本发明涉及一种在钝齿棒杆菌中合成l-鸟氨酸的方法，尤其是一种以线型合成途径在钝齿棒杆菌中合成l-鸟氨酸的方法，属于基因工程和代谢工程领域。
背景技术：
l-鸟氨酸(l-ornithine)是一种重要的碱性氨基酸，虽然其不属于组成蛋白质的二十种氨基酸，但其在生物体中有着重要作用，广泛用于食品，医药的添加剂中。目前国内外对其合成和生产都有着比较深入的研究。近年来微生物发酵法生产l-鸟氨酸受到越来越多的关注，各国科学家相继开展这方面的工作。
n-乙酰鸟氨酸乙酰转移酶作为l-鸟氨酸循环合成途径中的第四步反应所需的催化酶，其催化n-乙酰鸟氨酸与l-谷氨酸生成l-鸟氨酸与n-乙酰谷氨酸该酶具有强大的转乙酰基功能，但是该酶受到l-鸟氨酸的反馈抑制，对于l-鸟氨酸合成有一点的影响。线型合成l-鸟氨酸途径中不存在该酶，该酶的功能被n-乙酰谷氨酸合酶(nags)以及n-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(naod)所替代，在高产l-精氨酸的钝齿棒杆菌中，引入线型合成l-鸟氨酸的途径，具有较好的应用前景。
技术实现要素：
本发明提供了一种用于生产l-鸟氨酸的重组菌，以钝齿棒杆菌或者大肠杆菌为宿主，以穿梭质粒pdxw-10为表达载体，串联表达了来源于大肠杆菌的n-乙酰谷氨酸合酶以及来源于粘质沙雷氏菌的n-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶。
所述n-乙酰谷氨酸合酶的氨基酸序列如seqidno.5所示。
编码所述n-乙酰谷氨酸合酶的基因序列是在seqidno.1的基础上，将编码第26位氨基酸的密码子替换为编码组氨酸的密码子、将编码第35位氨基酸的密码子替换为编码酪氨酸的密码子，同时将第一个核苷酸由g替换为a。
编码所述n-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因序列如seqidno.2的基础上，将第一个核苷酸由g替换为a。
编码所述n-乙酰谷氨酸合酶的基因连接seqidno.3所示的rbs序列之后。
编码所述n-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因连接seqidno.4所示的rbs序列之后。
编码n-乙酰谷氨酸合酶的基因插入载体pdxw-10的酶切位点ecori、saci之间，编码n-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因插入到载体pdxw-10的酶切位点bglii、xbai之间。
本发明还提供了应用所述重组钝齿棒杆菌发酵生产l-鸟氨酸的方法，是将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为28～31℃，ph为6.8～7.0，搅拌转速为550～600r/min。发酵过程中，通过补加氨水维持ph稳定。所述发酵培养基成分：葡萄糖100～120g/l，硫酸铵30～40g/l，酵母提取物10～15g/l，七水合硫酸镁0.1～1g/l，氯化钾0.1～1g/l，磷酸二氢钾0.1～1.5g/l，七水合硫酸亚铁0.02～0.5g/l，一水合硫酸锰0.02～0.5g/l，0.01～0.05mml-精氨酸，ph6.8～7.0。
在本发明一种实施方式中，在装液量为2.5l的5l发酵罐中将种子液按6％接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为31℃，ph为7.0，搅拌转速为600r/min，培养72h。发酵过程中，温度与搅拌转速由发酵罐自动控制，ph通过补加50％氨水维持稳定。
所述发酵培养基成分：葡萄糖120g/l，硫酸铵30g/l，酵母提取物15g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，氯化钾1g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，七水合硫酸亚铁0.02g/l，一水合硫酸锰0.02g/l，0.05mml-精氨酸，去离子水配置，ph7.0。将上述发酵培养基用50％的氨水调节其ph至7.0，在121℃下高温灭菌30min。
所述宿主钝齿棒杆菌，还可以进一步敲除l-脯氨酸的代谢支路，l-鸟氨酸的代谢支路，并在染色体上整合解除l-精氨酸的抑制n-乙酰谷氨酸激酶(nagk)。
本发明利用分子技术将来源于通过利用pdxw10穿梭质粒对来源粘质沙雷氏菌的n-乙酰鸟氨酸脱乙酰化酶进行克隆表达，并且利用rbs计算器对其rbs预测优化，同时将起始密码子g1a替换；同时，对来源大肠杆菌的n-乙酰谷氨酸合酶克隆表达，对26位和35位氨基酸进行复合突变解除l-精氨酸对其的反馈抑制作用，并进行rbs优化和起始密码子替换。将优化好的两个酶进行串联表达于钝齿棒杆菌中，重组菌株在5-l发酵罐发酵72h，l-鸟氨酸的产量达到46.2g/l，比出发菌株，l-鸟氨酸的产量提高了62.2％，生产强度达到0.642g/l/h，并且糖酸转化率为0.414g/g。
本发明的优点和积极效果是：
(1)本发明对来源s.marcescensy213的n-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶进行rbs优化，起始密码子g1a替换；对来源e.colibl21(de3)的n-乙酰谷氨酸合酶进行rbs优化，起始密码子g1a替换，并通过复合突变解除l-精氨酸对n-乙酰谷氨酸合酶的反馈抑制。
(2)本发明采用5-l发酵罐分批发酵策略，优化发酵条件，最终c.crenatumsypo/pdxw-10-ecargahy-smargeb发酵至72h，l-鸟氨酸产量达到46.2g/l，外源引入新型线型l-鸟氨酸合成途径对l-鸟氨酸产量具有促进效果。
具体实施方式
实施例1：n-乙酰谷氨酸合酶(nags)的克隆与表达
利用大肠杆菌的基因组dna为模板，引物argaf/r进行pcr扩增，得到大小为1332bp(seqidno.1)编码443个氨基酸的基因片段，连接至pmd18-t载体上，测序，通过dnaman进行序列比对表明基因序列无误。将t-arga用ecori，saci双酶切，回收arga片段后，与利用相同酶线性化的pdxw10(+)连接后转化，挑取阳性转化子提取质粒，利用质粒为模板，进行pcr验证，结果表明pdxw10-arga构建成功。将重组质粒pdxw10-arga转化入大肠杆菌bl21，得到重组菌bl21/pdxw10(+)-arga，将重组菌bl21/pdxw10(+)-arga经诱导培养后收集细胞，将细胞利用超声破碎仪进行破碎，离心后收集上清液，通过sds-page分析，得到49kda大小的特异性条带。
实施例2：定点突变解除l-精氨酸对n-乙酰谷氨酸合酶的反馈抑制
对n-乙酰谷氨酸合酶进行定点突变，获得k26h/e35y双突变体，n-乙酰谷氨酸合酶k26h/e35y双突变体的l-精氨酸的半抑制常数从0.2mm提高到8.5mm，这使得l-精氨酸对n-乙酰谷氨酸合酶的反馈抑制得到解除，为l-鸟氨酸的产量提高提供有力基础。k26h/e35y双突变体的氨基酸序列如seqidno.5所示。
实施例3：n-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(naod)的克隆与表达
来自粘质沙雷氏菌的n-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶具有适合鸟氨酸发酵的酶学性质，以粘质沙雷氏菌基因组dna为模板，引物p1f/r进行pcr扩增，得到大小1152bp(seqidno.2)编码383个氨基酸的基因片段，连接至pmd18-t载体测序，将t-arge用ecori、saci双酶切，回收arge片段后，与线性化pdxw10(+)连接后转化，阳性转化子提取质粒经ecori、saci酶切验证，释放8531bp和1152bp大小的片段，分别对应pdxw10(+)和smarge的大小，结果表明质粒pdxw10-arge构建成功。将质粒pdxw10-arge转化入大肠杆菌bl21，得到重组菌bl21/pdxw10(+)-arge。重组菌bl21/pdxw10(+)-arge经诱导培养后收集细胞，细胞经过超声破碎后，取上清进行sds-page分析，得到分子量为39kda的特异性条带
实施例4：优化n-乙酰谷氨酸合酶与n-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的rbs序列以及起始密码子替换
将上面实施例2中的n-乙酰谷氨酸合酶k26h/e35y双突变体与实施例3中的n-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶通过酶切串联于大肠杆菌-棒杆菌穿梭表达载体pdxw10(+)，酶切位点分别ecori、saci,和bglii、xbai，将所得重组质粒分别在大肠杆菌、钝齿棒杆菌中诱导表达，测定重组大肠杆菌的破碎上清液的酶活，结果表明，在大肠杆菌中，串联后的nags与naod的酶活分别为21.9u/ml，38.3u/ml；在钝齿棒杆菌中，串联后的nags的酶活为6.4u/ml，naod酶活则为9.9u/ml。
通过rbs计数器(https://www.denovodna.com/software/dologin)计算出n-乙酰谷氨酸合酶k26h/e35y双突变体的原始rbs序列的强度为1698au，采用计数器预测筛选强度为4500的rbs序列进行替换原始rbs序列，并同时替换arga的起始密码子g1a。测定经过rbs替换以及起始密码子优化后的菌株的酶活，结果表明携带重组质粒pdxw10-arga4500的大肠杆菌所产的n-乙酰谷氨酸合酶的比酶活最高，达到99.76u/mg，比优化前提高95.74％。强度为4500au的rbs序列的核苷酸序列如seqidno.3所示。
运用同样的策略，对粘质沙雷氏菌来源的n-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(smnaod)中的原始rbs强度进行测定(1890au)，利用预测得到的强度4500aurbs序列替换原始rbs序列，并替换arge的起始密码子g1a。测定经过rbs替换以及起始密码子优化后的菌株的酶活，结果表明携带质粒pdxw10-arge4500的大肠杆菌所产的n-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的比酶活最高，达到828.71u/mg，比优化前提高将近5倍。强度为4500au的rbs序列的核苷酸序列如seqidno.4所示。
将rbs优化以及起始密码子替换后的arga与arge基因重新串联于大肠杆菌-棒杆菌穿梭表达载体pdxw10(+)，酶切位点分别ecori、saci,和bglii、xbai，将所得重组质粒电转入钝齿棒杆菌中诱导表达，测定酶活，nags的酶活、naod的酶活相比优化前都提高了两倍以上，分别为14.5u/ml，27.4u/ml。
实施例5：重组菌株c.crenatumsypo/pdxw-10-ecargahy-smargeb发酵罐实验
(1)种子培养
从活化平板上挑取单菌落接种于10ml含卡那霉素的bhi培养基中，30℃振荡培养24h，然后全部转接于150ml种子培养基中，30℃培养24h，种子培养基组成：葡萄糖50g/l，硫酸铵25g/l，酵母提取物15g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，去离子水配置，ph7.0。
(2)发酵培养
初始发酵培养体积为2.5l，采用的发酵培养基成分如下：
发酵培养基成分：葡萄糖120g/l，硫酸铵30g/l，酵母提取物15g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，氯化钾1g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，七水合硫酸亚铁0.02g/l，一水合硫酸锰0.02g/l，0.05mml-精氨酸，去离子水配置，ph7.0。将上述发酵培养基用50％的氨水调节其ph至7.0，在121℃下高温灭菌30min。
发酵条件：将上述培养好的种子液按6％接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为31℃，ph为7.0，搅拌转速为600r/min。培养72h。
发酵过程中，温度与搅拌转速由发酵罐自动控制，ph通过补加50％氨水维持稳定。从第24h起，每12h取样一次，采用分光光度仪在a562下测定细胞od值，葡萄糖用生物传感分析仪测定(sba-50，山东省科学院生物研究所)。
l-鸟氨酸和其他各种氨基酸采用hplc测定(安捷伦1100，美国)。结果表明，相比于出发菌，重组菌生长的更好，糖耗更快，发酵至72h，重组菌的l-鸟氨酸产量达到46.2g/l，较出发菌株c.crenatumsypo提高了62.2％，生产强度达到0.642g/l/h，并且糖酸转化率为0.414g/g，实现了引入新型线型l-鸟氨酸合成途径使l-鸟氨酸的合成有显著提升效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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