本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种稳定共表达重组人源甜味受体蛋白his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)的真核细胞系及其制备方法。
背景技术：
：味觉在人们的生活中占有很重要的作用，而甜味是人们最喜欢的味道之一，它与人们的生活息息相关，可以预示着食物中含营养物质，同时还能增加食物的口感和味道，进而影响人们对食物的选择。摄入甜味食物可以给食用者带来愉悦，但同时部分碳水化合物类甜味剂含有高能量，过度的摄入则会引起肥胖及其随之而来的相关疾病，所以甜味化学感受分子机制的深入研究对于食品工业的发展及食用者的健康具有十分重要的影响和意义。而选取人源甜味受体基因作为研究对象可以更加直观地反应出甜味刺激对人的影响。人的甜味受体是由t1r2和t1r3组成的异源二聚体蛋白复合体(t1r2/t1r3)，每一个受体都包含了一个t1r2亚基及一个t1r3亚基。t1r2和t1r3都是c类g蛋白偶联受体，拥有7个跨膜结构域。t1r2由839个氨基酸组成，翻译该蛋白的基因组dna长20063bp，含有6个外显子，编码区核酸序列为2521bp；t1r3蛋白含852个氨基酸，翻译该蛋白的基因组dna为3433bp，含有6个外显子，编码区核酸序列为2559bp。甜味信号的传导需要下游的g蛋白、plcβ2及trpm5等相关蛋白的介导，进而引起下游pkc、ca2+、pka等相关分子的活化。同时研究还发现甜味受体t1r2和t1r3可以通过结合glp-1来控制体内葡萄糖的平衡和葡萄糖转运子的激活。这些相关分子是可供检测的下游信号分子。关于甜味受体的检测，常规方法包括免疫荧光技术(immunofluorescencetechnique)、蛋白质免疫印迹技术(westernblotting)等方法，这些方法能够准确检测到甜味受体蛋白t1r2和t1r3在细胞内的表达定位和表达水平。本发明获得了稳定共表达重组人源甜味受体蛋白his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)的人胚胎肾细胞hek293，并且此真核细胞系能够对甜味物质响应，可以用于甜度测定。技术实现要素：本发明第一方面公开了一种稳定共表达重组人源甜味受体蛋白his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)的真核细胞系(保藏编号为cctccno:c2017260；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期为：2017年11月15日；分类命名为：人源细胞，拉丁文名称为“homosapiens,human”。保藏单位于2017年11月26检测完毕，结果为存活。见附件存活证明)，(1)该真核细胞系稳定携带编码带有his标签的人源甜味受体蛋白t1r2(简称为his-t1r2，序列见seqidno.2)的核酸序列(序列见seqidno.1)和编码带有flag标签的人源甜味受体蛋白t1r3(简称为flag-t1r3，序列见seqidno.6)的核酸序列(序列见seqidno.5)；(2)该真核细胞系由人胚胎肾细胞hek293制备得到。本发明第二方面公开所述的真核细胞系的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)构建表达his-t1r2(序列见seqidno.2)的重组质粒；构建表达flag-t1r3(序列见seqidno.6)的重组质粒；(2)将步骤(1)得到的两种重组质粒共同转染进入真核细胞中，并通过药物抗性筛选，得到具有抗生素抗性的阳性细胞克隆体，再通过蛋白质免疫印迹技术检测，优选出能够同时表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)的细胞克隆体；(3)将步骤(2)中得到的细胞克隆体扩增培养，即得到稳定共表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)的真核细胞系。优选地，步骤(1)中所述的两种重组质粒能够在真核细胞中分别表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)；步骤(2)中所述的转染方法为电穿孔转染法，所述真核细胞为人胚胎肾细胞hek293，所述抗性筛选所用的药物为g418，所述g418为遗传霉素，为一种氨基糖苷类抗生素。优选地，所述表达his-t1r2(序列见seqidno.2)重组质粒的制备方法的步骤为：(1)将编码人源甜味受体蛋白t1r2的编码区核酸序列与编码his标签的核酸序列连接，得到表达his-t1r2的核酸序列(序列见seqidno.1)；(2)将步骤(1)得到的核酸序列插入到真核表达载体的多克隆酶切位点处，即得到所述表达his-t1r2(序列见seqidno.2)的重组质粒。优选地，步骤(2)中所述的真核表达载体为pcdna3.1(+)。优选地，所述表达flag-t1r3重组质粒的制备方法的步骤为：(1)将编码人源甜味受体蛋白t1r3的编码区核酸序列与编码flag标签的核酸序列连接，得到表达flag-t1r3的核酸序列(序列见seqidno.5)；(2)将步骤(1)得到的核酸序列插入到真核表达载体的多克隆酶切位点处，即得到所述表达flag-t1r3(序列见seqidno.6)的重组质粒。优选地，步骤(2)中所述的真核表达载体为pcdna3.1(+)。本发明第三分部公开了一种在真核细胞中同时表达his-t1r2(序列见seqidno.2)、flag-t1r3(序列见seqidno.6)和带有ha标签的重组人源嵌合体蛋白g15-gustducin44(序列见seqidno.12)的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)构建表达带有ha标签的重组人源嵌合体蛋白g15-gustducin44(简称为ha-g15-gustducin44，序列见seqidno.12)的重组质粒；(2)将步骤(1)得到的重组质粒转染进入稳定共表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)的真核细胞系中，在真核细胞中同时表达三种重组人源蛋白，即his-t1r2(序列见seqidno.2)、flag-t1r3(序列见seqidno.6)和ha-g15-gustducin44(序列见seqidno.12)。优选地，步骤(1)中所述的重组质粒能够在真核细胞中表达ha-g15-gustducin44(序列见seqidno.12)；步骤(2)中所述的转染方法为电穿孔转染法，所述的真核细胞系为权利要求1所述的真核细胞系。优选地，所述表达ha-g15-gustducin44重组质粒的制备方法的步骤为：(1)将编码人源嵌合体蛋白g15-gustducin44的核酸序列与编码ha标签的核酸序列连接，得到表达ha-g15-gustducin44的核酸序列(序列见seqidno.11)；(2)将步骤(1)得到的核酸序列插入到真核表达载体的多克隆酶切位点处，即得到所述表达ha-g15-gustducin44(序列见seqidno.12)的重组质粒。优选地，步骤(2)中所述的真核表达载体为plvx-puro。按照本发明的第一个方面，提供了一种能够在真核细胞系中表达重组人源甜味受体蛋白his-t1r2(序列见seqidno.2)的重组质粒，制备方法为将人源甜味受体蛋白t1r2的编码区核酸序列与编码his标签的核酸序列连接，并插入到真核表达载体pcdna3.1(+)的多克隆酶切位点处，得到能够在真核细胞系中表达his-t1r2重组质粒。按照本发明的第一个方面，还提供了一种能够在真核细胞系中表达重组人源甜味受体蛋白flag-t1r3(序列见seqidno.6)的真核重组质粒，制备方法为将编码t1r3的编码区核酸序列与编码flag标签的核酸序列连接，并插入到真核表载体pcdna3.1(+)的多克隆酶切位点处，得到能够在真核细胞系中表达flag-t1r3重组质粒。按照本发明的第一方面，提供了一种用于稳定表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)的真核细胞系，其保藏编号为：cctccno:c2017260。按照本发明的第二方面，提供了一种在真核细胞中共表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)的方法。按照本发明的第二方面提供了一种稳定表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)真核细胞系的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)将制备得到表达his-t1r2(序列见seqidno.2)的重组质粒和表达flag-t1r3(序列见seqidno.6)的重组质粒用电穿孔转染法共转染进入人胚胎肾细胞hek293中，并通过在细胞培养液中添加g418进行药物抗性筛选，得到具有抗生素抗性的阳性细胞克隆体，所述细胞培养液为rmpi1640，gibco公司产品；(2)将步骤(1)中得到的阳性细胞克隆体扩增培养，经过蛋白质免疫印迹技术检测到特异性的his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)条带，即得到稳定共表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)的真核细胞系。按照本发明的第三方面，提供了一种能够在真核细胞中表达ha-g15-gustducin44(序列见seqidno.12)的重组质粒，所述编码g15-gustducin44嵌合体蛋白的核酸序列与编码ha标签的核酸序列连接，并插入到真核表达质粒plvx-puro的多克隆酶切位点处，得到表达ha-g15-gustducin44(序列见seqidno.12)的重组质粒，所述ha标签的氨基酸序列ypydvpdya。按照本发明的第三方面，提供了一种在真核细胞中同时表达his-t1r2(序列见seqidno.2)、flag-t1r3(序列见seqidno.6)和ha-g15-gustducin44(序列见seqidno.12)的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将制备得到的表达ha-g15-gustducin44(序列见seqidno.12)的重组质粒用电穿孔转染法转染进入稳定表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)的真核细胞系(保藏编号为cctccno:c2017260)中，在真核细胞中同时表达三种重组蛋白，即his-t1r2(序列见seqidno.2)、flag-t1r3(序列见seqidno.6)和ha-g15-gustducin44(序列见seqidno.12)。本发明具有以下有益效果：(1)本发明利用电穿孔转染法建立共表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)的真核细胞系，在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平，两种重组蛋白在细胞膜上共表达；(2)本发明构建的表达his-t1r2(序列见seqidno.2)、flag-t1r3(序列见seqidno.6)和ha-g15-gustducin44(序列见seqidno.12)的重组质粒中，除了分别包含插入编码t1r2、t1r3和g15-gustducin44蛋白的核酸序列外，还分别对应含有编码his标签序列、flag标签序列和ha标签序列的核酸序列，所述标签序列都有商业化抗体提供，便于后期应用蛋白质免疫印迹技术检测蛋白表达；(3)本发明提供的稳定共表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)的真核细胞系能够在细胞膜上大量表达重组甜味受体蛋白his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)，可以通过检测细胞内钙离子的浓度来评估真核细胞系中甜味受体t1r2/t1r3的活化水平，所述方法易标准化、重复性好；(4)本发明提供了共表达his-t1r2(序列见seqidno.2)、flag-t1r3(序列见seqidno.6)的真核细胞系，通过检测所述细胞系中甜味受体t1r2/t1r3的活化水平来，即通过检测添加待测物后所述细胞系的胞内钙离子浓度变化，来评估待测物的甜度，建立了一种可以快速、高效筛选糖分子甜度的方法，为食品甜度的检测、糖尿病的治疗、甜味拮抗剂和激动剂的筛选与研制提供一种技术方法，可以用于食品工业、医学及药学等领域。具有较好的应用前景。(5)本发明细胞系的制备方法简单、成本低廉、准确性高，能够高通量、低成本、准确的筛选不同甜度的糖分子激动剂，具有很好的稳定性和可靠性，有很好的市场前景。附图说明图1和图2是稳定共表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)细胞系克隆的蛋白质免疫印迹检测结果(分别应用t1r2特异性抗体和t1r3特异性抗体)；图3是稳定共表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)细胞系克隆的免疫荧光检测结果(应用t1r2特异性抗体和t1r3特异性抗体)；图4是稳定共表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)细胞系克隆免疫荧光检测结果(应用his特异性抗体和flag特异性抗体)；图5是在共表达his-t1r2(序列见seqidno.2)和flag-t1r3(序列见seqidno.6)细胞系克隆中转染表达g15-gustducin44嵌合体蛋白的蛋白质免疫印迹检测结果。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。实施例1稳定共表达his-t1r2和flag-t1r3真核细胞系的构建及检测。1.his-t1r2重组质粒的构建及检测1.1.编码his-t1r2的核酸序列设计及制备以人源t1r2基因编码区核酸序列为模板，设计用于编码his-t1r2(seqidno.2)的特异性正向引物t1r2-f(seqidno.3)和特异性反向引物t1r2-r(seqidno.4)。t1r2-f的核酸序列中在起始密码子前加入hindiii酶切位点和保护性碱基，并在起始密码子后连接编码his标签的核酸序列，再连接t1r2基因编码区核酸序列。t1r2-r的核酸序列中在t1r2编码序列末端加有终止子、xhoi酶切位点与保护性碱基。以人源t1r2基因的编码区核酸序列为模板，加入引物t1r2-f和t1r2-r进行基因扩增，得到编码his-t1r2的核酸序列(序列见seqidno.1)。扩增体系见表1：表1dna扩增预混液20μl引物t1r2-f(10μm)2μl引物t1r2-r(10μm)2μlt1r2编码区核酸序列(0.1-1μg)2μl去离子水14μl总体积40μl扩增条件为95℃预变性5min，再进行35个循环反应，最后72℃延伸5min。所述循环反应条件为95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s。基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后回收，再经hindiii和xhoi酶切后回收，得到酶切的his-t1r2基因扩增产物。1.2.重组质粒的构建将真核表达载体pcdna3.1(+)用hindiii和xhoi酶切后回收，然后与酶切的his-t1r2基因扩增产物在t4连接酶作用下连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞后涂布在含氨苄青霉素的lb固体培养基，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，经核酸测序鉴定，确认插入核酸序列正确的阳性质粒即为本实施例所需的重组质粒，保存质粒。2.flag-t1r3重组质粒的构建及检测2.1.编码人源flag-t1r3的核酸序列设计及制备以人源t1r3基因编码区核酸序列为模板，设计用于编码flag-t1r3(seqidno.6)的特异性正向引物t1r3-f(seqidno.7)和特异性反向引物t1r3-r(seqidno.8)。t1r3-f的核酸序列中在起始密码子前加入hindiii酶切位点和保护性碱基，并在起始密码子后加入编码flag标签的核酸序列，后面连接t1r3基因编码区核酸序列。t1r3-r的核酸序列中在t1r3编码末端加有终止子、xhoi酶切位点与保护性碱基。以人源t1r3基因的编码区核酸序列为模板，加入引物t1r3-f和t1r3-r进行基因扩增，得到编码flag-t1r3的核酸序列(seqidno.5)。扩增体系见表2：表2dna扩增预混液20μl引物t1r3-f(10μm)2μl引物t1r3-r(10μm)2μlt1r3编码区核酸序列(0.1-1μg)2μl去离子水14μl总体积40μl扩增条件为95℃预变性5min，再进行35个循环反应，最后72℃延伸5min。所述循环反应条件为95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s。基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后回收，再经hindiii和xhoi酶切后回收，得到酶切的flag-t1r3基因扩增产物。2.2.重组质粒的构建将真核表达载体pcdna3.1(+)用hindiii和xhoi酶切后回收，然后与酶切的flag-t1r3基因扩增产物在t4连接酶作用下连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞后涂布在含氨苄青霉素的lb固体培养基，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，经核酸测序鉴定，确认插入核酸序列正确的阳性质粒即为本实施例所需的重组质粒，保存质粒。3.稳定表达his-t1r2和flag-t1r3的真核细胞系的构建及检测3.1.表达his-t1r2和flag-t1r3的重组质粒共转染真核细胞hek293利用电穿孔方法将表达his-t1r2和flag-t1r3的重组质粒共同转染入真核细胞hek293，具体步骤如下所示：取传代的真核细胞hek293，移除细胞培养液，所述细胞培养液为rmpi1640，gibco公司产品。用5ml磷酸缓冲液(10mm，ph7.4)洗涤hek293细胞两次，用1ml0.25wt％的胰蛋白酶(trypsin)消化细胞2min，加入新鲜的细胞培养液中止消化，转移细胞至15ml离心管中，180g离心5min，除去上层清液；再用5ml磷酸缓冲液(10mm，ph7.4)重悬细胞，180g离心5min，除去上层清液，向下层沉淀加入适量5x电转缓冲液(表3)制备悬浮细胞。配制电转溶液，体系如表4所示。表3：5x电转缓冲液(ph＝7.4)试剂浓度k2hpo4250mmch3cook100mmkoh100mm表4：电转溶液溶液体积表达his-t1r2重组质粒(1μg/μl)4μl表达flag-t1r3重组质粒(1μg/μl)4μl5x电转缓冲液40μlmgso48μl加入超纯水至总体积200μl取100μl细胞悬浮液加至200μl电转溶液中，轻轻混匀，室温静置10min。将300μl混合液加入电转槽按照设定程序进行电转操作，电容设定为1000μf，电压设定为260v。将转染的细胞转移至10ml新鲜细胞培养液中，混匀后加入培养皿中，转入co2培养箱中培养。3.2.阳性克隆的筛选转染后的细胞培养约48h后，在细胞培养液中加入g418，使其终浓度为600μg/ml(所述g418为遗传霉素，为一种氨基糖苷类抗生素)。继续培养48h后换入新的、g418终浓度为600μg/ml的新鲜细胞培养液培养细胞。每隔2天换含600μg/ml的g418的新鲜细胞培养液培养2天，重复6次。消化、收集细胞，用有限稀释法将细胞分在96孔板中，加入含600μg/ml的g418的新鲜细胞培养液，继续培养10天。挑取96孔板中由单个细胞克隆体到24孔板中，待其长到合适的数量后，传代到12孔板中。重复此过程，将细胞依次扩大培养到6孔板、60mm培养皿、100mm培养皿，并保种。3.3.阳性克隆体的鉴定将阳性克隆体在100mm培养皿中培养2天，收集细胞并裂解，用蛋白质免疫印迹技术进行鉴定，以获得阳性克隆体中his-t1r2和flag-t1r3的表达情况。利用t1r2特异性抗体和t1r3特异性抗体，通过蛋白质免疫印迹技术检验，我们发现并挑选出his-t1r2和flag-t1r3共表达的阳性克隆体，继续扩大培养后保存，将该细胞系命名为hek293-t1r2/t1r3，进行后续实验。图1所示蛋白质免疫印迹显影结果表明阳性克隆体中有his-t1r2表达，图2所示蛋白质免疫印迹显影结果表明阳性克隆体中有flag-t1r3表达。图1和图2中所示肌动蛋白(β-actin)在本实例用作为内参蛋白。实施例2免疫荧光检测his-t1r2和flag-t1r3甜味受体蛋白在真核细胞中的表达和定位。1.样品的制备通过使用免疫荧光技术，我们检测上述真核细胞系中his-t1r2和flag-t1r3的表达和定位。使用新鲜细胞培养液将5-10x105个稳定共表达his-t1r2和flag-t1r3的hek293细胞种植在3.5cm的培养皿中，培养皿中放置13mm的圆形盖玻片。在细胞覆盖密度达到50％-80％时，将盖玻片取出，经过含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液固定、含3％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液封闭后，用t1r2特异性抗体(兔源)和t1r3特异性抗体(羊源)共同孵育，去除未结合抗体，最后用抗兔的二抗fitc抗体和抗鼠的二抗tritc抗体分别孵育，去除未结合抗体，制成可用于共聚焦显微镜检测免疫荧光的样品一，所述fitc为荧光标签异硫氰酸荧光素，所述tritc为荧光标签罗丹明。另外使用新鲜细胞培养液将5-10x105个稳定共表达his-t1r2和flag-t1r3的hek293细胞种植在3.5cm的培养皿中，培养皿中放置13mm的圆形盖玻片。在细胞覆盖密度达到50％-80％时，将盖玻片取出，经过含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液固定、含3％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液封闭后，用his特异性抗体(鼠源)孵育，去除未结合抗体，再用抗鼠的二抗tritc抗体孵育，去除未结合抗体，制成可用于共聚焦显微镜检测免疫荧光的样品二。另外使用新鲜细胞培养液将5-10x105个稳定共表达his-t1r2和flag-t1r3的hek293细胞种植在3.5cm的培养皿中，培养皿中放置13mm的圆形盖玻片。在细胞覆盖密度达到50％-80％时，将盖玻片取出，经过含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液固定、含3％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液封闭后，用flag特异性抗体(鼠源)孵育，去除未结合抗体，最后用抗鼠的二抗fitc抗体孵育，去除未结合抗体，制成可用于共聚焦显微镜检测免疫荧光的样品三。2.荧光检测将制备好的玻片倒置在共聚焦显微镜下，在明场下，用60x物镜找到细胞密度适中的观察区域，调节焦距，清晰地观测细胞样品。转换为荧光观察，根据荧光染料选择合适观测参数，图像满足要求时，尽量使用低激光强度。并通过调节pmthv(增强图像信号)，gain(增强信号)和offset(扣除背景)参数得到适合图像。然后进行荧光扫描。在显微镜下检测样品一，结合在t1r2蛋白抗体上的fitc，在488nm激光法激发下，呈绿色荧光信号，拍摄结果如图3a；结合在t1r3蛋白抗体上的tritc，在559nm激光法激发下，呈红色荧光信号，拍摄结果如图3b。免疫荧光成像结果表明在稳定共表达his-t1r2和flag-t1r3的hek293细胞中，his-t1r2和flag-t1r3分布在细胞的质膜上。在显微镜下检测样品二，结合在his标签蛋白抗体上的tritc在559nm激光法激发下，呈红色荧光信号，拍摄结果如图4a；在显微镜下检测样品三，结合flag标签蛋白抗体上的fitc在488nm激光法激发下，呈绿色荧光信号，拍摄结果如图4b。免疫荧光成像结果表明应用his标签蛋白抗体和flag标签蛋白抗体可以分别观察到his-t1r2和flag-t1r3分布在细胞的质膜上。实施例31.plvx-puro-ha-g15-gustducin44重组质粒的构建及检测1.1.编码人源ha-g15-gustducin44的核酸序列设计及制备以表达人源gα15蛋白的编码区核酸序列(seqidno.9)和表达人源gustducin蛋白的编码区核酸序列(seqidno.10)为模板，合成编码带有ha标签的嵌合体蛋白g15-gustducin44的核酸序列(seqidno.11)，表达带有ha标签的由人源gα15蛋白第1位到第340位氨基酸和人源gustducin蛋白第331位到第374位氨基酸组成的嵌合体蛋白(简称为ha-g15-gustducin44，序列见seqidno.12)。设计用于扩增编码ha-g15-gustducin44核酸序列(seqidno.11)的特异性正向引物g15-gustducin44-f(seqidno.13)和特异性反向引物g15-gustducin44-r(seqidno.14)。正向引物g15-gustducin44-f(seqidno.13)的核酸序列中在起始密码子前加入bstbi酶切位点和保护性碱基。反向引物g15-gustducin44-r(seqidno.14)的核酸序列中在g15-gustducin44编码末端加有终止子、xbai酶切位点与保护性碱基。以人源g15-gustducin44的编码区核酸序列为模板，加入引物g15-gustducin44-f和g15-gustducin44-r进行基因扩增。扩增体系见下表5：表5dna扩增预混液20μl引物g15-gustducin44-f(10μm)2μl引物g15-gustducin44-r(10μm)2μlg15-gustducin44编码区核酸序列(0.1-1μg)2μl去离子水14μl总体积40μl扩增条件为95℃预变性5min，再进行35个循环反应，最后72℃延伸5min。所述循环反应条件为95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s。基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后回收，再经bstbi和xbai酶切后回收，得到酶切的g15-gustducin44基因扩增产物。1.2.重组质粒的构建将真核表达载体plvxpuro用bstbi和xbai酶切后回收，然后与酶切的g15-gustducin44基因扩增产物在t4连接酶作用下连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞后涂布在含氨苄青霉素的lb固体培养基，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，经核酸测序鉴定，确认核酸序列正确的阳性质粒即为本实施例所需的重组质粒，保存质粒。2.ha-g15-gustducin44在稳定共表达his-t1r2和flag-t1r3真核细胞系中的表达及检测2.1.表达ha-g15-gustducin44的重组质粒转染真核细胞hek293利用电穿孔转染法将表达ha-g15-gustducin44的重组质粒转染进入稳定共表达his-t1r2和flag-t1r3的真核细胞系中，具体步骤如下所示：取传代的稳定共表达his-t1r2和flag-t1r3真核细胞，移除细胞培养液，用5ml磷酸缓冲液(10mm，ph7.4)洗涤两次，用1ml0.25％的胰蛋白酶(trypsin)消化细胞2min，加入新鲜的细胞培养液中止消化，转移细胞至15ml离心管中，180g离心5min，除去上层清液；再用5ml磷酸缓冲液(10mm，ph7.4)重悬细胞，180g离心5min，除去上层清液，向下层沉淀加入适量5x电转缓冲液(表3)制备悬浮细胞。配制电转溶液，体系如下表6所示，表6溶液体积表达ha-g15-gustducin44重组质粒(1μg/μl)4μl5x电转缓冲液40μlmgso48μl加入超纯水至total200μl取100μl细胞悬浮液加至200μl电转溶液中，轻轻混匀，室温静置10min。将300μl混合液加入电转槽按照设定程序进行电转操作，电容设定为1000μf，电压设定为260v。将转染的细胞转移至10ml新鲜细胞培养液中，混匀后加入培养皿中，转入co2培养箱中培养。两天后，收取细胞样品，利用ha特异性抗体，通过蛋白质免疫印迹技术检验，检测ha-g15-gustducin44在稳定共表达his-t1r2和flag-t1r3真核细胞系中的表达情况，实验结果表明通过转染，ha-g15-gustducin44能够在稳定共表达his-t1r2和flag-t1r3真核细胞系中表达，如图5所示。图5中所示肌动蛋白(β-actin)在本实例用作为内参蛋白。本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。附序列表：seq1编码his-t1r2的核酸序列，序列长度：2550，人工序列seq2his-t1r2蛋白氨基酸序列，序列长度：849，人工序列seq3his-t1r2正向引物，序列长度：66，人工序列seq4his-t1r2反向引物，序列长度：32，人工序列seq5编码flag-t1r3的核酸序列，序列长度：2592，人工序列seq6flag-t1r3蛋白氨基酸序列，序列长度:863，人工序列seq7flag-t1r3正向引物，序列长度：68，人工序列seq8flag-t1r3反向引物，序列长度：29，人工序列seq9编码g15的核酸序列，序列长度：1125，人体seq10编码gustducin的核酸序列，序列长度：1065，人体seq11编码ha-g15-gustducin的核酸序列，序列长度：1155，人工序列seq12ha-g15-gustducin蛋白氨基酸序列，序列长度：384，人工序列seq13ha-g15-gustducin正向引物，序列长度：59，人工序列seq14ha-g15-gustducin反向引物，序列长度：32，人工序列序列表<110>云南中烟工业有限责任公司颜克亮陈微陈兴苏莉翁俊秦曦<120>一种稳定共表达重组人源甜味受体蛋白的真核细胞系及其制备方法<130>rie180080<160>14<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2550<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atggggcatcatcatcatcatcatggatccatggggcccagggcaaagaccatctcctcc60ctgttcttcctcctatgggtcctggctgagccggctgagaactcggacttctacctgcct120ggggattacctcctgggtggcctcttctccctccatgccaacatgaagggcattgttcac180cttaacttcctgcaggtgcccatgtgcaaggagtatgaagtgaaggtgataggctacaac240ctcatgcaggccatgcgctttgcggtggaggagatcaacaatgacagcagcctgctgcct300ggtgtgctgctgggctatgagatcgtggatgtgtgctacatctccaacaatgtccagccg360gtgctctacttcctggcacacgaggacaacctccttcccatccaagaggactacagtaac420tacatttcccgtgtggtggctgtcattggccctgacaactccgagtctgtcatgactgtg480gccaacttcctctccctatttctccttccacagatcacctacagcgccatcagcgatgag540ctgcgagacaaggtgcgcttcccggctttgctgcgtaccacacccagcgccgaccaccac600atcgaggccatggtgcagctgatgctgcacttccgctggaactggatcattgtgctggtg660agcagcgacacctatggccgcgacaatggccagctgcttggcgagcgcgtggcccggcgc720gacatctgcatcgccttccaggagacgctgcccacactgcagcccaaccagaacatgacg780tcagaggagcgccagcgcctggtgaccattgtggacaagctgcagcagagcacagcgcgc840gtcgtggtcgtgttctcgcccgacctgaccctgtaccacttcttcaatgaggtgctgcgc900cagaacttcactggcgccgtgtggatcgcctccgagtcctgggccatcgacccggtcctg960cacaacctcacggagctgcgccacttgggcaccttcctgggcatcaccatccagagcgtg1020cccatcccgggcttcagtgagttccgcgagtggggcccacaggctgggccgccacccctc1080agcaggaccagccagagctatacctgcaaccaggagtgcgacaactgcctgaacgccacc1140ttgtccttcaacaccattctcaggctctctggggagcgtgtcgtctacagcgtgtactct1200gcggtctatgctgtggcccatgccctgcacagcctcctcggctgtgacaaaagcacctgc1260accaagagggtggtctacccctggcagctgcttgaggagatctggaaggtcaacttcact1320ctcctggaccaccaaatcttcttcgacccgcaaggggacgtggctctgcacttggagatt1380gtccagtggcaatgggaccggagccagaatcccttccagagcgtcgcctcctactacccc1440ctgcagcgacagctgaagaacatccaagacatctcctggcacaccatcaacaacacgatc1500cctatgtccatgtgttccaagaggtgccagtcagggcaaaagaagaagcctgtgggcatc1560cacgtctgctgcttcgagtgcatcgactgccttcccggcaccttcctcaaccacactgaa1620gatgaatatgaatgccaggcctgcccgaataacgagtggtcctaccagagtgagacctcc1680tgcttcaagcggcagctggtcttcctggaatggcatgaggcacccaccatcgctgtggcc1740ctgctggccgccctgggcttcctcagcaccctggccatcctggtgatattctggaggcac1800ttccagacacccatagttcgctcggctgggggccccatgtgcttcctgatgctgacactg1860ctgctggtggcatacatggtggtcccggtgtacgtggggccgcccaaggtctccacctgc1920ctctgccgccaggccctctttcccctctgcttcacaatctgcatctcctgtatcgccgtg1980cgttctttccagatcgtctgcgccttcaagatggccagccgcttcccacgcgcctacagc2040tactgggtccgctaccaggggccctacgtctctatggcatttatcacggtactcaaaatg2100gtcattgtggtaattggcatgctggccacgggcctcagtcccaccacccgtactgacccc2160gatgaccccaagatcacaattgtctcctgtaaccccaactaccgcaacagcctgctgttc2220aacaccagcctggacctgctgctctcagtggtgggtttcagcttcgcctacatgggcaaa2280gagctgcccaccaactacaacgaggccaagttcatcaccctcagcatgaccttctatttc2340acctcatccgtctccct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