4.2.3westernblot鉴定
取10μl重组病毒液，加入40μl5×sdsloadingbuffer，混匀后，沸水煮10min，冷却，加样，进行sds-page电泳。待电泳结束后，一份进行考马斯亮蓝染色，另一份进行westernblot检测。
具体操作流程：将nc膜按照胶块大小裁剪好，从下往上按照滤纸、nc膜、胶块、滤纸的顺序叠放整齐，赶走气泡，利用半干法进行转印，15v转印30min；转印完毕，pbst洗膜3遍，5min/遍；8％脱脂乳封闭1h，，pbst洗膜3遍；一抗孵育1h，pbst洗膜3遍；hrp标记的羊抗鼠igg孵育1h，pbst洗膜3遍；dab显色，观察。
收集重组病毒进行sds-page电泳检测，结果参见图6，其中，1为vash-ds312泳道，2为sh-28泳道，vash-ds312泳道比sh-28多一条带，大小约43kda，初步表明ds312蛋白表达成功，可能与bvdv的衣壳蛋白融合表达了。
进一步进行westernblot检测，利用针对bvdve2蛋白的单克隆抗体进行反应，参见图7，其中，泳道1为vash-ds312病毒，泳道2为sh-28病毒，均显色出一条40kda左右的e2蛋白条带，证明猪源bvdv重组病毒vash-ds312拯救成功，可以在mdbk细胞上成功增殖。
利用pedv多克隆抗体进行westernblot检测，结果发现，图8，泳道1为vash-ds312病毒，泳道2为sh-28病毒，其中，只有vash-ds312病毒显色出一条目的片段，约43kda，由于ds312是插入在衣壳蛋白c的n端，因此，推测ds312和衣壳蛋白c融合表达了。
序列表
<110>上海市农业科学院
<120>表达猪流行性腹泻病毒s基因的猪源bvdv重组病毒及应用
<130>1811053
<141>2018-05-11
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>12902
<212>dna
<213>牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheapetivirus)
<400>1
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