hsa-miR-130a在非小细胞肺癌预后中的用途的制作方法

本发明涉及临床医学，具体涉及hsa-mir-130a在非小细胞肺癌预后中的用途。

背景技术

肺癌占据着世界范围内包括中国的肿瘤发病第一位。肺癌按病理分类分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌（nsclc)占全部肺癌的85%左右。近十年来，肺癌的诊断以及治疗有了划时代的发展，除了经典的三大治疗如手术、放疗、化疗，从egfr、alk基因重排等等方面肺癌的治疗进入了新的靶向时代，吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、克唑替尼、迈瑞替尼（azd9291）等等药物的发展使得肺癌的生存率已经有了很大的提高，然而对于中晚期肺癌来说，5年的生存率仍不容乐观。目前诊断为ⅲb或iv期的肺癌患者，最主要的治疗手段仍然是放化疗，当然新的分子靶向治疗也已经进入一线治疗。然而化疗的效果仍然是差强人意，肺癌晚期患者无进展生存时间（pfs)仅为3-5个月，os大约在8-10个月。目前肿瘤的医疗已进入精准治疗的时代，有明确驱动基因检测，并接受相应的分子靶向治疗使得肺癌晚期患者的缓解率高达72%左右，肺癌患者患者5年的生存率希望大幅度提高，但是目前也有研究证实，肺癌egfr-tki的治疗往往在治疗11月左右时候出现耐药，因此为改善肺癌患者的生存时间和生活质量，在基因蛋白组学、表观遗传学开展的如火如荼的时候，从基因角度去寻找潜在的肺癌发病机制和合适的治疗靶点对于肺癌的诊治具有至关重要的意义。

目前有大量关于mirnas的研究，提示mirnas是一种新型肿瘤标记物可能。mirnas也有癌基因和抑癌基因功能，目前认为mirnas和肿瘤的发生发展有着密切的关系，因此深入研究mirnas和肺癌发病机制的关系，有可能为肺癌的诊治提供新靶点。mir-130a是近年来发现的一个mirna分子，研究发现，mir-130a能够影响mapk、ar信号通路活性，抑制前列腺癌的增殖、侵袭转移，发挥着抑癌基因的功能。更多的研究显示，mir-130a也能够抑制乳腺癌、肝癌细胞的增殖、侵袭转移。

mirna－130a位于染色体11q12，靠近与癌症相关的11q13区域［6］，wangxc等率先以定量逆转录多聚酶链反应(qrt－pcr)技术检测了200例非小细胞肺癌患者癌组织和癌旁组织中mir－130a表达水平，结果发现癌组织mir－130a表达水平较癌旁组织显著升高。

本发明通过基因芯片筛选出肺癌细胞及对照组上差异表达的mirna分子，选出mir-130a后检测其在人肺癌组织中的表达并分析其与肺癌临床病理特征之间的关系；并研究mir-130a在肺癌中的生物学功能和发病机制。

传统的筛检方法，如气管镜，细针抽吸细胞学和影像学方法，如增强计算机断层扫描(ct)、磁共振成像(mri)为侵入性的、并发症高或典型指征不足，因此难以成为非小细胞肺癌患者早期筛选的有效方法。因此，迫切需要寻找早期诊断和预后评估的非侵入性精准的生物标志物，用于非小细胞肺癌患者的诊断和治疗。

技术实现要素：

本发明的目的提供一种在于筛选非小细胞肺癌预后分子标志物，指导临床的个体化治疗，是hsa-mir-130a在非小细胞肺癌预后中的用途。

本发明的目的是通过以下方式实现：

通过一种或多种特异地检测受试者样本中hsa-mir-130a表达水平的引物和/或探针在制备用于非小细胞肺癌预后的试剂中的用途。

作为优选方案，其中hsa-mir-130a的成熟rna的核苷酸序列5’-caguggaauguuauaugagcau-3’。

作为优选方案，其中所述非小细胞肺癌是原发性肺癌。

作为优选方案，其中所述受试者样本是是癌组织样本，优选非小细胞肺癌组织样本。

作为优选方案，其中所述非小细胞肺癌组织样本是通过活检的方式获得的，或者通过外科切除的方式获得的。

作为优选方案，其中所述受试者是哺乳动物。

作为优选方案，其中所述哺乳动物是人。

作为优选方案，其中hsa-mir-130a表达水平提高指示鳞癌组织的表达低于腺癌，提示在非小细胞肺癌预后指导方面有良好的作用。

作为优选方案，其中所述预后是指受试者未经治疗的生存预后。

作为优选方案，其包含用于特异地检测受试者样本中hsa-mir-130a表达水平的引物和/或探针。

本发明至少包括以下有益效果：所筛选出的与非小细胞肺癌预后相关的mirna可作为非小细胞肺癌预后的无创标志物，为其临床应用提供了重要的理论基础。所筛选出的与非小细胞肺癌预后相关的mirna可作为非小细胞肺癌预后的无创标志物，为其临床应用提供了重要的理论基础。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为mirna芯片扫描示意图；

图2为mirna芯片检测矩阵图；

图3为mirna芯片显示在肺癌细胞系与正常支气管上皮细胞系对比图；

图4为rt-pcr检测mir-130a在正常支气管上皮细胞系/肺癌细胞系中的表达图；

图5为肺癌组织中mir-130a较对照组表达图；

图6为mirna-130a扩增曲线；

图7为mirna-130a溶解曲线；

图8为mir-130a在肺癌组织中的表达水平及临床示意图；

图9为转染a549及calu-3细胞株和nc组的mir-130a表达图；

图10为cck-8检测mir-130a对肺癌细胞系增殖能力的影响图；

图11为转染mir-130a后明显抑制a549肺癌细胞增殖能力图；

图12为转染mir-130a后显著抑制calu-3肺癌细胞增殖能力图；

图13为transwell检测肺癌细胞的侵袭转移能力图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

具体通过采用实时定量检测mir-130a在人肺癌组织中的表达，hsa-mir-130a的成熟rna的核苷酸序列5’-caguggaauguuauaugagcau-3’，采用脂质体法将mir-130amimic转染肺癌细胞株a549和calu-3，通过cck-8试验、流式细胞术、edu细胞增殖检测、transwell实验等方法观察mir-130a对肺癌细胞生长、增殖、侵袭等影响来研究其和非小细胞肺癌的相关性。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。第一部分：非小细胞肺癌相关mirna的生物信息学分析和筛选。

材料与方法

mirna及基因表达数据的获取

选择丽水市人民医院胸外科于2012年12月至2014年1月收治的行根治性或姑息性切除术的新鲜肺非小细胞肺癌组织60例，切片和he染色后经2位病理科医生根据美国nccn标准进行肺癌诊断和病理分级，其临床信息如表1-1所示。相应癌旁组织取材距离癌组织5cm以上，患者均经过病理学确诊，并经患者或其家属同意，研究方案获得了丽水市人民医院伦理委员会的批准。手术切除的肺癌组织和相应的正常癌旁组织后被立即置于液氮中，用于后续实验。

实验方法

采用trizol提取这些组织块的总rna，并进一步采用生物素标记试剂盒对总rna进行过柱纯化。然后用分光光度计或qubit荧光定量等方法定量，用琼脂糖凝胶电泳或agilent2100等方法检测其完整性。mirna芯片实验数据提取及分析，芯片通过agilent芯片扫描仪进行扫描，获得杂交图片。使用agilentfeatureextraction软件分析杂交图片并获取数据，其他数据的统计学处理釆用spss19.0软件。real-pcr反应结束后确认realtimepcr的扩增曲线和融解曲线。样本的ct值取三次重复的平均值。用δδct法对目的基因进行相对定量。目的基因的相对表达量=2-δδct，δδct=实验组（目的基因ct-内参基因ct）-对照组（目的基因ct-内参基因ct）。实验数据均以i±s表示，采用t检验分析，p<0.05有意义。

mirna芯片结果

微阵列杂交后经扫描可见样品rna点状荧光信号，说明芯片结果是mirna芯片检测矩阵图（见图1）。

实验结果显示mirnas表达谱在肺癌细胞系与正常肺上皮细胞系之间存在非常明显的差异（见图2、图3）。

图2中的x轴与y轴代表对照组数据或实验组数据。45°线之外的点，代表这个探针点在两张芯片中信号值差异foldchange值在2倍以上。

图3中红色表示上调，绿色表示下调，与正常肺上皮系相比，肺癌细胞系中hsa-mir-25、hsa-mir-222、hsa-mir-30e、hsa-mir-320e、hsa-mir-22、hsa-mir-16等24个mirna的表达水平显著上调（foldchange值大于2倍），而hsa-mir-9、hsa-mir-130a、hsa-mir-21、hsa-mir-205等19个mirna显著下调（foldchange<0.5）。

real-timepcr检测肺癌组织mirna-130a表达由于mirna家族成员间交叉情况较多，为确保实验结果的正确性，我们采用pcr的方法对芯片结果中差异表达的mirna进行验证，pcr法测定选出的mir-130a在11对肺癌组织/癌旁正常组织的表达，同时mir-130a也在肺癌细胞系和正常支气管上皮系细胞中的表达进行分析比对（实验内参采用人u6rna）。结果如下：

与正常肺上皮系相比，肺癌细胞系中hsa-mir-25、hsa-mir-222、hsa-mir-30e、hsa-mir-320e、hsa-mir-22、hsa-mir-16等24个mirna的表达水平显著上调（foldchange值大于2倍），而hsa-mir-9、hsa-mir-130a、hsa-mir-21、hsa-mir-205等19个mirna显著下调（foldchange<0.5）。

肺癌细胞系/正常支气管上皮细胞系中的mir-130a的表达为图4。rt-pcr实验结果提示：mir-130a在肺癌细胞系(a549、calu-3)中的表达呈显著下调（p<0.05）。与芯片结果基本一致（见图4）。

肺癌组织和正常肺组织中mirna-130a的表达情况

rt-pcr实验结果提示对比正常肺组织，肺癌组织中mirna-130a表达明显下调（图5）。其扩增曲线和容积曲线清晰，拐度分明，说明pcr扩增结果可信，特异性强（见图6、图7）。

mir-130a在不同组织类型的肺癌组织中的表达

为比较不同类型的肺癌组织中的mir-130a的表达，我们又取出25例小细胞肺癌的气管镜标本做荧光定量pcr检查，结果显示，同正常组织比，肺癌组织中mir-130a的表达明显降低（0.24±0.10），差异有统计学意义；在不同组织类型比较中，小细胞肺癌和非小细胞肺癌间mir-130a表达水平无明显差距（datanotshown）（p＞0.05）；非小细胞肺鳞癌组织mir-130a表达（0.68±0.13）低于肺腺癌（p＜0.05）；此外，淋巴结转移组（n1）患者的mir-130a表达（0.41±0.06）明显低于淋巴结未转移组(n0)（p＜0.05），且随着肺癌临床分期的升高，ⅲ/ⅳ期患者组织中mir-130a表达（0.52±0.14）出现明显低于ⅰ/ⅱ（p＜0.05）（见图8）。

提示在肺鳞癌的表达较腺癌低，表示预后鳞癌相较于腺癌较好。

第二部分：通过免疫印迹、定量pcr、transwell及荧光素酶报告实验等技术研究mir-130a在肺癌发生发展中的作用

病例选择和标本收集

本研究已通过丽水市人民医院医学伦理委员会的批准，每位受试者均已签署知情同意书同意使用标本及临床资料。标本同上。

进行常规的细胞株的培养和传代以及转染，按lipofectamine3000转染说明书进行mir-130amimic组（a549和calu-3细胞组）和正常肺上皮细胞对照组(normalcontrol组)的转染，trizol法提取转染mir-130amimic各组细胞的总rna，反转录cdna，荧光定量rt-pcr检测各组细胞中mir-130a的表达水平。rt-pcr法检测各组细胞株中mir-130a表达实时定量rt-pcr法检测转染mir-130a的细胞株（a549及calu-3）和nc组的表达量。从图2-1所示可见，nc组细胞株中mir-130a的表达量较低，而转染的两种肺癌细胞株中mir-130a表达量均较高，具有统计学意义（p＜0.05），提示过表达mir-130a的肺癌细胞可上调mir-130a表达（见图9）。

mir-130a对肺癌细胞增殖能力的影响

cck-8实验结果显示，过表达mir-130a后，肺癌细胞a549,calu-3的增殖能力均受到了抑制，表明mir-130a能够抑制肺癌细胞的增殖，其在肺癌组织中的低表达可能是促进肺癌发生发展的原因之一（见图10）。

edu实验结果显示：

过表达mir-130a的2组肺癌细胞的细胞增殖能力较对照组细胞显著下降。存在统计学差异（**p＜0.01）（见图11、12）。

transwell检测肺癌细胞侵袭转移能力

transwell结果显示，mir-130a表达上调后，a549细胞迁移能力明显下降，穿过小室膜的细胞数少于nc组(46.5±5.30vs74.6±4.37)，calu-3细胞迁移能力也显著降低，下室面细胞数少于nc组(34.0±6.3vs67.5±3.10)，差异有统计学意义（p＜0.05)；侵袭实验结果显示，穿过transwell小室膜的a549细胞数目（15.8±2.1vs33.5±1.50）和calu-3细胞数目（8.00±0.62vs22.8±2.47）出现明显下降，这一结果表明mir-130a能够抑制肺癌细胞的侵袭转移（见图13）。

mir-130a诱导肺癌细胞凋亡

细胞凋亡检测发现过表达mir-130a的肺癌细胞凋亡数量与对照组细胞相比明显增加。提示mir-130a可诱导肺癌细胞凋亡。

软琼脂平板克隆形成实验证实mir-130a抑制肺癌细胞的生长增殖软琼脂平板克隆形成结果发现，转染过mir-130a的肺癌细胞克隆形成率远低于对照组细胞（p均＜0.05）。这一结果说明mir-130a的过表达能够显著抑制细胞的生长增殖。

mir-130a对肺癌细胞周期的影响

流式细胞技术检测mir-130a对肺癌细胞周期的影响，结果显示，与nc组相比，mir-130amimics组的肺癌细胞出现了g1/s期阻滞，表明mir-130a表达升高后通过调控g1/s期转换来抑制肺癌细胞的生长。