本发明涉及重组病毒疫苗领域，具体涉及一种表达新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株及其构建方法和应用。
背景技术：
传染性喉气管炎(infectiouslaryngotracheitis,ilt)是由传染性喉气管炎病毒(infectiouslaryngotracheitisvirus,iltv)引起一种鸡急性上呼吸道病毒性传染病。传染性喉气管炎病毒主要感染鸡呼吸系统，尤其是气管上皮是病毒主要繁殖场所。感染鸡发病时表现为张口呼吸、咳血、结膜炎、流泪等症状，部分强毒感染致死率达100％。本病1925年在美国首次报道后，现已遍及世界许多养鸡地区。本病传播快，死亡率较高，在我国较多地区发生和流行，给养鸡业造成巨大经济损失，是危害养鸡业的重要疫病之一。
传染性喉气管炎病毒的自然感染仅限于鸡，幼龄火鸡、野鸡、鹌鹑和孔雀也可感染，但以成年鸡症状最为特征。鸭、鸽、珍珠鸡、麻雀及所有哺乳动物不易感。病鸡、康复后的带毒鸡和无症状的带毒鸡是主要传染来源。传染性喉气管炎病毒与其它疱疹病毒一样，iltv的潜伏和激活都可以引起该病在鸡群中爆发。病毒的感染与品种、年龄和性别无关，成年鸡感染率较幼龄鸡高。本病一旦传入鸡群，则迅速传开，感染率可达90％以上，死亡率一般在10％以上，部分强毒死亡率达到70％。传染性喉气管炎病毒只有一个血清型，免疫接种是防治该病的最有效手段。目前国内外预防传染性喉气管炎使用较广泛的是弱毒疫苗，此类疫苗具有免疫效果好、免疫保护力产生快的特点，给鸡群进行免疫接种能有效预防该病。然而，随着畜禽集约化养殖业的发展，单价疫苗已显示出其一定的弊端，多次免疫的防控措施费时费力，多价联合疫苗便成为养殖业最受欢迎的疫病防控产品，因而开展鸡病多价联合疫苗成为必然选择。
iltv属疱疹病毒科，疱疹病毒甲亚科，传喉炎病毒属，禽疱疹病毒i型(herpesviridae，alphaherpesvirinae，iltovirusgallid，herpesvirus1)。其基因组为双股线性dna，大小约155kb，基因组具有典型的疱疹病毒结构，具有典型的疱疹病毒d型结构。病毒基因组结构由一个长独特区(ul)和一个短独特区(us)，在us区末端有末端重复序列(trs)，ul和us区之间有一反向重复序列(irs)，irs与trs序列相同但方向相反，由共价结合的两个区域组成，包括长独特区(ul)和短独特区(us)。
疱疹病毒基因组包含大量的复制非必需基因，包括tk、gc、gg、gk、us1、us2、us9、ul41、ul42、us7和us8等。在相关研究中将外源基因插入或替代疱疹病毒的非必须基因，构建重组病毒疫苗，这被认为是一种良好的重组活疫苗病毒载体，目前有关疱疹病毒作为载体的报道包括伪狂犬病载体、传染性喉气管炎病毒载体、马力克氏病毒载体以及火鸡疱疹病毒载体等。随着对传染性喉气管炎病毒研究的不断加深，以iltv为病毒活载体受到更加广泛的关注，iltv作为载体的优势在于该病毒宿主范围较窄，对鸭、鸽、珍珠鸡、麻雀及所有哺乳动物均不易感，无致病性，因此即使这些非自然宿主呼吸道瞬时增殖也不会对人和其他动物的健康安全造成影响，这对开发iltv病毒活载体疫苗具有重要意义。
目前，针对iltv病毒载体研究进展顺利，在已有报道中，已有20个独立基因已从iltv基因组中成功缺失，大量基因缺失毒株已获得(fuchsetal.,2007；mundtetal.,2011；pavlovaetal.,2010,2013)。在这些基因缺失毒株中，大约有8株在体内评价了毒株的致弱和免疫保护效力。这些毒株缺失的基因分别是胸苷激酶(ul23)(hanetal.,2002；schnitzleinetal.,1995)、糖蛋白g(us4)(iltvlinetal.,2006)，糖蛋白j(us5)(fuchsetal.,2005；mundtetal.,2011)、糖蛋白c(ul44)(pavlovaetal.,2010)、dutpase(ul50)(fuchsetal.,2000)、ic蛋白(orfc)(maricarmengarcia2016)、膜蛋白(ul47)(helferichetal.,2007)和编码未知功能的核蛋白(ul0基因)(veitsetal.,2003b)。这些基因缺失重组毒株的生长动力学分析表明它们对于细胞培养物中的病毒复制是非必需的(fuchsetal，2007)。用鸡评估这些基因缺失毒株的毒力时，发现δul50(dutpase)、δul44(gc)基因缺失毒株仍然表现出一定程度的毒力，而δus4(gg)、δul47、δul23、δul0和δorfc这些毒株表现出中等或显著致弱。此外，一些研究评估了iltv做为活病毒载体的能力，dorteluschow等将高致病力h5型禽流感病毒的ha基因插入viltv的ul50缺失位点。结果表明ul50缺失的致病iltv毒力明显减弱，但仍有一定程度的毒力(dorteetal，2001)。表达禽流感ha的重组iltv可以诱导鸡产生ha的抗体，可以有效抵抗致病性禽流感病毒的感染。2003年，juttaveits等将h7亚型的高致病力禽流感病毒的ha基因插入致病性iltvul0基因缺失位点，获得同样的可接受的结果(juttaetal，2003)。这些实验说明iltv这两个位点的缺失都降低了iltv的致病力，并且具有活疫苗载体潜力。但是，目前利用iltv非必须基因us9位点开展外源免疫原基因的重组病毒构建和应用均未见报道。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供了一种表达新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株，所述重组病毒株，riltv△us9-ndv-f株，分类命名是infectiouslaryngotracheitisvirus(实验室名称命名为：表达新城疫病毒f蛋白的重组传染性喉气管炎病毒)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其微生物保藏号是：cgmccno.14738，保藏日期为2017年11月02日。
进一步地，所述表达新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株缺失传染性喉气管炎病毒us9基因，该缺失位置插入ndv-f表达盒；所述ndv-f表达盒由cmv启动子、ndv-f基因以及polya终止子组成；所述us9基因的核苷酸序列如seqidno:1所示，所述ndv-f表达盒的核苷酸序列如seqidno:2所示，所述ndv-f表达盒上下游分别连有位于传染性喉气管炎病毒us9基因开放阅读框orf两侧的侧翼序列：左同源臂us9l，其核苷酸序列如seqidno:5所示；右同源臂us9r，核苷酸序列如seqidno:6所示。
本发明还提供了上述表达新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建含有egfp表达盒的重组转移载体：通过pcr扩增分别获得传染性喉气管炎病毒us9基因开放阅读框orf两侧的侧翼序列，即左同源臂us9l和右同源臂us9r；将左同源臂us9l、右同源臂us9r分别插入puc18载体中，获得中间载体pilt△us9；然后插入egfp表达盒，获得重组转移载体piltδus9-egfp，该载体中egfp表达盒上下游分别连有左同源臂us9l与右同源臂us9r；
所述egfp表达盒是从pegfp-n1载体上获得的，该表达盒由cmv启动子、增强型绿色荧光蛋白egfp基因以及polya终止子组成；所述egfp表达盒的核苷酸序列如seqidno:7所示；
(2)提取传染性喉气管炎病毒的完整基因组dna；
(3)利用步骤(1)中获得的重组转移载体piltδus9-egfp与步骤(2)中获得的传染性喉气管炎病毒的完整基因组dna共转染lmh细胞，通过蚀斑纯化法获得表达egfp的传染性喉气管炎重组病毒；
(4)构建ndv-f表达盒的重组转移载体：通过pcr扩增获得表达新城疫病毒f蛋白基因，将步骤(1)所述piltδus9-egfp重组载体中egfp基因切除，然后插入上述新城疫病毒f蛋白基因，获得重组转移载体piltδus9-ndv-f，该载体中ndv-f表达盒上下游分别连有左同源臂us9l与右同源臂us9r；
所述ndv-f表达盒由cmv启动子、ndv-f基因以及polya终止子组成；所述ndv-f表达盒的核苷酸序列如seqidno:2所示；
(5)提取步骤(3)中获得的表达egfp的传染性喉气管炎重组病毒的完整基因组dna；
(6)利用步骤(4)中获得的重组转移载体piltδus9-ndv-f与步骤(5)中获得的表达egfp传染性喉气管炎重组病毒的完整基因组dna共转染lmh细胞，通过蚀斑纯化法获得表达ndv-f的传染性喉气管炎重组病毒株；
步骤(1)、(4)所述左同源臂us9l，其核苷酸序列如seqidno:5所示；右同源臂us9r，其核苷酸序列如seqidno:6所示。
优选地，步骤(1)、(4)所述左同源臂us9l与右同源臂us9r序列通过pcr扩增获得，扩增模板为鸡传染性喉气管炎病毒ck/ch/lhlj/120305株基因组，引物设计所参考的序列genbank登陆号为nc_006623.1，
所述左同源臂us9l扩增引物为：
上游引物us9l-f：5’-cgcggatcccagtaataataaccacac-3’，
下游引物us9l-r：5’-cggggtaccctgtcctccgtccactct-3’；
所述右同源臂us9r扩增引物为：
上游引物us9r-f：5’-aaactgcagggctacacaacagcaata-3’，
下游引物us9r-r：5’-cgcggatccgaccaactaatagctatc-3’；
优选地，步骤(1)egfp表达盒的重组转移载体的构建中，所述右同源臂us9r是经psti、bamhi双酶切后插入到经psti、bamhi双酶切puc18载体大片段中，获得pilt△us9-r载体，左同源臂us9l是经bamhi与kpni双酶切，插入到经bamhi与kpni双酶切的pilt△us9-r载体大片段中，获得的中间载体pilt△us9经bamhi单酶切后用进行平端化，所述egfp表达盒从pegfp-n1载体上经asei和aflii酶切后进行平端化，然后将平端化的egfp表达盒插入到平端化处理的pilt△us9中，获得重组转移载体piltδus9-egfp。
优选地，所述平端化是利用klenow酶实现的。
优选地，步骤(4)所述新城疫病毒f蛋白基因pcr扩增所用的上、下游引物5’端分别引入xhoi和noti酶切位点扩增ndv-f基因；将步骤(1)中所述重组转移载体piltδus9-egfp用限制性内切酶noti和xhoi双酶切反应切除egfp基因，回收连有puc18元件的大片段做为载体，将经noti和xhoi双酶切的ndv-f基因与该载体大片段连接获得重组转移载体piltδus9-ndv-f。
优选地，所述扩增新城疫病毒f蛋白基因的引物序列为ndv-f-f，5’catctcgagatgggctccaaaccttct-3’，ndv-f-r，5’-aatgcggccgctcatgctcttgcagtggc-3’。
本发明还提供了上述重组病毒株在制备预防鸡病毒性传染病疫苗中的应用，所述鸡病毒性传染病疫苗包括传染性喉气管炎病毒疫苗、传染性喉气管炎和鸡传染性支气管炎二价疫苗或传染性喉气管炎和鸡新城疫的二价疫苗；
当所述重组病毒株用于制备预防传染性喉气管炎和鸡传染性支气管炎的二价疫苗时，是指将重组病毒株制备过程中表达增强型绿色荧光蛋白egfp基因的中间重组病毒riltδus9-egfp基因表达盒中的egfp基因替换为鸡传染性支气管炎s1基因或n基因；当所述重组病毒株用于制备预防传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒的二价疫苗时，是将重组病毒株制备过程中表达增强型绿色荧光蛋白egfp基因的中间重组病毒riltδus9-egfp基因表达盒中的egfp基因替换为新城疫病毒hn基因；
所述s1基因核苷酸序列如seqinno.9所示，n基因核苷酸序列如seqinno.10所示，hn基因核苷酸序列如seqinno.11所示。
优选地，本发明所述重组病毒株直接用于或灭活后用于制备预防鸡病毒性传染病疫苗。
有益效果
新城疫是由新城疫病毒引起的禽类烈性传染病，由于其宿主涉及至少250种禽类以上，虽然在某些禽类并不产生临床症状，但是可以在这些禽类体内繁殖传播，成为病毒的天然宿主，因此对该病的防控和净化显得异常艰难。另一方面ndv毒株尽管只有一种血清型，但通过遗传进化分析发现ndv毒株分为两类16个基因型，多基因型毒株的普遍存在和流行加速了病毒的进化，尤其是新城疫活病毒疫苗株在禽群中的广泛应用也在一定程度上推进了这类rna病毒的重组和进化，因而更加难以消灭该病。亚单位疫苗或新型重组基因工程疫苗则能克服传统弱毒活疫苗潜在的缺点，可以预见在疫病防控和净化中能够起到重要的作用。
ndv具有两个主要抗原糖蛋白f和hn，f蛋白不仅是ndv的主要免疫保护抗原，而且与ndv基因型分类具有紧密的关系。因此，本发明以f蛋白作为免疫原进行新型亚单位疫苗或重组基因工程疫苗具有重要的实际应用价值。
传染性喉气管炎是由传染性喉气管炎病毒引起一种鸡急性上呼吸道病毒性传染病，传染性喉气管炎病毒只有一个血清型，免疫接种是防治该病的最有效手段。目前国内外预防传染性喉气管炎使用较广泛的是弱毒疫苗，此类疫苗具有免疫效果好、免疫保护力产生快的特点，给鸡群进行免疫接种能有效预防该病。表达新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎重组病毒是一种预防传染性喉气管炎和鸡新城疫的二价疫苗的候选毒株，因此该毒株可以作为二价疫苗对预防传染性喉气管炎病毒及新城疫有重要的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明重组传染性喉气管炎病毒株基因组us9缺失区域插入的cmv启动子、增强型绿色荧光蛋白(egfp)基因和polya终止子序列的egfp表达盒(seqidno:7所示)示意图，虚下划线为引入的酶切位点酶切后的残基，虚下划线前阴影部分为病毒基因组us9l，虚下划线后阴影部分为病毒基因组us9r，双实下划线为cmv启动子序列，波浪下划线为egfp基因序列，斜体为polya终止子序列，加黑序列为表达盒内酶切位点，按顺序为xhoi和noti，用于引入外源基因，阴影部分加黑为引物序列。
图2为本发明重组传染性喉气管炎病毒株基因组us9缺失区域插入的cmv启动子、新城疫病毒f蛋白(ndv-f)基因和polya终止子序列(seqidno:2所示)示意图，其中，虚下划线为引入的酶切位点酶切后的残基，虚下划线前阴影部分为病毒基因组us9l，虚下划线后阴影部分为病毒基因组us9r，双实下划线为cmv启动子序列，波浪下划线为ndv-f基因序列，斜体为polya终止子序列，加黑序列为表达盒内酶切位点，按顺序为xhoi和noti，用于引入外源基因，阴影部分加黑为引物序列。
图3为重组转移载体piltδus9-egfp的载体图谱。
图4为重组转移载体piltδus9-ndv-f的载体图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种表达新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎病毒重组疫苗株及其构建方法和应用。具体地，本发明利用重组克隆技术，将包含新城疫病毒f基因ndv-f和cmv启动子序列的ndv-f表达盒替换传染性喉气管炎病毒的us9基因，构建获得缺失us9基因并在其相应位置插入cmv-ndv-f表达盒的重组新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎病毒，该重组病毒能够稳定表达新城疫病毒f蛋白基因。本发明的一种传染性喉气管炎病毒重组疫苗株，命名为riltv△us9-ndv-f，微生物保藏号是：cgmccno.14738。本发明还涉及构建稳定表达其他鸡病原外源基因的重组传染性喉气管炎病毒疫苗株的方法，以及重组传染性喉气管炎病毒疫苗株在制备预防传染性喉气管炎和其他鸡传染病的疫苗中的应用。
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
本发明中所述表达盒：是指含有启动子，目的基因和终止子的基因序列的组合。
本发明所用的内切酶购买自neb公司，pcr扩增、鉴定用基因组基因组提取方法按axygen(康宁)axyprep体液病毒dna/rna小量提取试剂盒操作，所述胶回收所用试剂盒购自omegabio-tek公司，按说明书操作，本发明所述puc18、pegfp-n1载体、其他试剂或酶等如无特殊说明，均可通过商业化购买获得。
本发明所用的培养基dmem购自sigma，用去离子水按说明书配制成标准溶液。使用时添加购自sigma公司的胎牛血清(fbs)，2％dmem是指在dmem中添加了体积比为2％的fbs，10％dmem是指在dmem中添加了体积比为10％的fbs；蚀斑筛选时在dmem中添加了低熔点琼脂糖，含1％低熔点琼脂糖的dmem是指在每100mldmem中添加了1克低熔点琼脂糖。
本发明所述iltv病毒ck/ch/lhlj/120305株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，实验室名称命名为：鸡传染性喉气管炎病毒，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其微生物保藏号是：cgmccno.15482，保藏日期为2018年03月01日。
实施例1.表达新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株的构建方法。
(1)表达egfp蛋白的重组转移载体的构建：
以iltv病毒基因组为引物设计的参考序列，genbank登陆号为nc_006623.1，应用oligo6.0软件设计2对引物，用于扩增us9基因序列侧翼序列us9l、us9r。引物序列如下：
us9r-f：5’-aaactgcagggctacacaacagcaata-3’(划线部分为psti酶切位点)
us9r-r：5’-cgcggatccgaccaactaatagctatc-3’(划线部分为bamhi酶切位点)
us9l-f：5’-cgcggatcccagtaataataaccacac-3’(划线部分为bamhi酶切位点)
us9l-r：5’-cggggtaccctgtcctccgtccactct-3’(划线部分为kpni酶切位点)
以iltv病毒ck/ch/lhlj/120305株基因组为扩增模板，pcr反应体系：dntp，4μl；10xextaqbuffer，5μl；模板，4μl；上游引物、下游引物各2μl；extaqdna聚合酶，0.5μl；h2o，upto50μl。
pcr反应条件：95℃预变性5min；94℃1min；50℃1min；72℃2min，pcr30个循环72℃2min。
首先应用引物us9r-f和us9r-r扩增us9基因右同源臂us9r，扩增产物回收纯化后经psti和bamhi双酶切，将puc18载体经psti、bamhi双酶切，回收大片段，与上述us9r双酶切产物连接，获得中间载体pilt△us9-r载体；用引物us9l-f和us9l-r扩增us9基因左同源臂us9l，扩增产物回收纯化后经kpni和bamhi双酶切，将中间载体pilt△us9-r载体经bamhi与kpni双酶切，回收大片段，与上述us9l双酶切产物相连，获得的中间载体pilt△us9经bamhi单酶切后经klenowfragmen平端化；
将pegfp-n1载体经asei和aflii酶切切去载体复制等元件部分，获得的egfp表达盒，所述表达盒由cmv启动子、增强型绿色荧光蛋白egfp基因以及polya终止子组成，用klenowfragment平端化；具体地，带有cmv启动子的egfp表达盒是将pegfp-n1载体先用限制性内切酶asei酶切，回收线性化片段，再用限制性内切酶aflii将egfp表达盒切下，然后用klenowfragment平端化处理，将平端化的egfp表达盒插入到上述平端化处理的中间载体pilt△us9中，构建获得重组转移载体piltδus9-egfp，该载体中egfp表达盒上下游分别连有左同源臂us9l与右同源臂us9r；载体图谱如图3所示，所述egfp表达盒的核苷酸序列如seqidno:7所示，其中egfp核苷酸序列如seqidno:8所示，cmv启动子核苷酸序列如seqidno:4所示；
上述双酶切体系分别为：
1.us9基因左右同源臂的双酶切体系：
dna模板，1μg；10xcutsmartbuffer，5μl；pstiorkpni，1μl；bamhi，1μl；ddh2o，upto50μl；反应条件为37℃，60min。
2.pilt△us9单酶切反应体系：
pilt△us9质粒，1μg；10xcutsmartbuffer，5μl；bamhi，1μl；ddh2o，upto50μl；反应条件为37℃，60min。
3.klenowfragment平端化反应体系：
带平端化的dna模板25ng，加入随机引物2nmol，加灭菌水补至19μl混匀后于95℃保温3min，冰浴5min，加入2.5μl10xklenowfragmentbuffer、2.5μldntp和1μlklenowfragment，37℃反应3h，65℃加热5min。
4.asei单酶切体系：
pegfp-n1载体1μg；10xbuffer3.1，5μl；asei,1μl；ddh2o，upto50μl；反应条件为37℃，60min。
5.aflii单酶切体系：
pegfp-n1载体asei单酶切线性片段，1μg；10xcutsmartbuffer，5μl；aflii，1μl；ddh2o，upto50μl；反应条件为37℃，60min。
(2)传染性喉气管炎病毒基因组的提取。
将ck/ch/lhlj/120305细胞毒株以0.001个moi接种于铺满lmh单层的5ml细胞瓶中(lmh细胞的培养和传代参照《体外培养的原理与技术》操作(薛庆善，2001))，37℃吸附2h，弃掉病毒液，换2％dmem细胞维持液，待细胞病变达到80％～90％后，弃掉细胞维持液，加入细胞消化液500μl，所述消化液每2ml组成为：1860μlste；100μl质量浓度为10％sds；40μl质量浓度为20mg/ml蛋白酶k，37℃消化过夜，加入500μl酚抽提一次，加入酚氯仿各500μl抽提一次，加入500μl氯仿抽提一次；加入1/10体积naac，其摩尔浓度为3m，ph5.2，以及2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃沉淀过夜，4℃离心15min，风干后加入适量去离子水溶解病毒基因组dna，琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性，储存于-20℃备用。
(3)转染。
day1：准备细胞
预先将lmh细胞传代并铺于5ml细胞瓶中，37℃5％co2恒温培养箱培养。
day2：转染
1)于转染前3-4h更换细胞培养液。
2)转染体系：a液：18μl2mcacl2，10μgdna，其中转移载体与病毒基因组质量比为3:1，加去离子水补足体积至150μl。b液：150μl2×hepesbufferedsaline(hbs)。
3)用移液器将a液逐滴加入b液，在加a液的同时利用另一个移液器向b液中缓慢吹入空气，此过程应在1-2min之内完成。
4)将ab混合液置于室温孵育30min。
5)将混合液加入细胞培养液中。
6)将细胞置于37℃5％co2恒温培养箱培养中继续培养。
day3：更换细胞培养液并对细胞进行休克
1)更换细胞培养液。
2)用1×pbs轻洗细胞2次。
3)利用dmso对细胞进行休克。
1.用1×pbs配制15％(v/v)dmso。2.将2mldmso休克液加入轻洗后的细胞中。3.室温孵育2.5min。4.弃掉dmso加入新鲜的细胞培养液。
(4)将细胞置于37℃5％co2恒温培养箱培养中继续培养。
细胞置于37℃，5％co2恒温培养箱培养中继续培养。每天观察至出现细胞病变(cpe)，荧光显微镜下观察是否有表达绿色荧光蛋白的cpe，待cpe达到80％～90％后收获病毒，-20℃反复冻融3次，作为蚀斑纯化的种毒，储存于-70℃备用。
表达egfp重组病毒的筛选及鉴定：
1.病毒的筛选
将收获的含有重组病毒的病毒液用无血清dmem做10-1～10-4倍稀释，将生长良好的lmh细胞单层用pbs轻洗3次，加入病毒稀释液，37℃孵育2h后，吸弃病毒液，加入10％dmem培养基2ml，该10％dmem培养基中1％低熔点琼脂糖，室温放置30min培养基凝固后，移入37℃5％co2恒温箱中继续培养；待蚀斑出现后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达进行重组病毒蚀斑的筛选，待蚀斑增长至合适大小，挑取表达荧光蛋白的蚀斑于无血清dmem中，-20℃反复冻融三次后，再次接种于lmh细胞继续进行蚀斑纯化。重复以上步骤，经过3轮蚀斑纯化，获得纯净的表达egfp的传染性喉气管炎重组病毒。
2.病毒的鉴定
将上述获得纯化的重组病毒反复冻融三次，取200μl病毒液提取重组病毒基因组，方法如下：
取200μl病毒液，加入5μl质量浓度为20mg/ml的蛋白酶k和20μl质量浓度为10％sds，置于56℃水浴消化2h；酚氯仿各200μl抽提一次，加入200μl氯仿抽提一次；加入1/10体积的naac，其摩尔浓度为3m，ph5.2和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃静置15min后，4℃，离心15min收集病毒基因组，加入适量去离子水溶解后，以该重组病毒基因组为模板，利用引物us9l-f、us9r-r对重组病毒进行pcr初步鉴定，pcr产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收目的片段，将其克隆至pmd18-t载体，经筛选鉴定后阳性质粒进行测序，结果与seqidno:7所示序列一致，说明含有cmv启动子序列的egfp表达盒已插入病毒基因组中，重组病毒构建成功。
(4)表达新城疫f蛋白的转移载体的构建。
采用实施例1中所述转移载体piltδus9-egfp作为基础，应用限制性内切酶xhoi和noti双酶切切去小片段，即egfp基因，回收获得的大片段作为线性化载体备用；所述双酶切体系：piltδus9-egfp质粒，1μg；10xcutsmartbuffer，5μl；xhoi，1μl；noti，1μl；ddh2o，upto50μl；反应条件为37℃，60min，制备获得去除egfp基因的线性化载体片段。
具体地按针对本研究团队克隆的鸡新城疫ck/ch/hlj/1/06株(该毒株已记载在文献：“新城疫病毒单克隆抗体制备及部分np蛋白抗原表位鉴定分析，刘培欣，2011年，东北农业大学博士论文”中，现由中国科学院哈尔滨兽医研究所保存)病毒f基因设计引物，上游引物和下游引物插入xhoi和noti位点。利用限制性内切酶xhoi和noti消化pcr产物获得的线性dna作为目的片段，应用t4dna连接酶连接上述去除egfp基因的线性化载体片段。反应体系：线性dna，150ng；载体，50ng；10xbuffer，1μl；t4dna连接酶，1μl；ddh2o，upto10μl。反应条件：16℃振荡水浴过夜，构建获得含有f蛋白基因表达盒的重组转移载体piltδus9-ndv-f，载体图谱如图4所示。
所述ndv-f表达盒由cmv启动子、ndv-f基因以及polya终止子组成；所述ndv-f表达盒的核苷酸序列如seqidno:2所示，其中ndv-f基因序列如seqidno:3所示。
(5)表达egfp的传染性喉气管炎重组病毒的完整基因组dna的提取。
将riltvδus9-egfp毒株以0.001个moi接种于铺满lmh单层的5ml细胞瓶中(lmh细胞的培养和传代参照《体外培养的原理与技术》操作(薛庆善，2001))，37℃吸附2h，弃掉病毒液，换2％的dmem细胞维持液，待细胞病变达到80％～90％后，弃掉细胞维持液，加入细胞消化液500μl，所述消化液每2ml组成为：1860μlste；100μl质量浓度为10％sds；40μl质量浓度为20mg/ml蛋白酶k，37℃消化过夜，加入500μl酚抽提一次，加入酚氯仿各500μl抽提一次，加入500μl氯仿抽提一次；加入1/10体积naac，其摩尔浓度为3m，ph5.2，以及2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃沉淀过夜，4℃离心15min，风干后加入适量去离子水溶解病毒基因组dna，琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性，储存于-20℃备用。
(6)转染。
day1：准备细胞
预先将lmh细胞传代并铺于5ml细胞瓶中，37℃5％co2恒温培养箱培养。
day2：转染
1)于转染前3-4h更换细胞培养液。
2)转染体系：a液：18μl2mcacl2，10μgdna，其中转移载体与病毒基因组质量比为3:1，加去离子水补足体积至150μl。b液：150μl2×hepesbufferedsaline(hbs)。
3)用移液器将a液逐滴加入b液，在加a液的同时利用另一个移液器向b液中缓慢吹入空气，此过程应在1-2min之内完成。
4)将ab混合液置于室温孵育30min。
5)将混合液加入细胞培养液中。
6)将细胞置于37℃5％co2恒温培养箱培养中继续培养。
day3：更换细胞培养液并对细胞进行休克
1)更换细胞培养液。
2)用1×pbs轻洗细胞2次。
3)利用dmso对细胞进行休克：1.用1×pbs配制15％(v/v)dmso。2.将2mldmso休克液加入轻洗后的细胞中。3.室温孵育2.5min。4.弃掉dmso加入新鲜的细胞培养液。
4)将细胞置于37℃5％co2恒温培养箱培养中继续培养。
细胞置于37℃，5％co2恒温培养箱培养中继续培养。每天观察至出现细胞病变(cpe)，待cpe达到80％～90％后收获病毒，-20℃反复冻融3次，作为蚀斑纯化的种毒，储存于-70℃备用。
表达新城疫f蛋白重组病毒的筛选及鉴定：
1.病毒的筛选
将步骤(4)中获得的piltδus9-ndv-f转移载体与步骤(6)中获得的重组病毒riltvδus9-egfp的完整基因组dna共转染lmh细胞，获得的重组病毒液用无血清dmem做10-1～10-4倍稀释，将生长良好的lmh细胞单层用pbs轻洗3次，加入病毒稀释液，37℃孵育2h后，吸弃病毒液，加入dmem培养基2ml，该10％dmem培养基中含1％低熔点琼脂糖，室温放置30min培养基凝固后，移入37℃5％co2恒温箱中继续培养。待蚀斑出现后，在荧光显微镜下观察选择不表达绿色荧光蛋白的蚀斑进行筛选，待蚀斑增长至合适大小，挑取不表达荧光蛋白的蚀斑于无血清dmem中，反复冻融三次后，再次接种于lmh细胞继续进行重组病毒增殖和蚀斑纯化，针对ndv-f基因设计引物：ndvff，5’catctcgagatgggctccaaaccttct-3’，ndvf-r，5’-aatgcggccgctcatgctcttgcagtggc-3’，对纯化的重组病毒进行pcr鉴定。
2.病毒的鉴定
将纯化的重组病毒反复冻融三次，取200μl病毒液提取重组病毒基因组，方法如下：取200μl病毒液，加入5μl质量浓度为20mg/ml的蛋白酶k和20μl质量浓度为10％的sds，置于56℃水浴消化2h；酚氯仿各200μl，抽提一次，加入200μl氯仿抽提一次；加入1/10体积naac，其摩尔浓度为3m(ph5.2)和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃15min后，4℃，离心15min收集病毒基因组，加入适量去离子水溶解后，以该重组病毒基因组为模板，利用引物us9l-f、us9r-r对重组病毒进行pcr初步鉴定，pcr产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收目的片段，将其克隆至pmd18-t载体，经筛选鉴定后阳性质粒进行测序，结果与seqidno:2所示序列一致，说明含有cmv启动子序列的ndv-f表达盒已插入病毒基因组中，重组病毒构建成功。重复以上病毒纯化步骤，经过3轮蚀斑纯化，获得纯净的重组病毒。
实施例2.表达新城疫f蛋白重组病毒蛋白表达及稳定性检测。
(一)应用间接免疫荧光技术(ifa)检测新城疫f蛋白的表达。
ifa步骤：1、重组病毒低剂量接种在六孔板上长成单层的lmh细胞，接种24h后用pbs洗涤三次。同时设置亲本病毒以及lmh细胞空白对照。
2、用4％多聚甲醇进行固定，每孔约1ml，室温作用30min。用pbs洗涤三次。
3、一抗加入1：100倍稀释的阳性血清(用pbs稀释)0.5ml/孔，37℃作用1h。用pbs洗三次。
4、二抗加入1：320稀释的兔抗鸡igyfitc抗体(sigma，0.2ml/孔)，37℃作用lh。用pbs洗涤三次。
5、荧光显微镜下观察结果。通过ifa可在病变处见到绿色荧光，而亲本毒病变处以及lmh对照则观察不到典型绿色荧光。证明新城疫f蛋白基因已经表达。
(二)表达新城疫f蛋白重组病毒稳定性的测定。
1、生长稳定性(复制动力学/一步生长曲线)
将预先制备好的lmh细胞传代并铺于24孔细胞培养板中，计算细胞数量。24h后将重组病毒以0.01个moi接种于生长良好的lmh单层，37℃孵育2h，弃掉病毒液，加入2％dmem细胞维持液，置于37℃5％co2恒温培养箱培养。分别于1h、12h、24h、48h、72h、96h后收获病毒，每个时间点做5个平行重复，-20℃反复冻融三次，-20℃贮存备用。
本研究中采用蚀斑形成单位(pfu)测定病毒滴度，lmh细胞传入六孔板，待细胞长成单层，pbs洗3次后，将无血清dmem稀释的病毒液接入，10-1到10-6，每个滴度2个孔，孵育2h后，吸净病毒液，在第四日，高稀释度的孔中可见明显蚀斑。此时，在每孔胶的上面加入1ml将含1％低熔点琼脂糖凝胶和中性红(m/v,1:28000)的10％dmem培养基，待胶完全凝固后，用锡纸闭光，置于37℃5％co2培养箱继续培养24h，经中性红染色的可用肉眼观察到，计数后计算病毒滴度。
将不同时间点收获的病毒液做10-1～10-6倍稀释。将病毒原液与无血清dmem细胞培养液以1：10的比例充分混匀。吸取100μl病毒稀释液加入至装有900μl无血清dmem细胞培养液的ep管中，重复以上步骤直至病毒稀释至10-6倍，将病毒稀释液接种于预先铺满lmh单层的6孔细胞培养板中，每个稀释度2个重复，37℃孵育2h，弃掉病毒液，将含1％低熔点琼脂糖凝胶的2％dmem铺于细胞表面，置于4℃10min，待胶完全凝固后放入37℃5％co2培养箱继续培养。每个时间点收获的5个不同孔的病毒液按照以上方法进行平行测定。12h后开始观察细胞病变情况，连续观察，在第四日，高稀释度的孔中可见明显蚀斑。此时，在每孔胶的上面加入1ml将含1％低熔点琼脂糖凝胶、中性红(m；v,1:28000)的2％dmem培养基，待胶完全凝固后，用锡纸闭光，置于37℃5％co2培养箱继续培养24h，经中性红染色的可用肉眼观察到，计数后计算病毒滴度。同时对亲本病毒iltv的生长规律进行平行测定，以0.01个moi接种于生长良好的lmh单层，分别于接种后1h、12h、24h、48h、72h、96h后收获病毒，每个时间点做5个平行重复。经测定，riltv△us9-ndv-f在72h收获的重组病毒滴度最高，为105.6pfu/ml，随着感染时间的增加，病毒的复制对细胞的损伤越来越大，活细胞数目逐渐减少，导致病毒的复制由于宿主细胞的死亡而受到抑制，病毒滴度在72h达到最高后逐渐下降。亲本病毒iltv在72h收获的滴度达到最高，为105.4pfu/ml，随着感染时间的增加，其滴度逐渐下降。
2、重组病毒遗传稳定性测定
将重组病毒接种于lmh细胞连续传代。将重组毒以0.001moi接种lmh细胞，37℃，5％co2孵育2h，弃掉病毒液，加入2％dmem细胞生长维持液。显微镜下观察cpe，当cpe达到80％～90％时收获病毒。连续传代至20代，每5代进行鉴定。显微镜下观察细胞cpe，并提取病毒基因组dna进行pcr鉴定和序列测定，结果表明，重组病毒经连续传代均能保持遗传稳定性。
实施例3.稳定表达新城疫f基因的传染性喉气管炎重组病毒的应用评价。
1.试验材料
1.1riltv△us9-ndv-f株重组病毒由本研究团队构建并在lmh细胞增殖，鸡新城疫强毒北京株和传染性喉气管炎强毒株王岗株由本研究团队保存。
1.2spf试验鸡：来自中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
2.试验方法
将riltv△us9-ndv-f重组病毒分别以0.1ml点眼接种20只28日龄spf鸡，另外20只作为对照，免疫后21天分别将其中10只免疫鸡和10只对照鸡攻击新城疫强毒北京株。同时将另外10只免疫鸡和10只对照鸡攻击传染性喉气管炎强毒株王岗株，观察20天，统计发病率和死亡率。攻毒后观察期间所有免疫组和对照组鸡均在4天、8天、12天、16天和20天分别采集口咽拭子和泄殖腔拭子，每只鸡采集的拭子通过无菌过滤除菌在鸡胚增殖，新城疫病毒分离鉴定通过血凝试验鉴定，传染性喉气管炎病毒分离鉴定通过pcr扩增iltv的保守基因gb基因鉴定(引物：gb-s5’-cagtatctggcatcgcctcat-3’；gb-a:5’-cctgggaacagaacctgaact-3’)，统计攻毒后病毒在鸡体中的排毒情况。
3.试验结果
riltv△us9-ndv-f株重组病毒接种鸡后20天，免疫组鸡不仅产生了针对免疫亲本毒传染性喉气管炎病毒的免疫效力，并产生了针对新城疫的免疫保护效力，针对两种强毒攻击的免疫保护率均达到10/10，而攻击传染性喉气管炎病毒强毒株的对照组鸡则在攻毒后全部发病，其中3只在攻毒后8天内死亡；攻击新城疫病毒强毒株的对照组鸡则在攻毒后10天全部死亡，结果详见表1和表2，其中dpi为免疫后的天数。
表1riltv△us9-ndv-f株重组病毒及对照组对iltv强毒株攻击保护结果
表2iltv-f及对照组对ndv强毒株攻击保护结果
试验结果表明，本发明以重组病毒构建方法构建的传染性喉气管炎重组新城疫病毒f基因获得的重组病毒作为疫苗，免疫鸡能够产生针对新城疫病毒免疫保护力，说明本发明具有良好的应用价值。
本发明首先用包含增强型绿色荧光蛋白egfp和cmv启动子序列的egfp表达盒替换传染性喉气管炎病毒的us9基因，以egfp基因为报告基因，再用新城疫f蛋白(ndv-f)基因替换在传染性喉气管炎病毒的us9区域插入的egfp基因，以egfp基因为报告基因反向筛选，在报告基因区域插入新城疫f蛋白(ndv-f)的同时造成us9基因的完全缺失，构建获得稳定表达新城疫f蛋白的us9缺失传染性喉气管炎重组病毒。
本发明为了验证本发明作为重组模式病毒在us9相应缺失位置插入其他外源病毒免疫原基因的可能性与表达蛋白的有效性，通过本发明构建重组病毒的方法相继构建了稳定表达禽多种疫病病原免疫原基因，如传染性支气管炎病毒n基因和s1基因、新城疫病毒hn基因，并将不同重组病毒作为抗原免疫上述病原宿主动物均激发产生针对相应病原的免疫保护力，说明利用本发明获得的稳定表达其他外源病原基因的重组传染性喉气管炎病毒株和构建稳定表达其他禽类病原外源基因的重组传染性喉气管炎病毒疫苗株的方法，能够制备获得预防传染性喉气管炎和其他禽类传染病的重组疫苗，具有广泛应用价值。
为印证本发明获得的重组病毒株和构建方法在制备预防传染性喉气管炎和其它禽类传染病的重组传染性喉气管炎疫苗中的应用，通过以下实施例和实验例来进一步阐述本发明的应用，但应该理解的是，以下实施例和实验例只是举例说明的目的，并不意味着限制本发明的范围和精神。
实施例4.稳定表达鸡传染性支气管炎n基因的传染性喉气管炎重组病毒的构建及免疫效力评价。
1.稳定表达鸡传染性支气管炎n基因(下述简称ibvn基因)的重组病毒的构建:
按照本发明构建重组病毒方法，具体地针对本研究团队克隆的鸡传染性支气管炎ck/ch/ldl/091022株(该毒株已记载在文献：“禽传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备及其b细胞抗原表位的鉴定，王芳等，中国预防兽医学报，2012年4期”中，现由中国科学院哈尔滨兽医研究所保存)病毒n基因设计引物，上游引物和下游引物插入xhoi和noti位点，所述上游引物ibvn-f：
catctcgagatggcgagcggtaaagtatc；下游引物ibvn-r：
aatgcggccgctcaaagttcattttcaccaa。以转移载体piltδus9-egfp作为基础，应用限制性内切酶xhoi和noti双酶切切去小片段，即egfp基因，回收获得的大片段作为线性化载体备用，限制性内切酶购自neb公司，反应条件为37℃60min，反应体系如下：模板，1μg；10xcutsmartbuffer，5μl；xhoi，1μl；noti，1μl；ddh2o，upto50μl。利用限制性内切酶xhoi和noti消化ibvn基因pcr产物获得的线性dna作为目的片段，应用t4dna连接酶连接上述线性载体。反应体系：线性dna，150ng；载体，50ng；10xbuffer，1μl；t4dna连接酶，1μl；ddh2o，upto10μl。反应条件：16℃振荡水浴过夜。最终获得鸡传染性支气管炎n基因转移载体pilt△us9-ibvn。
依照实施例1中步骤(6)所述方法将pilt△us9-ibvn转移载体与实施例1中步骤(5)获得的重组病毒riltvδus9-egfp基因组共转染获得的重组病毒液，用无血清dmem做10-1～10-4倍稀释，将生长良好的lmh细胞单层用pbs轻洗3次，加入病毒稀释液，37℃孵育2h后，吸弃病毒液，加入10％dmem培养基，所述培养基含1％低熔点琼脂糖，室温放置30min培养基凝固后，移入37℃5％co2恒温箱中继续培养。待蚀斑出现后，在荧光显微镜下观察选择不表达绿色荧光蛋白的蚀斑进行筛选，待蚀斑增长至合适大小，挑取不表达荧光蛋白的蚀斑于无血清dmem中，反复冻融三次后，再次接种于lmh细胞继续进行重组病毒增殖和蚀斑纯化，针对ibvn-基因设计引物：ibvn-f，5’
-catctcgagatggcgagcggtaaagtatc-3’，ibvn-r，5’
-aatgcggccgctcaaagttcattttcaccaa-3’)，对纯化的重组病毒进行以pcr鉴定。
将纯化的重组病毒反复冻融三次，取200μl病毒液提取重组病毒基因组，方法如下：取200μl病毒液，加入5μl质量浓度为20mg/ml的蛋白酶k和20μl质量浓度为10％sds，置于56℃水浴消化2h；酚氯仿各200μl抽提一次，加入氯仿200μl抽提一次；加入1/10体积naac，其摩尔浓度为3m(ph5.2)和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃15min后，4℃，离心15min收集病毒基因组，加入适量去离子水溶解后，以该重组病毒基因组为模板，利用引物us9l-f、us9r-r对重组病毒进行pcr初步鉴定，pcr产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收目的片段，将其克隆至pmd18-t载体，经筛选鉴定后阳性质粒进行测序，结果与seqidno:10所示序列一致，说明含有cmv启动子序列的ibvn表达盒已插入病毒基因组中，重组病毒构建成功。重复以上病毒纯化步骤，经过3轮蚀斑纯化，获得纯净的重组病毒。
2.应用间接免疫荧光技术(ifa)检测传染性支气管炎n蛋白的表达：
ifa步骤：
(1)重组病毒低剂量接种在六孔板上长成单层的lmh细胞，接种24h后用pbs洗涤三次。同时设置亲本病毒以及lmh细胞空白对照。
(2)用4％多聚甲醇进行固定，每孔约1ml，室温作用30min。用pbs洗涤三次。
(3)一抗加入1：100倍稀释的阳性血清(用pbs稀释)0.5ml/孔，37℃作用1h。用pbs洗三次
(4)二抗加入1：320稀释的兔抗鸡igyfitc抗体(sigma，0.2ml/孔)，37℃作用lh。用pbs洗涤三次。
(5)荧光显微镜下观察结果。通过ifa可在病变处见到绿色荧光，而亲本毒病变处以及lmh对照则观察不到典型绿色荧光。证明鸡传染性支气管炎n基因已经表达。
获得稳定表达鸡传染性支气管炎n基因的传染性喉气管炎重组病毒riltv△us9-ibvn，重组病毒的筛选和纯化方法同实施例1中步骤(6)所述，依照实施例2中步骤(二)的方法对重组病毒riltv△us9-ibvn进行了生长稳定性和遗传稳定性测定，发现重组病毒riltv△us9-ibvn经连续传代均能保持遗传稳定性，并持续表达鸡传染性支气管炎病毒n蛋白。
3.重组病毒riltv△us9-ibvn接种鸡后的免疫效力评价：
(1)试验材料
riltv△us9-ibvn株重组病毒由本研究团队构建并在lmh细胞增殖，鸡传染性支气管炎抗体检测试剂盒购自idexx公司。
spf试验鸡：来自中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
(2)试验方法
将riltv△us9-ibvn株重组病毒分别以0.1ml点眼途径接种10只28日龄spf鸡，另外10只作为对照，免疫鸡和对照鸡分别采集血清测定传染性支气管炎抗体，方法按照试剂盒elisa方法进行。
(3)试验结果
riltv△us9-ibvn株重组病毒接种鸡后21天，免疫组鸡均产生了传染性支气管炎抗体，免疫鸡抗体阳性率均达到9/10，而对照组鸡则均为阴性(详见表3)。
表3riltv△us9-ibvn株重组病毒免疫鸡后血清抗体测定结果
试验结果表明，以本发明以重组病毒构建方法构建的传染性喉气管炎重组鸡传染性支气管炎病毒n基因获得的重组病毒作为疫苗免疫鸡能够产生针对传染性支气管炎病毒的抗体，说明本发明具有良好的应用价值。
实施例5.稳定表达鸡传染性支气管炎s1基因(下述简称ibvs1基因)的传染性喉气管炎重组病毒的构建及免疫效力评价。
1.稳定表达鸡传染性支气管炎s1基因的重组病毒的构建：
按照本发明构建重组病毒方法，具体地针对本研究团队克隆的鸡传染性支气管炎ck/ch/ldl/091022株(该毒株已记载在文献：“禽传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备及其b细胞抗原表位的鉴定，王芳等，中国预防兽医学报，2012年4期”中，现由中国科学院哈尔滨兽医研究所保存)病毒s1基因设计引物，上游引物和下游引物插入xhoi和noti位点，所述上游引物ibvs1-f：
catctcgagatgttggggaagtcactgtt；下游引物ibvs1-r：
aatgcggccgcgtatgtactcatctgtaaca。转移载体piltδus9-egfp作为基础。应用限制性内切酶xhoi和noti双酶切切去小片段，即egfp基因，回收获得的大片段作为线性化载体备用，限制性内切酶购自neb公司，反应条件为37℃60min，反应体系如下：模板，1μg；10xcutsmartbuffer，5μl；xhoi，1μl；noti，1μl；ddh2o，upto50μl。利用限制性内切酶xhoi和noti消化ibvs1基因pcr产物获得的线性dna作为目的片段，应用t4dna连接酶连接上述线性载体。反应体系：线性dna，150ng；载体，50ng；10xbuffer，1μl；t4dna连接酶，1μl；ddh2o，upto10μl。反应条件：16℃振荡水浴过夜。最终获得鸡传染性支气管炎n基因转移载体pilt△us9-ibvs1。
依照实施例1步骤(6)所述方法将pilt△us9-ibvs1转移载体与实施例1中步骤(5)中获得的重组病毒riltvδus9-egfp基因组共转染获得的重组病毒液，用无血清dmem做10-1～10-4倍稀释，将生长良好的lmh细胞单层用pbs轻洗3次，加入病毒稀释液，37℃孵育2h后，吸弃病毒液，加入10％dmem培养基，所述培养基含1％低熔点琼脂糖，室温放置30min培养基凝固后，移入37℃5％co2恒温箱中继续培养。待蚀斑出现后，在荧光显微镜下观察选择不表达绿色荧光蛋白的蚀斑进行筛选，待蚀斑增长至合适大小，挑取不表达荧光蛋白的蚀斑于无血清dmem中，反复冻融三次后，再次接种于lmh细胞继续进行重组病毒增殖和蚀斑纯化，针对ibvs1基因设计引物：ibvs1-f，5’
-catctcgagatgttggggaagtcactgtt-3’，ibvs1-r，5’
-aatgcggccgcttagtatgtactcatctgtaaca-3’，对纯化的重组病毒进行pcr鉴定。
将纯化的重组病毒反复冻融三次，取200μl病毒液提取重组病毒基因组，方法如下：取200μl病毒液，加入5μl质量浓度为20mg/ml的蛋白酶k和20μl质量浓度为10％sds，置于56℃水浴消化2h；酚氯仿各200μl抽提一次，加入200μl氯仿抽提一次；加入1/10体积naac，其摩尔浓度为3m(ph5.2)和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃15min后，4℃，离心15min收集病毒基因组，加入适量去离子水溶解后，以该重组病毒基因组为模板，利用引物us9l-f、us9r-r对重组病毒进行pcr初步鉴定，pcr产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收目的片段，将其克隆至pmd18-t载体，经筛选鉴定后阳性质粒进行测序，结果与seqidno:9所示序列一致，说明含有cmv启动子序列的ibvs1表达盒已插入病毒基因组中，重组病毒构建成功。
重复以上病毒纯化步骤，经过3轮蚀斑纯化，获得纯净的重组病毒。
2.应用间接免疫荧光技术(ifa)检测传染性支气管炎s1蛋白的表达：
ifa步骤：
(1)重组病毒低剂量接种在六孔板上长成单层的lmh细胞，接种24h后用pbs洗涤三次。同时设置亲本病毒以及lmh细胞空白对照。
(2)用4％多聚甲醇进行固定，每孔约1ml，室温作用30min。用pbs洗涤三次。
(3)一抗加入1：100倍稀释的阳性血清(用pbs稀释)0.5ml/孔，37℃作用1h。用pbs洗三次。
(4)二抗加入1：320稀释的兔抗鸡igyfitc抗体(sigma，0.2ml/孔)，37℃作用lh。用pbs洗涤三次。
(5)荧光显微镜下观察结果。通过ifa可在病变处见到绿色荧光，而亲本毒病变处以及lmh对照则观察不到典型绿色荧光。证明鸡传染性支气管炎s1基因已经表达。
获得稳定表达鸡传染性支气管炎s1基因的传染性喉气管炎重组病毒riltv△us9-ibvs1，重组病毒的筛选和纯化方法同实施例1中步骤(6)所述，依照实施例2中步骤(二)的方法对重组病毒riltv△us9-ibvs1进行了生长稳定性和遗传稳定性测定，发现重组病毒riltv△us9-ibvs1经连续传代均能保持遗传稳定性，并持续表达鸡传染性支气管炎病毒s1蛋白。
3.重组病毒riltv△us9-ibvs1接种鸡后的免疫效力评价:
(1)试验材料
riltv△us9-ibvs1株重组病毒由本研究团队构建并在lmh细胞增殖，鸡传染性支气管炎抗体检测试剂盒购自idexx公司。
spf试验鸡：来自中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
(2)试验方法
将riltv△us9-ibvs1株重组病毒分别以0.1ml点眼途径接种10只28日龄spf鸡，另外10只作为对照，免疫鸡和对照鸡分别采集血清测定传染性支气管炎抗体，方法按照试剂盒elisa方法进行。
(3)试验结果
riltv△us9-ibvs1株重组病毒接种鸡后21天，免疫组鸡均产生了传染性支气管炎抗体，免疫鸡抗体阳性率均达到10/10，而对照组鸡则均为阴性(详见表4)。
表4riltv△us9-ibvs1株重组病毒免疫鸡后血清抗体测定结果
试验结果表明，本发明以重组病毒构建方法构建的传染性喉气管炎重组鸡传染性支气管炎病毒s1基因获得的重组病毒作为疫苗免疫鸡能够产生针对传染性支气管炎病毒的抗体，说明本发明具有良好的应用价值。
实施例6.稳定表达新城疫hn基因的传染性喉气管炎重组病毒的构建及其免疫效力评价。
1.稳定表达新城疫hn基因的重组病毒的构建：
按照本发明构建重组病毒方法，具体地按针对本研究团队克隆的鸡新城疫ck/ch/hlj/1/06株(该毒株已记载在文献：“新城疫病毒单克隆抗体制备及部分np蛋白抗原表位鉴定分析，刘培欣，2011年，东北农业大学博士论文”中，现由中国科学院哈尔滨兽医研究所保存)病毒hn基因设计引物，上游引物和下游引物插入xhoi和noti位点，所述上游引物ndvhn-f：5’
catctcgagatggaccgcgcggttaacag3’；下游引物ndvhn-r：5’
aatgcggccgcttaaactctatcatccttg3’。转移载体piltδus9-egfp作为基础。应用限制性内切酶xhoi和noti双酶切切去小片段，即egfp基因，回收获得的大片段作为线性化载体备用，限制性内切酶购自neb公司，反应条件为37℃60min，反应体系如下：模板，1μg；10xcutsmartbuffer，5μl；xhoi，1μl；noti，1μl；ddh2o，upto50μl。利用限制性内切酶xhoi和noti消化ndvhn基因pcr产物获得的线性dna作为目的片段，应用t4dna连接酶连接上述线性载体。反应体系：线性dna，150ng；载体，50ng；10xbuffer，1μl；t4dna连接酶，1μl；ddh2o，upto10μl。反应条件：16℃振荡水浴过夜。最终获得新城疫hn基因转移载体pilt△us9-ndvhn。
依照实施例1中步骤(6)所述方法将pilt△us9-ndvhn转移载体与实施例1中步骤(5)获得的重组病毒riltvδus9-egfp基因组共转染获得的重组病毒液，用无血清dmem做10-1～10-4倍稀释，将生长良好的lmh细胞单层用pbs轻洗3次，加入病毒稀释液，37℃孵育2h后，吸弃病毒液，加入10％dmem培养基，所述培养基含1％低熔点琼脂糖，室温放置30min培养基凝固后，移入37℃5％co2恒温箱中继续培养。待蚀斑出现后，在荧光显微镜下观察选择不表达绿色荧光蛋白的蚀斑进行筛选，待蚀斑增长至合适大小，挑取不表达荧光蛋白的蚀斑于无血清dmem中，反复冻融三次后，再次接种于lmh细胞继续进行重组病毒增殖和蚀斑纯化，针对ndvhn基因设计引物：5’
-catctcgagatggaccgcgcggttaacag-3’，ndvhn-r，5’
-aatgcggccgcttaaactctatcatccttg-3’，对纯化的重组病毒进行以pcr鉴定。
将纯化的重组病毒反复冻融三次，取200μl病毒液提取重组病毒基因组，方法如下：取200μl病毒液，加入5μl质量浓度为20mg/ml蛋白酶k和20μl质量浓度为10％sds，置于56℃水浴消化2h；酚氯仿各200μl抽提一次，加入200μl氯仿抽提一次；加入1/10体积naac，其摩尔浓度为3m(ph5.2)和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃15min后，4℃，离心15min收集病毒基因组，加入适量去离子水溶解后，以该重组病毒基因组为模板，利用引物us9l-f、us9r-r对重组病毒进行pcr初步鉴定，pcr产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收目的片段，将其克隆至pmd18-t载体，经筛选鉴定后阳性质粒进行测序，结果与seqidno:11所示序列一致，说明含有cmv启动子序列的ndvhn表达盒已插入病毒基因组中，重组病毒构建成功。重复以上病毒纯化步骤，经过3轮蚀斑纯化，获得纯净的重组病毒。
2.应用间接免疫荧光技术(ifa)检测新城疫hn蛋白的表达：
ifa步骤：
(1)重组病毒低剂量接种在六孔板上长成单层的lmh细胞，接种24h后用pbs洗涤三次。同时设置亲本病毒以及lmh细胞空白对照。
(2)用4％多聚甲醇进行固定，每孔约1ml，室温作用30min。用pbs洗涤三次。
(3)一抗加入1：100倍稀释的阳性血清(用pbs稀释)0.5ml/孔，37℃作用1h。用pbs洗三次。
(4)二抗加入1：320稀释的兔抗鸡igyfitc抗体(sigma，0.2ml/孔)，37℃作用lh。用pbs洗涤三次。
(5)荧光显微镜下观察结果。通过ifa可在病变处见到绿色荧光，而亲本毒病变处以及lmh对照则观察不到典型绿色荧光。证明新城疫hn蛋白基因已经表达。
获得稳定表达新城疫hn基因的传染性喉气管炎重组病毒riltv△us9-ndvhn，重组病毒的筛选和纯化方法同实施例1中步骤(6)所述，依照实施例2中步骤(二)的方法对重组病毒riltv△us9-ndvhn进行了生长稳定性和遗传稳定性测定，发现重组病毒riltv△us9-ndvhn经连续传代均能保持遗传稳定性，并持续表达鸡新城疫病毒hn蛋白。
3.重组病毒riltv△us9-ndvhn接种鸡后的免疫效力评价
(1)试验材料
riltv△us9-ndvhn株重组病毒由本研究团队构建并在lmh细胞增殖，鸡新城疫强毒北京株由本研究团队保存。
spf试验鸡：来自中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
(2)试验方法
将riltv△us9-ndvhn株重组病毒分别以0.1ml点眼途径接种10只28日龄spf鸡，另外10只作为对照，免疫后21天分别将免疫鸡和对照鸡攻击新城疫强毒北京株观察14天，统计发病和死亡情况。
(3)试验结果
riltv△us9-ndvhn株重组病毒接种鸡后21天，免疫组鸡均产生了针对新城疫的抗体，强毒攻击保护率达到9/10，而对照组鸡则在攻毒后10天全部死亡(详见表5)。
表5riltv△us9-ndvhn株重组病毒免疫鸡后血清抗体值和保护力测定结果
试验结果表明，以本发明以重组病毒构建方法构建的传染性喉气管炎重组鸡新城疫病毒hn基因获得的重组病毒作为疫苗免疫鸡能够产生针对新城疫病毒的抗体并产生显著保护效力，说明本发明具有良好的应用价值。
以上所述仅为本发明的优选实例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
sequencelisting
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120>一种表达新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株及其构建方法和应用
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