本发明涉及到细胞生物学技术，具体涉及一种采用aldh18a1-1shrna技术构建aldh18a1稳定低表达的smmc-7721细胞系的方法。
背景技术：
乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase，aldh)是近来新发现的癌症相关基因，aldh超家族是一类是nadp+依赖的酶，具有多功能的蛋白。目前为止，研究发现至少有19个aldh基因。人类的aldh超家族成员有：1a1、1a2、1a3、1b1、1b2、1l1、1l2、3a1、3a2、3b1、3b2、4a1、5a1、6a1、7a1、8a1、9a1、16a1和18a1分别定位于不同染色体区段上。该超家族中多个成员的的活性已证实于细胞的增殖、凋亡、信号转导、细胞周期等多个生物学过程相关。现阶段研究表明，在乳腺癌、结肠癌、白血病、肺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多种癌症中均发现aldh的表达异常。这些提示aldh作为癌症相关的调控酶在肿瘤发生、发展、转移等方面均有重要作用。
aldh18a1定位于线粒体的内膜，其在人肾脏、胰腺、卵巢和睾丸等处中高表达，在心脏和骨骼肌、结肠等处中度表达。aldh18a1包含两个结构域：n末端的γ-谷氨酰激酶结构域和c末端的γ-谷氨酰磷酸还原酶结构域。aldh18a1通过催化谷氨酸盐的还原反应，生成△－吡咯啉－5－羧基合成酶(p5c)，p5c再进一步转变为鸟氨酸。该通路涉及脯氨酸和精氨酸的从头合成，作为能量代谢通路的关键酶在肿瘤发生发展中起到至关重要的作用。aldh18a1的突变可引起一系列如低脯/鸟氨酸血症、低精氨酸血症和伴有神经退行性变及结缔组织异常的高氨血症等代谢异常疾病。
癌症现阶段已成为全球健康的首要杀手，每年都有大量人员因癌症导致死亡。其中，肝癌是位居第二的致死性癌症，同时也是近年来发病率一直呈上升趋势的癌症种类之一。现阶段研究表明，肝癌的发生发展与能量代谢异常有着密切的关系。因此建立一系列人肝癌细胞系会为肝癌发生发展的机制研究和临床用药指导提供研究基础。
rna干扰技术是近些年来发展起来的一项基因沉默技术，该技术的出现为研究基因的功能、信号通路及基因治疗等方面都提供了新的研究手段，与传统的基因工程技术相比，其具有特异性强、级联放大等优点。但是sirna为化学合成，转染后在细胞内可被降解，从而导致沉默效率较低；而shrna可视为在载体上连接sirna序列，将载体转入细胞后在细胞内转录生成shrna，细胞内的dicer酶将其修饰后生成相应的sirna，从而发挥rnai作用，而且干扰效果更稳定、更持久。常用的构建shrna的病毒表达载体有腺病毒载体、慢病毒载体等，这些病毒载体的作用机制与质粒载体相似，但是病毒相对于质粒具有感染效率高的特点，从而解决了质粒载体转染效率低等缺陷。
技术实现要素：
本发明的目的旨在提供一种aldh18a1低表达的smmc-7721细胞系的构建方法。本发明采用aldh18a1shrna干扰技术构建aldh18a1稳定低表达的smmc-7721细胞系，即smmc-7721aldh18a1kd细胞系。
本发明通过下述技术方案实现：
本发明的一方面在于：aldh18a1稳定低表达的smmc-7721细胞系的构建方法，包括如下步骤：
(a)病毒的构建及富集
·此四种质粒需要在293t细胞中构建两种病毒，每种病毒由三种质粒构成，分别是包装质粒pspax2，包膜质粒pvsv.g和慢病毒载体shaldh18a1rna。
·第一天：将2×106个hek-293t细胞种在10cm皿中，使用7ml添加胎牛血清的dmem培养基培养，此培养基中不含抗生素。置于37℃,5％co2培养箱中培养。
·第二天：在hek-293t细胞长至80％汇合时，使用lipofectamine2000做细胞转染。
·7.2ugpspax2包装质粒；0.8ugpvsv.g包膜质粒；8ug慢病毒载体shaldh18a1rna
·置于37℃,5％co2培养箱中强制转染6-8小时。之后添加9ml胎牛血清及1％青霉素/链霉素的dmem培养基。
·培养72小时后收取培养基，1000rpm离心5min，取上清。
(b)7721细胞感染
·在六孔板中种2*105/孔的7721细胞使用2ml添加胎牛血清的dmem培养基培养，此培养基中不含抗生素置于37℃,5％co2培养箱中培养。
·第二天将培养基全部抽走，将3ml新鲜的病毒培养液添加到7721培养皿种，强制转染24小时。
·第三天将培养液吸走2ml,并添加2ml的dmem+10％fbs培养2-3天。
·镜检有一部分荧光细胞后，将细胞传代到10cm皿中，传代第二天开始嘌呤霉素的筛选，开始浓度为1ug/ml.直到不再出现大量死亡浓度增加到2ug/ml.一直持续筛选，出现克隆后，挑取单克隆进行培养。细胞扩大培养后增加药物浓度3ug/ul继续筛选，直到无大量死亡再增加药物浓度4ug/ml，筛选后扩大培养并进行沉默效果检测，得到理想效果后冻存。
本发明的另一方面在于：利用上述构建方法所获得的aldh18a1稳定低表达的smmc-7721细胞系。
经过获得aldh18a1shrna重组质粒、包装病毒，然后对病毒感染后的细胞进行嘌呤霉素筛选，传代，建立稳定低表达的smmc7721-aldh18a1kd细胞系，最终获得阳性重组细胞系，能够低表达aldh18a1。aldh18a1稳定低表达的smmc7721细胞系可作为理想的模型来进行aldh18a1参与的肿瘤发生发展机制的研究。
附图说明
图1：为载体hushshrnaplasmid,pgfp-c-shlenti的质粒图谱。
图2：为细胞转染后的荧光显微镜图片；其中a为转染空载体的对照组，b为转染aldh18a1shrna组。
图3：为分别转染aldh18a1空载体和shrna质粒，smmc-7721细胞中aldh18a1的表达的westernblot结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、特征及优点更加明显易懂，下面将结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
一实施方式的稳定低表达的aldh18a1的7721细胞系，包括真核表达载体病毒的构建及富集。
带有shrna序列的载体购自origene公司。
将包括用于抑制aldh18a1表达的序列的真核表达载体转染到细胞中，得到稳定低表达的aldh18a1的细胞系。
此四种质粒需要在293t细胞中构建两种病毒，每种病毒由三种质粒构成，分别是包装质粒pspax2，包膜质粒pvsv.g和慢病毒载体shaldh18a1rna。
第一天：将2×106个hek-293t细胞种在10cm皿中，使用7ml添加胎牛血清的dmem培养基培养，此培养基中不含抗生素。置于37℃,5％co2培养箱中培养。
第二天：在hek-293t细胞长至80％时，使用lipofectamine2000做细胞转染。7.2ugpspax2包装质粒；0.8ugpvsv.g包膜质粒；8ug慢病毒载体shaldh18a1rna。置于37℃,5％co2培养箱中强制转染6-8小时。之后添加9ml胎牛血清及1％青霉素/链霉素的dmem培养基。培养72小时后收取培养基，1000rpm离心5min，取上清。
一实施方式的用上述包装好的病毒感染7721细胞
在六孔板中种2*105/孔7721细胞使用2ml添加胎牛血清的dmem培养基培养，此培养基中不含抗生素置于37℃,5％co2培养箱中培养。
第二天将培养基全部抽走，将3ml新鲜的病毒培养液添加到7721培养皿种，强制转染24小时。
第三天将培养液吸走2ml,并添加2ml的dmem+10％fbs培养2-3天。
镜检有一部分荧光细胞后，将细胞传代到10cm皿中。
一实施方式的目的细胞的筛选。
传代第二天开始puro药物筛选，开始浓度为1μg/ml.直到不再出现大量死亡浓度增加到2μg/ml.一直持续筛选，出现克隆后，挑取单克隆进行培养。细胞扩大培养后增加药物浓度3μg/ul继续筛选，直到无大量死亡再增加药物浓度4μg/ml，筛选后扩大培养并进行沉默效果检测，得到理想效果后冻存。
上述实施例仅表述了本发明的几种实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。对于本领域的技术人员，在不脱离本发明构思的前提下所做出的变形和改进这些都属于本发明的保护范围。
序列表1所示序列：acacggatgtcatcgtcacagaggacgaa。
sequencelisting
<110>中国科学院大连化学物理研究所
<120>一种稳定低表达smmc7721的细胞系及构建方法
<130>
<160>1
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>29
<212>dna
<213>人工合成
<220>
<221>dna
<222>(1)..(29)
<400>1
acacggatgtcatcgtcacagaggacgaa29