本发明实施例涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种抗衰老的干细胞培养基及间充质干细胞培养方法。
背景技术：
骨髓间充质干细胞（bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell，bmsc）是存在于骨髓中的一群间充质干细胞，具有很强的克隆形成能力及自我更新能力。高表达间充质干细胞细胞表面标志cd29，cd73及cd105，拥有多向分化潜能，能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞、成肌细胞等多种细胞类型。现在研究普遍认为，bmsc在骨组织的发育及修复再生中均发挥着关键作用。bmsc是成骨前体细胞的来源，直接参与骨发育、改建、修复及再生。在骨改建过程中，bmsc向骨吸收处迁移，并通过向成骨细胞、成软骨细胞分化，形成新骨。在骨折及骨缺损发生后，bmsc能够被迅速动员并向局部组织迁移，促进骨组织的再生修复。因为msc的强大再生修复功能，已被广泛运用于组织工程骨的构建和骨缺损修复中。
大段骨缺损修复需要的细胞量巨大，而通过骨髓分离培养的原代bmsc数量有限，所以bmsc必须在体外进行长期扩增才能满足临床治疗需要。但是最新研究显示，在细胞长期多次传代扩增过程中，bmsc会出现相应的老化现象，表现为自我更新能力的降低和成骨分化能力显著下降，导致其骨再生和修复能力降低。如何避免bmsc在体外长期传代过程中的衰老已成为制约其临床应用的关键瓶颈。
microrna（mirna）是一类广泛存在于细胞内的单链、非编码小rna，在bmsc成骨分化中发挥关键的调控作用。现有技术中，越来越多的研究发现，mirna表达水平的改变可导致bmsc分化功能缺陷，引起多种骨疾病发生。经过前期多项研究发现，在细胞衰老过程中，bmsc的mirna表达谱发生了显著改变，并证实其中mir-705的表达异常，是造成bmsc功能下降的重要原因。那么，如何解决bmsc功能下降成为当前亟需解决的问题。
技术实现要素：
本发明提供一种抗衰老的干细胞培养基及间充质干细胞培养方法，能够延缓长期体外传代扩增所致的间充质干细胞衰老和功能下降。
第一方面，本发明实施例提供了一种抗衰老的干细胞培养基，包括：
低糖α-mem培养基、胎牛血清、mir-705antagomir、维生素c、谷氨酰胺、青霉素和链霉素。
进一步地，培养基按1升计，包括：
低糖α-mem培养基880毫升ml、胎牛血清100ml、mir-705antagomir10微克μg、维生素c10毫克mg、谷氨酰胺2毫摩尔mmol、青霉素10ml和链霉素10ml。
进一步地，培养基还包括：两性霉素。
第二方面，本发明实施例还提供了一种间充质干细胞培养方法，应用具有上述第一方面中任意一项特征的抗衰老的干细胞培养基，该方法包括：
步骤一、间充质干细胞分离：获取骨髓，并加入等体积的磷酸盐缓冲液稀释骨髓，加入单核细胞分离液，收集单核细胞；
步骤二、间充质干细胞的原代培养：将单核细胞重悬于基础培养基中培养；
步骤三、间充质干细胞的前期传代培养：待单核细胞增殖至75%-80%密度时，吸尽基础培养基中的培养基，传代，继续用基础培养基培养；
步骤四、间充质干细胞的后期传代培养：待单核细胞培养至第五代之后，用抗衰老的干细胞培养基继续培养。
进一步地，步骤一，具体包括：
经髂骨髂脊穿刺抽取骨髓5ml，肝素抗凝；加入等体积的磷酸盐缓冲液稀释骨髓，以1：2比例加入单核细胞分离液上层，1500转/分离心20min，吸取单核细胞层细胞；pbs重悬后离心，收集单核细胞。
进一步地，步骤二，具体包括：
将单核细胞重悬于基础培养基中，置于37℃，5%co2孵箱培养24hr；pbs清洗3次去除未贴壁细胞；剩余贴壁的单核细胞继续培养，每3天换液。
进一步地，步骤三，具体包括：
待单核细胞增殖至75%-80%密度时，吸尽基础培养基中的培养基，使用0.5%胰酶消化后，以1：3比例传代，继续用基础培养基培养。
其中，将收集到的细胞以1：3比例传代是指：将收集到的细胞平均分成三份加到三个培养瓶里，随后加入基础培养基传代培养。
进一步地，步骤四，具体包括：
待单核细胞培养至第五代之后，用抗衰老的干细胞培养基继续培养，每3天换液。
进一步地，方法还包括：
基础培养基的制备：将胎牛血清100ml，青霉素10ml、链霉素10ml依次加入880mlα-mem培养基中，混匀后置于4℃保存。
进一步地，方法还包括：
抗衰老的干细胞培养基的制备：在1l基础培养基中加入10μgmir-705antagomir、10mg维生素c和2mmol谷氨酰胺，混匀后置于4℃保存。
本发明针对间充质干细胞衰老过程中的microrna异常表达，采用特异性的microrna抑制剂antagomir，不需要转染试剂和载体，直接进入细胞，从而安全高效的调控细胞表达，下调mir-705，从而延缓长期体外传代扩增所致的间充质干细胞衰老和功能下降，为bmsc临床应用建立基础。
同时，本发明所提供的抗衰老的干细胞培养基成分明确、配方简单、成本较低，可以有效的维持间充质干细胞在体外长期传代扩增后的自我更新能力和多向分化能力，延缓体外传代所致的细胞衰老。利用该方法获得的p10代间充质干细胞，不仅数量多，而且再生修复能力较原代细胞无显著降低，是细胞治疗的理想细胞来源。
附图说明
图1是本发明实施例提供的第10代间充质干细胞镜下形态学检测示意图；
图2是本发明实施例提供的第10代间充质干细胞表面标记示意图；
图3是本发明实施例提供的第10代间充质干细胞克隆形成检测示意图；
图4是本发明实施例提供的第10代间充质干细胞生长曲线示意图；
图5是本发明实施例提供的第10代间充质干细胞成骨分化检测示意图；
图6是本发明实施例提供的第10代间充质干细胞成脂分化检测示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部结构。
实施例一培养基配置
步骤1：基础培养基配置：
按照商品说明配置880mlα-mem培养基，按顺序加入胎牛血清100ml，青霉素10ml、链霉素10ml，充分混匀，配置基础培养基，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，于4℃保存。
步骤2：抗衰老的干细胞培养基配置：
在1l基础培养基中按顺序加入10μgmir-705antagomir、10mg维生素c和2mmol谷氨酰胺，混匀后配置成抗衰老培养基，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，4℃保存。
可选的，抗衰老的干细胞培养还包括：两性霉素。其中，两性霉素是一种从链霉菌(streptomycesnodosus)的培养液中分离而得的一类多烯类抗真菌药。
实施例二
采用实施例一提供的基础培养基和抗衰老的干细胞培养基，培养间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
步骤1：经髂骨髂脊穿刺抽取骨髓5ml，加入10，000u肝素抗凝；加入5ml的磷酸盐缓冲液稀释骨髓，分别缓慢加至两只盛有10ml单核细胞分离液的离心管中，确保骨髓分布于单核细胞分离液的上层。轻轻放入离心机内，以2000转/分离心20min，直至骨髓在单核细胞分离液中分层。随后用吸管小心吸取单核细胞层细胞，加入10mlpbs重悬、清洗后800转/分离心5分钟，吸尽上清，收集单核细胞。
步骤2：将步骤1收集到的骨髓单核细胞重悬于10ml基础培养基中，加入75cm培养瓶中，置于37℃，5%co2细胞培养液孵育24hr；取出培养瓶，pbs清洗3次去除未贴壁细胞，剩余贴壁的间充质干细胞继续采用基础培养基培养，每3天换液。
步骤3：待骨髓单核细胞增殖至75%-80%密度时，吸尽培养液，pbs清洗3次，加入1.5ml0.25%胰酶消化3min，加入2ml基础培养液中和剩余胰酶，800转/分离心5分钟，吸尽上清，收集到的细胞以1：3比例传代，继续用基础培养基培养。其中，将收集到的细胞以1：n比例传代是指：将收集到的细胞平均分成n份加到n个培养瓶里，随后加入基础培养基传代培养，n为大于或者等于1的整数。示例性的，将收集到的细胞以1：3比例传代即为将收集到的细胞平均分成三份加到三个培养瓶里，随后加入基础培养基传代培养。
步骤4：待间骨髓单核细胞进行第4次传代后，换用抗衰老培养基进行培养，每3天换液；细胞扩增至75%-80%时传代，直至第10代。
对实施例二第10代间充质干细胞鉴定方法如下：
1细胞形态观察：
采用倒置显微镜，于40倍和100倍放大倍数下对细胞形态进行观察。如图1所示，正常间充质干细胞的形态应为长梭形，细胞间形态均一。
2细胞表面标记检测
消化收集第10代间充质干细胞，分别与cd90、cd105、cd45、cd31荧光抗体孵育1hr，pbs清洗3次后，利用流式细胞仪检测不同标记阳性细胞的比例。如图2所示，从左至右依次为用cd90、cd105、cd45、cd31荧光抗体进行表面标记的示意图。
3细胞克隆形成能力检测
将第10代间充质干细胞以500个/皿的密度接种于10cm培养皿中，3-4天换液，培养2周后吸尽培养液，多聚甲醛固定10min，甲苯胺蓝染色1hr，pbs清洗3次后对形成的细胞克隆进行拍照和计数，间充质干细胞克隆形成检测示意图如图3所示。
4细胞生长曲线检测
将间充质干细胞以1000个/孔加入12孔板中，每24hr取3孔进行细胞计数，连续计数7天。根据计数结果绘制细胞生长曲线，结果如图4所示，从图4可以看出，第5-7天，细胞生长趋近于指数增长。
5细胞成骨分化能力检测
如图5所示，将间充质干细胞培养于6孔板内至75%密度，加入成骨诱导液（含100μg/ml维生素c、2mmβ-甘油磷酸钠和10nm地塞米松），每3天换液，培养2周后行茜素红染色，其所形成的矿化结节呈现为红色。
6细胞成脂分化能力检测
如图6所示，将间充质干细胞培养于6孔板内至85%密度，加入成脂诱导液（含0.5mm异丁基甲基黄基嘌呤、0.5μm地塞米松和60μm吲哚美辛），每3天换液，培养2周后行茜素红染色，其所形成的矿化结节呈现为红色。
实施例三
本发明实施例还提供一种抗衰老的干细胞培养基，包括：
低糖α-mem培养基、胎牛血清、mir-705antagomir、维生素c、谷氨酰胺、青霉素和链霉素。
具体的，抗衰老的干细胞培养基按1升计，包括：
低糖α-mem培养基880毫升ml、胎牛血清100ml、mir-705antagomir10微克μg、维生素c10毫克mg、谷氨酰胺2毫摩尔mmol、青霉素10ml和链霉素10ml。
更进一步地，抗衰老的干细胞培养还包括：两性霉素。其中，两性霉素是一种从链霉菌的培养液中分离而得的一类多烯类抗真菌药。
注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。