本发明属于医药领域，具体涉及一种亚麻酸锌的制备及其在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
背景技术：
幽门螺杆菌(helicobacterpylori，hp)是一种革兰氏阴性菌，螺旋形、微需氧，生长条件要求苛刻。研究显示，hp感染能导致急、慢性胃炎和胃、十二指肠溃疡及淋巴增生性胃淋巴瘤等疾病,并与胃癌和肠道外的肝癌、糖尿病等发病有关。1994年，世界卫生组织将hp归为i类致癌因子，它在胃癌发生发展中起主导作用。目前，hp感染的治疗方案是三联或四联疗法，即同时服用质子泵抑制剂(奥美拉唑等)加两种抗生素(克拉霉素，阿莫西林、四环素、甲硝唑等选二种)或铋剂(枸橼酸铋钾等)加质子泵抑制剂(奥美拉唑等)再加两种抗生素(克拉霉素，阿莫西林、四环素、甲硝唑等选二种)。但随着抗生素的长期使用，hp对抗生素产生不同程度的耐药，导致三联或四联疗法的根治失败。2017世卫组织发布12种重点病原体急需新型抗生素进行治疗，其中克拉霉素耐药幽门螺旋杆菌就是其中一种。因此，寻找具有高效、安全的抗hp新药物已经成为一个非常重要和迫切的任务。
技术实现要素：
解决的技术问题：本发明提供一种亚麻酸锌的制备及其在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用，制得的亚麻酸锌对耐药性和敏感性幽门螺杆菌均有较好的抑制作用。
技术方案：一种亚麻酸锌的制备方法，步骤为：第一步，活化氯化锌：用无菌水溶解氯化锌，用反应釜将氯化锌溶液在150-170℃中反应30～60min，自然冷却至室温；第二步，活化亚麻酸：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)和亚麻酸按照摩尔比(2-4):(2-4):1溶于ems溶剂，在氮气中活化30min；第三步，络合反应：第一步活化的氯化锌和第二步活化的亚麻酸按照摩尔比1:(1.8～2)在温度70～80℃中反应2～3h，反应完毕后静置6-12h；第四步，透析过滤：用透析袋在纯水中透析12-14h，至纯水澄清透明；第五步，冷冻干燥：用真空冷冻干燥器干燥48～72h，即获得亚麻酸锌。
优选的，上述氯化锌的水溶液浓度为1mol/l。
优选的，上述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)和亚麻酸按照摩尔比为4:4:1。
优选的，上述活化的氯化锌和活化的亚麻酸的摩尔比为1:1.8。
亚麻酸锌在制备抑制幽门螺杆菌的生长药物中的应用。
亚麻酸锌在制备治疗耐药性或敏感性幽门螺杆菌感染导致的急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡药物中的应用。
有益效果：本发明成功制备亚麻酸锌，产率高；其次，本发明增添了亚麻酸锌的新用途，可以用于抑制幽门螺杆菌的生长；第三，本发明制备的亚麻酸锌可用于治疗耐药性或敏感性幽门螺杆菌感染导致的急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡等疾病，而且其作用特异性高、毒副作用小、不易产生耐药，有效缓解幽门螺杆菌耐药性问题。
附图说明
图1为亚麻酸锌傅里叶红外光谱。a为亚麻酸，b为氯化锌，c为亚麻酸锌。
图2为亚麻酸锌在小鼠体内对幽门螺杆菌的抑制作用；a.幽门螺杆菌感染小鼠构建急性胃炎动物模型和药物治疗示意图；b.各治疗组治疗后幽门螺杆菌在小鼠胃粘膜定植。
图3为亚麻酸锌对小鼠胃粘膜炎症的修复作用，其中a为正常小鼠的胃粘膜he染色图，×100；f为正常小鼠的胃粘膜tunel染色图，×100；b为感染bhk159菌株用pbs治疗的小鼠胃粘膜he染色图，×100；g为感染bhk159菌株用pbs治疗的小鼠胃粘膜tunel染色图，×100；c为感染bhk159菌株用奥美拉唑和亚麻酸锌联合治疗的小鼠胃粘膜he染色图，×100；h为感染bhk159菌株用奥美拉唑和亚麻酸锌联合治疗的小鼠胃粘膜tunel染色图，×100；d为感染bhk159菌株用奥美拉唑和阿莫西林及克拉霉素三联治疗的小鼠胃粘膜he染色图，×100；i为感染bhk159菌株用奥美拉唑和阿莫西林及克拉霉素三联治疗的小鼠胃粘膜tunel染色图，×100；e为感染bhk159菌株单独用亚麻酸锌联合治疗的小鼠胃粘膜he染色图，×100；j为感染bhk159菌株单独用亚麻酸锌联合治疗的小鼠胃粘膜tunel染色图，×100。
图4为亚麻酸锌体外对ges-1、ags细胞毒性检测。
图5为亚麻酸锌体内10倍治疗量对小鼠胃、肝、肾、脾粘膜细胞的损伤情况；其中a、c、e、g分别为正常小鼠的胃、肝、脾、肾组织的he染色，×100；b、d、f、h分别为灌服10倍亚麻酸锌治疗剂量的小鼠胃、肝、脾、肾组织的he染色，×100。
图6为亚麻酸锌10倍治疗量对小鼠体重的影响。
具体实施方式
实施例1
第一步：活化氯化锌：在反应釜中用无菌水10ml溶解氯化锌1.36g(1mol/l)，将反应釜放进烘干箱中加热160℃，反应30min，自然冷却至室温。
第二步：活化亚麻酸：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)766mg、n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)460mg和α-亚麻酸(α-lla)560mg溶于5mlems溶剂，在通氮气中搅拌混匀活化30min。
第三步：络合反应：在反应釜中加活化好的氯化锌1ml(136mg或1mm)和亚麻酸5ml(560mg或2mm)，补无菌水4ml，液体共10ml，在加热型磁力搅拌器上混匀，控制温度60℃，反应3h.反应完毕后静置冷却过夜。
第四步：透析洗涤：把络合反应液装进透析袋(rc膜，1kd，38mm)，用1l去离子水透析12h，中间换4次去离子水，把未结合的锌离子等杂质透析过滤，直至去离子水清澈透明。
第五步：冷冻干燥：把透析好的反应液装进玻璃螺口样品瓶，用真空冷冻干燥器，-45℃、0.02mbar干燥，干燥72h，即获得亚麻酸锌，产率77.2％。
实施例2
第一步：活化氯化锌：在反应釜中用无菌水10ml溶解氯化锌1.36g(1mol/l)，将反应釜放进烘干箱中加热165℃，反应30min，自然冷却。
第二步：活化亚麻酸：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)766mg、n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)460mg和α-亚麻酸(α-lla)560mg溶于5mlems溶剂，在通氮气中搅拌混匀活化30min。
第三步：络合反应：在反应釜中加活化好的氯化锌1ml(136mg或1mm)和亚麻酸4.5ml(504mg或1.8mm)，补无菌水4.5ml，液体共10ml，在加热型磁力搅拌器上混匀，控制温度70℃，反应3h.反应完毕后静置冷却过夜。
第四步：透析洗涤：把络合反应液装进透析袋(rc膜，1kd，38mm)，用1l去离子水透析12h，中间换4次去离子水，把未结合的锌离子等杂质透析过滤，直至去离子水清澈透明。
第五步：冷冻干燥：把透析好的反应液装进玻璃螺口样品瓶，用真空冷冻干燥器，-45℃、0.02mbar干燥，干燥72h，即获得亚麻酸锌，产率为79.4％。
实施例3
第一步：活化氯化锌：在反应釜中用无菌水10ml溶解氯化锌1.36g(1mol/l)，将反应釜放进烘干箱中加热170℃，反应30min，自然冷却。
第二步：活化亚麻酸：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)766mg、n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)460mg和α-亚麻酸(α-lla)560mg溶于5mlems溶剂，在通氮气中搅拌混匀活化30min。
第三步：络合反应：在反应釜中加活化好的氯化锌1ml(136mg或1mm)和亚麻酸5ml(504mg或1.8mm)，补无菌水4ml，液体共10ml，在加热型磁力搅拌器上混匀，控制温度80℃，反应2h.反应完毕后静置冷却过夜。
第四步：透析洗涤：把络合反应液装进透析袋(rc膜，1kd，38mm)，用1l去离子水透析12h，中间换4次去离子水，把未结合的锌离子等杂质透析过滤，直至去离子水清澈透明。
第五步：冷冻干燥：把透析好的反应液装进玻璃螺口样品瓶，用真空冷冻干燥器，-45℃、0.02mbar干燥，干燥72h，即获得亚麻酸锌，产率为75.1％。
本发明亚麻酸锌对幽门螺杆菌的抑制作用通过如下实施例进一步详细的说明
1.材料
1.1样品
亚麻酸锌用实施例2制备。
1.2菌株
(1)幽门螺杆菌菌株:标准菌株26695、菌株nsh57、msd132、g27；左氧氟沙星和克拉霉素及甲硝唑多重耐药菌株(hp159)、临床甲硝唑耐药菌株(hp160)、克拉霉素耐药菌株(hp161)、左氧氟沙星耐药菌株(hp162)、左氧氟沙星和甲硝唑耐药菌株(hp163)、克拉霉素和甲硝唑耐药菌株(hp285)(菌株由南昌大学谢勇教授提供和本实验室从临床患者胃粘膜样本分离培养获得)。
(2)非幽门螺杆菌：金黄色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(mg1655)、伤寒沙门氏菌(14028s)、铜绿假单胞菌(pao1)、鲍曼不动杆菌(atcc19606)、肺炎克雷伯氏菌(yf173002)、阴沟肠杆菌(atcc13047)、空肠弯曲菌(nctc11168)、耻垢分枝杆菌(mc2155)、流感嗜血杆菌(atcc49766)、淋病奈瑟菌(atcc19424)、枯草芽孢杆菌(168)、肺炎链球菌(atcc49619)、奇异变形杆菌(yf163006)、粪肠球菌(atcc19434)、屎肠球菌(atcc19434)、卡他莫拉菌(atcc25238)、蜡状芽孢杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、摩根菌、白色念珠菌、伴放线杆菌、乳杆菌、痢疾志贺菌、李斯特菌(没有编号的部分菌株为南京医科大学逸夫医院从临床分离鉴定的菌株)。
1.3培养基和主要试剂：哥伦比亚培养基、脑心浸液培养基、选择性抗生素(万古霉素、多粘菌素b、甲氧苄氨嘧啶)、血清、奥美拉唑、阿莫西林、克拉霉素、革兰氏染色液、细菌基因组dna提取试剂盒、幽门螺杆菌特有caga基因引物等。
1.4实验动物：c57bl/6。
1.5主要仪器：二氧化碳培养箱、三气培养箱、离心机、组织破碎仪、电子天平、灌胃针、剪刀等。
1.6耗材：ep管、tip头、离心管等。
2.方法与结果
2.1微量稀释法检测亚麻酸锌对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(mic，100μl体系)
(1)配备亚麻酸锌2mg/ml。
(2)mic板制备第一孔先加培养基173.6μl，再加6.4μl抗菌药物，倍比稀释至第7孔；第8孔不加药，保留90μl培养基，作为加菌不加药对照。
(3)菌液制备取固体平板上对数期生长的幽门螺杆菌用bhi培养基制作成菌悬液，调整浓度od600为0.3(1×108cfu/ml)，稀释10倍，为1×107cfu/ml，备用。
(4)接种菌液取10μl加至第1-8孔(每孔菌液浓度约为1.0×106cfu/ml)。培养72h判断结果。第1孔至第7孔药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1μg/ml。
(5)结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mic。当阳性对照孔第8孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。当在微量稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。每个药物重复3次试验。
(6)结果：结果见表1。
表1亚麻酸锌对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(mic)
有菌生长，-:无菌生长
2.2微量稀释法检测亚麻酸锌对非幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(mic，100μl体系)
(1)配备亚麻酸锌2mg/ml。
(2)mic板制备第一孔先加培养基167.2μl，再加12.8μl抗菌药物，倍比稀释至第7孔；第8孔不加药，保留90μl培养基，作为加菌不加药对照。
(3)菌液制备取固体平板上对数期生长的幽门螺杆菌用bhi培养基制作成菌悬液，调整浓度od600为0.3(1×108cfu/ml)，稀释100倍，为1×106cfu/ml，备用。
(4)接种菌液取10μl加至第1-8孔(每孔菌液浓度约为1.0×106cfu/ml)。培养72h判断结果。第1孔至第7孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2μg/ml。
(5)结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mic。当阳性对照孔第8孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。当在微量稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。每个药物重复3次试验。
(6)结果：亚麻酸锌金黄色葡萄菌等25种非幽门螺杆菌的mic均大于或等于128μg/ml，见表2。
表2亚麻酸锌对非幽门螺杆菌的细菌最低抑菌浓度(mic)
+:有菌生长，-:无菌生长
2.3构建动物模型检测亚麻酸锌对体内幽门螺杆菌的抑制效果
2.3.1药物：亚麻酸锌、奥美拉唑、阿莫西林、克拉霉素均溶解为10mg/ml。
2.3.2菌株：临床分离的对左氧氟沙星和克拉霉素及甲硝唑多重耐药的菌株(bhk159)，经本实验室驯化3次，确定能定植在小鼠胃粘膜。
2.3.3动物造模：
(1)动物分组：将60只小鼠随机分出10只为阴性对照组，其余40只为感染组。对各组小鼠称重，计算平均体重。
(2)小鼠灌胃：40只感染组小鼠灌胃前12个小时禁食，然后用bhi配制的幽门螺杆菌菌悬液灌胃，菌液浓度为od600为3(1×109cfu/ml)，每只小鼠给予0.5ml，灌完后禁食禁水4个小时。隔天灌胃1次，连续灌5次。
(3)模型检查：末次灌胃后14天，对感染组和对照组小鼠称重，计算平均体重。随机取3只感染组小鼠禁食12小时，眼球采血，颈椎脱臼处死，解剖取小鼠胃，一部分胃组织保存在福尔马林中做病理检查；另一部分胃组织称重、匀浆后稀释10、100、1000倍，用接种环均匀涂布在含有10％血清的哥伦比亚培养基平板上,置于三气培养箱(10％co2、5％o2、85％n2)培养72-96h，观察培养基上细菌菌落特点，计算针尖样大小的透明菌落数量。
(4)菌株鉴定：从培养物中取针尖样大小的透明菌落进行革兰染色镜检；提取细菌dna，用幽门螺杆菌特有基因caga引物，pcr扩增，扩增产物以1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测；胃组织进行石蜡切片并做he染色检查。
(5)检查和鉴定结果：每只小鼠胃组织定植量范围为1×105～1×106cfu/g，具体见表3；
经he染色检查胃粘膜病理损伤，发现有胃粘膜炎症细胞聚集，局部有粘膜有糜烂；经革兰氏染色检查培养物具有典型的幽门螺杆菌形态；经pcr扩增鉴定为幽门螺杆菌，结果汇总见表3，可以证明造模已成功。
2.3.4药物治疗效果观察：
(1)动物分组：实验组将造模成功的感染组平均分成4组，分别为奥美拉唑加亚麻酸锌组、奥美拉唑加阿莫西林和克拉霉素组(三联治疗组)、亚麻酸锌组、pbs组，每组6只；未感染幽门螺杆菌的6只小鼠胃阴性对照组。
表3造模小鼠验证
+:鉴定为幽门螺杆菌，-:不能鉴定为幽门螺杆菌
(2)动物给药：实验组灌胃给药，有奥美拉唑的组先给奥美拉唑，30min后再给其它药物，给完药物后禁食禁水4小时；小鼠体重按照平均20g/只计算，给药量为奥美拉唑138.2mg/kg、阿莫西林28.5mg/kg、克拉霉素14.3mg/kg、亚麻酸锌24mg/kg，每天给药1次，连续5次；阴性对照组给pbs液，剂量、次数同上。
(3)药效检测：停药后第2天感染组的小鼠称重并计算平均体重，眼球采血，行颈椎脱臼处死，取胃组织，幽门螺杆菌的分离培养和鉴定同2.3.3(3)、(4)。
(4)治疗效果:奥美拉唑加亚麻酸锌组对幽门螺杆菌菌的抑制明显优于三联治疗组(奥美拉唑加阿莫西林和克拉霉素)(p<0.05)，如图2；奥美拉唑加亚麻酸锌组对炎症胃粘膜损伤修复能力明显优于三联治疗组，如图3。
2.4亚麻酸锌的毒性检测
2.4.1细胞毒性检测
(1)制备ges-1和ags细胞悬液，调浓度为1×106。
(2)接种到96孔板中：每孔100μl，同样的样本做3个重复。
(3)37℃培养箱中培养12小时。
(4)分别加入亚麻酸锌、亚麻酸、氯化锌10μl，工作浓度分别为400μg/ml、300μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、0μg/ml，设加药不加细胞组和pbs对照组。
(5)37℃培养箱中培养12小时。
(6)加入10μlcck-8，轻敲混匀后培养4小时。
(7)测定450nm吸光度，根据公式计算存活率：细胞增殖率＝[(as-ab)]/[(ac-ab)]×100％，as为含有细胞培养基、药物、cck-8孔，ac为含有细胞培养基、cck-8、没有药物孔，ab为不含细胞和药物、只有培养基和cck-8孔。根据存活率建立生存曲线。
(8)结果400μg/ml的亚麻酸锌对ges-1和ags细胞损伤不大，毒性作用小于亚麻酸。见图4。
2.4.2动物毒性
(1)准备小鼠：20只8周龄c57bl/6小鼠，随机分为10只为给药组，10只为阴性对照组。
(2)灌胃给药：10倍亚麻酸锌治疗量给药，即每只小鼠240mg/kg给药，连续3天，每天给药1次；阴性对照组给pbs液，次数和量同给药组。
(3)称量体重：从给药前1天开始称小鼠体重，连续称量7天。
(4)药效检测：停药后第3天感染组的小鼠称重并计算平均体重，眼球采血，行颈椎脱臼处死，取胃、肾、肝和脾组织，做病理切片并进行he染色，血清做肝肾功能检测。
(5)结果10倍亚麻酸锌治疗量给药组和阴性对照组小鼠的胃、肾、肝和脾组织未见有损伤,如图5；实验组小鼠体重未见有明显变化，如图6；实验组小鼠肝肾功能正常，见表4。
表410倍亚麻酸锌治疗量对小鼠肝、肾功能血生化指标的影响