本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种中华沙鳅黑黄条纹皮肤rna的提取方法。
背景技术：
中华沙鳅是中国特有的名贵鱼类，食用观赏均可，具有很大的发展前景。作为观赏方面，对中华沙鳅条纹的研究还很少，主要原因之一是鱼的皮肤组织样采集不便，rna的提取困难。由于其皮肤与肌肉组织连接，加之韧性足磨样困难，严重影响从中华沙鳅上提取高质量皮肤rna。常规采样磨样方法在中华沙鳅皮肤rna提取上并不完全适用。特别是在要分别提取黑条纹皮肤和黄条纹皮肤的实验中，常规采样方法由于耗时很容易造成皮肤rna降解和磨样不充分提取不成功的情况。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种中华沙鳅黑黄条纹皮肤rna的提取方法，本发明的方法可以短时间内成功提取中华沙鳅黑黄条纹皮肤高质量rna并且成功应用于高通量转录组测序。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种中华沙鳅黑黄条纹皮肤rna的提取方法，包括以下步骤：设备预处理，剥皮处理、提取步骤，质量检测。
进一步地，步骤1中的设备预处理具体为：提取前将要用到的解剖工具如解刨剪、解剖刀、镊子等和药匙、研钵用锡箔纸包裹后放入高压灭菌锅灭菌，并进行干燥和预冷。
进一步地，步骤2中的剥皮处理具体为：
步骤2.1、操作人员需带口罩和一次性无粉手套，用酒精喷壶喷雾手套并拭干，使用中适时更换新手套；
步骤2.2、鱼皮剥离：由于中华沙鳅是无鳞鱼，取皮肤无需去鳞片；先用40mg/lms-222溶液对鱼进行麻醉并断颈，再用解剖剪剪掉胸鳍，方便剥皮操作；沿腹中线破开鱼肚，沿鳃盖边缘剪掉鱼头，再用解剖刀从颈部剥离出鱼皮，用镊子夹住鱼皮，配合解剖刀缓缓将完整鱼皮剥出，剔除鱼皮上附着的少量肌肉组织，并迅速将完整鱼皮平铺在锡箔纸上，并用液氮冻住；
步骤2.3、条纹样品采集：由于鱼皮柔软有韧性，想要直接分离黑黄条纹并不容易，所以采用液氮将鱼皮在锡箔纸上冻住，再用解剖刀顺着黑黄条纹的纹理直接进行切割；在液氮冷冻的情况下操作，既能快速的分割开鱼皮黑黄条纹，也能保证其rna不降解。随后将条纹皮肤装入2ml冻存管，放入液氮。
进一步地，步骤3中的提取步骤具体为：将中华沙鳅条纹皮肤在完全预冷并装有液氮的研钵中迅速研磨，此时边研磨，边用解剖剪将皮肤组织剪碎，越小块越细越好，再继续研磨直至其呈粉末状；用液氮预冷的药匙取60-80mg皮肤组织粉末加入已盛有1ml的trizol液的ep管中，充分振荡混合均匀，放入12000g，4℃离心5min，将上清液转移到新的离心管；在上一步离心管中加入1/5体积氯仿chcl3,15s涡旋混匀，静置5min后，12000g，4℃离心15min；将上清液转移到新的离心管；重复上一步骤一次，前一次作用为萃取，后一步为洗脱，提高rna纯度；转入新的离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置10min，12000g，4℃，离心10min；弃上清液，沉淀中加入1ml冰乙醇，12000g，4℃，离心5min；弃上清液，干燥沉淀，溶于适量depc水中。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明基于样本前期处理和rna提取试剂变相利用，开发了一种针对鱼类皮肤rna的提取方法。该方法耗时短，操作简便，成本低，稳定性好，能解决以往鱼类皮肤组织rna提取难，质量低，产量低等问题。
2)该方法提取的中华沙鳅皮肤rna产量高：浓度在300-2000ug/ul；质量高：a260/a280值大于1.8；通过后续实验证明所提rna适合荧光定量pcr和转录组测序。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明鱼皮剥离及条纹样品采集的过程图；其中，a代表实验所用中华沙鳅；b代表从鳃盖部开始剥取皮肤；c代表从沙鳅颈背部着力，剥取整块皮肤；d代表剥取整块皮肤后铺平，用液氮固定；e代表在液氮固定的皮肤上用解剖刀割取所需皮肤部分。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1中华沙鳅黑黄条纹皮肤rna的提取方法的建立
步骤1、设备提前处理：提取前将要用到的解剖工具如解刨剪、解剖刀、镊子等和药匙、研钵用锡箔纸包裹后放入高压灭菌锅灭菌，并进行干燥和预冷；
步骤2、剥皮处理：
步骤2.1、操作人员需带口罩和一次性无粉手套，用酒精喷壶喷雾手套并拭干，使用中适时更换新手套；
步骤2.2、鱼皮剥离：如图1所示，由于中华沙鳅是无鳞鱼，取皮肤无需去鳞片(图1a)；先用40mg/lms-222溶液对鱼进行麻醉并断颈，再用解剖剪剪掉胸鳍，方便剥皮操作；沿腹中线破开鱼肚，沿鳃盖边缘剪掉鱼头，再用解剖刀从颈部剥离出鱼皮(图1b和图1c)，用镊子夹住鱼皮，配合解剖刀缓缓将完整鱼皮剥出，剔除鱼皮上附着的少量肌肉组织，并迅速将完整鱼皮平铺在锡箔纸上，并用液氮冻住(图1d)。
步骤2.3、条纹样品采集：由于鱼皮柔软有韧性，想要直接分离黑黄条纹并不容易，所以采用液氮将鱼皮在锡箔纸上冻住，再用解剖刀顺着黑黄条纹的纹理直接进行切割(图1e)；在液氮冷冻的情况下操作，既能快速的分割开鱼皮黑黄条纹，也能保证其rna不降解。随后将条纹皮肤装入2ml冻存管，放入液氮。
步骤3、提取步骤：将中华沙鳅条纹皮肤在完全预冷并装有液氮的研钵中迅速研磨(由于皮肤组织硬度大，有韧性，磨样难度较大)，此时边研磨，边用解剖剪将皮肤组织剪碎，越小块越细越好，再继续研磨直至其呈粉末状；
用液氮预冷的药匙取60-80mg皮肤组织粉末加入已盛有1ml的trizol液的ep管中，充分振荡混合均匀，放入12000g，4℃离心5min，将上清液转移到新的离心管；在上一步离心管中加入1/5体积(200ul)氯仿chcl3,15s涡旋混匀，静置5min后，12000g，4℃离心15min；将上清液转移到新的离心管；重复上一步骤一次，前一次作用为萃取，后一步为洗脱，提高rna纯度；转入新的离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置10min，12000g，4℃，离心10min；弃上清液，沉淀中加入1ml冰乙醇(清洗作用)，12000g，4℃，离心5min；弃上清液，干燥沉淀，溶于适量depc水中。
在研磨过程要保证研钵里一直有液氮，使材料不降解，并尽可能用解剖剪将皮肤剪成细小颗粒再磨至粉末，将粉末和未磨碎的皮肤组织都转移到trizol液中，离心后弃掉下层杂质。
步骤4、质量检测：
利用核酸蛋白仪nanodrop2000进行检测(原理为分光光度计测量)
步骤4.1、先吸取100&mu；l的depc水，放入仪器中，点blank键，调整标准零值。
步骤4.2、擦净测量器后，吸取1ul样品，点在测量器上，点measure键进行测量，遂得浓度结果。
通过实验，用此方法制备的中华沙鳅黑黄皮肤rna浓度质量高，有效减少常规取样方法造成的肌肉皮肤难以分离、磨样耗时费力、rna不纯，受较高肌肉蛋白含量的影响的问题。常规方法采样困难，想要取干净完整皮肤样难度很大，特别是在无鳞鱼上，皮肤薄，韧性强，肌肉皮肤紧紧相连难以分割，导致很难取得所需样品进行实验。
上述提取方法，器具简单，最重要的是鱼皮肤剥取的手法以及液氮固定的时机掌握，经过多次实验，发现从鱼腹部开刀，沿鳃盖剪至颈部，才能保持躯干条纹完整性，再从颈部顺势往尾部撕取皮肤，方能保证整张皮肤被完整剥离下。剥离先先剪去胸鳍背鳍，以免剥取过程中阻隔，撕破皮肤。
对于液氮固定皮肤的时间，时间少则皮肤仍松弛，解剖刀割取不便，rna会降解，时间长则冷冻太硬，割不破，影响实验进程，将皮肤平铺好后，浇液氮冷冻30-50秒最好。
实施例2中华沙鳅黑黄条纹皮肤rna的提取方法的应用例
在长薄鳅皮肤样本的采集实验中，采用实施例1所述的方法，长薄鳅个体较大，皮肤比中华沙鳅粗糙，用以往的方法很容易将所需的斑点皮肤割破，用此方法将皮肤基本完整取下后，用液氮固定，再直接用解剖刀割取斑点黑纹与相邻黄纹，提取rna后用于测序，均符合建库要求，如表1所示。
表1提取rna后用于测序的建库指标
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。