本发明涉及一种硫酸软骨素的提取方法。
背景技术：
：硫酸软骨素(chondroitin，cs)以下简称cs，是动物细胞外基质中一种重要的糖胺聚糖，是一种聚阴离子酸性粘多糖。硫酸软骨素为白色或微黄色粉末，无臭，无味，具有吸湿性，易溶于水，难溶于甲醇，乙醇，乙醚，丙酮和冰醋酸等有机溶剂。应用广泛具有促进冠状动脉血液循环，降血脂、抗凝血、抗炎症及抗肿瘤等生理活性、临床上可用于预防动脉粥状硬化、提高机体免疫力、治疗风湿病、肾炎、关节炎、偏头痛、神经痛、腰痛、老年肩痛、四肢麻木及由链霉素引起的听觉障碍等病症。作为食品添加剂，硫酸软骨素cs可用于食品的乳化、保湿和祛除异味，可制成美容产品和保健食品。目前硫酸软骨素的提取大多采用碱提取，酶法，超声辅助法等方法，如专利号为200410072346.9《硫酸软骨素的提取方法》及200510027279.3《硫酸软骨素的提取方法》，这些发明工艺在提取过程中加入单一的胰蛋白酶进行酶解，其在生产过程中去除溶液中蛋白质效果差，生产的cs产品纯度不高。且采用真空浓缩喷雾干燥设施和工序，得率低，还需要使用亚硝酸盐为保护剂等，这些工艺存在步骤繁琐，操作困难，生产周期长，设备投资大，成本高，产品纯度和得率都偏低，质量不稳定，活性不够的问题，影响企业生产的经济效益。技术实现要素：本发明的目的就是要提供一种硫酸软骨素的提取方法，利用复合酶解，冷冻干燥技术，现实工艺生产操作方便，生产周期短，分离效率及得率高，硫酸软骨素活性强的提取工艺方法。本发明的技术方案按下列工艺步骤进行：(1)原料处理：将畜禽结缔组织，于80-100℃水中煮10-80min，去除杂质，于50-90℃温度下干燥并粉碎；(2)碱提：于粉碎后的结缔组织中按料液体积比1∶5-8比例加入浓度为2-6wt％的一价金属氢氧化物溶液，浸提、过滤除渣得碱提液，并调整碱提液ph至6.5-8；(3)酶解：于所述碱提液中加入占其重量0.5-1.5％的复合酶，控制酶解温度40-60℃，时间2-4h后，制得粗酶解液，灭酶处理，得酶解液；(4)吸附：将所述的酶解液其ph值调整至6-7，用活性炭吸附1-2h后，静置，过滤得吸附滤液；(5)脱蛋白：向吸附滤液中加入占其重量5-12％的蛋白沉淀剂，并不断搅拌，沉淀，得上清液；(6)醇沉，干燥：于上清液中加入乙醇以体积比上清液∶乙醇为1∶2-6；搅拌后静置5小时以上，至沉淀完全，过滤；沉淀物用乙醇洗涤后用碱金属盐溶液溶解，离心分离，得离心溶液，将离心溶液再用乙醇沉淀得沉淀物，沉淀物经冷冻干燥制得硫酸软骨素。所述碱金属盐溶液是nacl和/或kcl溶液。冷冻干燥是工业化生产中常用的干燥技术。本发明所述一价金属氢氧化物溶液为naoh和/或koh溶液，提取过程中采用间歇搅拌。本发明酶解中使用复合酶是碱性蛋白酶、风味蛋白酶、和/或脂肪酶的复合。也可以是胰酶、木瓜蛋白酶、和/或脂肪酶的复合。酶解过程在加入复合酶后于恒温下不断搅拌进行酶解2小时以上，制得粗酶解液；灭酶处理是将粗酶解液于80-95℃下灭酶5-20min；灭去酶的活性；再加入脂肪酶水解粗酶解液中的少量脂肪后，再重复上述灭酶处理一次制得酶解液。本发明所述蛋白沉淀剂为三氯乙酸溶液。本发明所用乙醇为含量80-90％乙醇质量浓度，所述碱金属盐溶液优选浓度为1-5wt％nacl或kcl溶液。本发明提取工艺流程：畜禽结缔组织→原料处理→粉碎→碱提→复合酶解→吸附→脱蛋白→醇沉→冷冻干燥→成品。本发明采用复合酶解，冷冻干燥等工艺技术提取硫酸软骨素，运用物理和化学技术相结合大大提高了cs提取率及纯度和活性，产品纯度达95.5％，产率达12％以上。本发明和传统提取工艺相比还具如下创新，采用传统工艺浓碱、稀碱生产工艺存在步骤繁琐，周期较长，生产过程中cs受到不同程度破坏，产品质量的收率不稳定，收率偏低，溶液颜色加深，乙醇耗量大，生产成本较高。同时生产过程中排放大量酸、碱、盐等物质，对水环境造成极严重污染，且排放处理困难或处理费太高。本发明工艺稀碱-酶解法反应条件温和，工艺较简单，cs中的硫酸根离子等成分经酶解后纯度均有显著提高，并且有多种生物活性，多糖纯度相应大大提高。本发明采用复合酶解、冷冻干燥技术的提取，可提高硫酸软骨素的提取率及纯度。本发明原料畜禽结缔组织，即畜禽软骨、喉骨、鼻骨和气管等经原料预处理去除其组织上的肉质和油脂后，进行烘干粉碎，经碱提处理目的是破坏硫酸软骨素与蛋白质之间的键，使硫酸软骨素释放出来，不会溶解断裂；然后用复合酶进行酶解溶液中及硫酸软骨素长链上的蛋白质，形成为可溶性小分子肽，氨基酸等物质，复合酶中的脂肪酶，酶解溶液中的油脂类物质，使之形成可溶性脂肪酸等物，便于醇沉时分离开。蛋白质是硫酸软骨素中的杂质之一，一般是通过酶解方式来使蛋白质进一步水解，而单一酶解方式进行，难以实现蛋白质的完全充分溶解分离；蛋白质溶解后使用蛋白沉淀剂三氯乙酸使蛋白质沉淀分离；分离后的溶液用活性炭进行吸附分离。本发明工艺生产提取的产品与现有技术工艺相比还具如下特点，生产时间短，本发明生产周期在12小时，而现有技术达72小时以上，生产自动化程度高，全自动密闭生产，对环境无污染，现有技术存在废水废料排放污染环境；本发明产品纯度和得率高，而现有技术生产的cs产品纯度和得率分别仅为70-80％，5-6％。cs产品质量指标：感官指标：为淡黄色粉末，易吸潮溶于水；理化指标：cs纯度≥80％，铅(以p6计)≤0.5mg/kg，氯化物(以nacl计)≤0.5，蛋白质≤6％，水分≤15％，大肠菌群≤90mpn/100g，菌落总数≤1000cfu/g，致病菌沙门氏菌等不得检出。本发明工艺生产出的硫酸软骨素产品经江西省分析测试中心检验结果见表1检验依据《中国药典》2005版。表1检验项目检验结果氯化物(以nacl计)0.42％重金属(以pb计)0.24mg/kg含量(氨纯葡萄糖，以干基计)95.1％干燥失重12.4％ph值6.88含氮量3.72％具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1(1)原料处理：将干燥的畜禽软骨、喉骨、鼻骨和气管等组织用水冲洗干净，投入80-90℃的水中蒸煮60min捞起，洗净，去除含蛋白质、脂肪类等杂质后，于80℃温度下烘干，再粉碎；(2)碱提，称取粉碎后的畜禽软骨、喉骨、鼻骨和气管组织，加入其6倍体积量的浓度为2.5wt％的na0h溶液，于40-50℃温度下浸提，同时间歇搅拌，过滤除去滤渣，重复多次过滤使滤渣除去干净，得碱提液，将碱提液的ph调至中性，即ph＝7；(3)酶解：向上述的碱提液中加入占碱提液质量1％的复合酶，所述复合酶由碱性蛋白酶，风味蛋白酶和脂肪酶三者复合组成；控制酶水解温度50℃，于此温度下不断搅拌，酶水解2h后，制得粗酶解液；灭酶处理，即粗酶解液于90℃温度下灭酶10min，然后加脂肪酶水解粗酶解液中少量脂肪，于相同条件下再重复灭酶处理一次，制得酶解液；(4)吸附：将(3)步灭活后制得的酶解液ph值调至6.5，加入活性炭搅拌吸附1h，然后静置并过滤得吸附滤液；(5)脱蛋白：将占吸附滤液质量10％的蛋白沉淀剂三氯乙酸加入吸附滤液中，不断搅拌产生沉淀，然后离心分离制得上清液；离心分离转速3000r/min以上，时间10min。(6)醇沉、干燥：向上述上清液中加入为上清液体积量3倍的浓度为86wt％乙醇，搅拌后静置至沉淀完全一般6h以上，过滤，回收乙醇，沉淀物用无水乙醇充分洗涤后用浓度为2wt％nacl溶液溶解，再离心分离，离心分离转速3000r/min以上，离心溶液用浓度为86wt％的乙醇继续沉淀，制得的沉淀物进行冷冻干燥即为本发明硫酸软骨素cs产品。当前第1页12