本发明涉及医药和临床诊断技术领域，具体地说，是一种检测奥沙利铂对于肝癌化疗敏感性的试剂盒及其应用。
背景技术：
肝细胞肝癌(hcc)是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，早期诊断率低，大多数患者确诊时已处于中晚期或发生远处转移，预后不良，严重危害人类的健康。
中晚期肝癌患者大多不适合进行手术切除、消融等治疗，全身治疗仍是其重要的治疗手段，但目前的索拉非尼靶向治疗对生存期(os)的改善有限。多中心临床研究(each试验)表明，以奥沙利铂为主的folfox4方案化疗对国人肝细胞肝癌疗效较好，安全性较高，因此也被国家食品药品监督管理局(cfda)批准用于治疗晚期肝细胞癌。然而，临床上固有耐药及获得性耐药制约着奥沙利铂的临床疗效，因此，为尽早克服和逆转肝癌奥沙利铂耐受，目前急需使用准确、特异、灵敏性强的分子标志物来预测奥沙利铂肝癌化疗敏感性，区分奥沙利铂肝癌化疗的敏感人群与非敏感人群，制定个体化治疗方案，从而提高临床疗效，改善患者预后。
南开大学2011年硕士论文《yap增强人肝癌化疗药物敏感性的分子机理研究》，主要以肝癌细胞系为基础，初步探索yap在肝癌中的分子机制。首先，作者用70例肝癌标本和10例正常肝组织染色，初步明确yap和p-yap在肝细胞癌中的表达情况。其次，作者验证在体外实验用的肝癌细胞系中yap的表达情况。在此基础上，研究肝癌细胞系中表达的yap蛋白对耐药是促进作用还是抑制作用，在明确yap具备作用的基础上，通过大量查阅文献，并依靠以往的工作基础，尝试和探索，来进一步明确yap对耐药影响的分子机理。具体探讨了在肝癌细胞系hepg2中，yap对化疗药物作用的影响及下游机制，并初步得出以下结论：在化疗药物刺激下，yap能增强hepg2的化疗敏感性；在化疗药物刺激下，yap能增强p53的表达；yap通过上调p53来增强化疗敏感性。
然而，目前关于yap及cyr61基因的拷贝数变化与肝癌细胞对奥沙利铂的化疗敏感性的关系还未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种检测奥沙利铂对于肝癌化疗敏感性的试剂盒及其应用。
第一方面，本发明提供了yap基因或蛋白在作为奥沙利铂肝癌化疗敏感性的生物标记物中的应用。
作为一个实例，所述的肝癌为bel-7404或smmc-7721肝癌。
作为一个实例，所述的肝癌为bel-7404或smmc-7721肝癌细胞系。
第二方面，本发明提供了检测yap基因或蛋白含量的试剂在制备检测奥沙利铂对于肝癌化疗敏感性的试剂盒中的应用。
优选地，所述的试剂包含序列如seqidno:19和seqidno:20所示的用于扩增yap基因的引物对。
更优选地，所述的试剂进一步包含序列如seqidno:9和seqidno:10所示的用于扩增gapdh基因的引物对。
更优选地，所述的试剂进一步包含序列如seqidno:21和seqidno:22所示的用于扩增cyr61基因的引物对。
第三方面，本发明提供了cyr61基因或蛋白在作为奥沙利铂肝癌化疗敏感性的生物标记物中的应用。
作为一个实例，所述的肝癌为bel-7404或smmc-7721肝癌。
作为一个实例，所述的肝癌为bel-7404或smmc-7721肝癌细胞系。
第四方面，本发明提供了检测cyr61基因或蛋白含量的试剂在制备检测奥沙利铂对于肝癌化疗敏感性的试剂盒中的应用。
优选地，所述的试剂包含序列如seqidno:21和seqidno:22所示的用于扩增cyr61基因的引物对。
第五方面，本发明提供了一种检测奥沙利铂对于肝癌化疗敏感性的试剂盒，所述的试剂盒包含：
c)检测yap基因或蛋白含量的试剂；和/或
d)检测cyr61基因或蛋白含量的试剂。
优选地，所述的试剂盒包含：
e)如seqidno:19和seqidno:20所示的用于扩增yap基因的引物对；
f)如seqidno:21和seqidno:22所示的用于扩增cyr61基因的引物对；
g)如seqidno:9和seqidno:10所示的用于扩增gapdh基因的引物对；以及
记载有下列内容的载体：采用实时荧光定量pcr扩增体系，反应体系包括：一对检测yap基因拷贝数的扩增引物序列，或一对检测cyr61基因拷贝数的扩增引物序列，或一对检测内参基因gapdh基因拷贝数的引物序列，pcr底物，pcr缓冲液，待检cdna模板，无酶去离子水。
本发明优点在于：
1、本发明首次发现yap及cyr61基因的拷贝数变化与肝癌细胞对奥沙利铂的化疗敏感性密切相关。因此，本发明采用yap和cyr61基因作为奥沙利铂肝癌化疗敏感性的生物标记物，总结得出一种化疗敏感性评估方法，方便临床评价待检肝癌患者对奥沙利铂化疗是否敏感，指导临床个体化用药，改善患者预后。
2、本发明采用自行设计并优化的内参和目的引物，整合了实时荧光定量pcr试剂，制成检测试剂盒，该试剂盒引物特异性高，显著优于其他引物，能提供准确可靠的检测结果。
3、本发明的试剂盒联合检测yap及cyr61，能提供更加准确的评估结果。
附图说明
图1是使用cck8实验检测奥沙利铂在肝癌细胞bel-7404和smmc-7721中的半抑制浓度(ic50)结果。
图2是蛋白质印迹法检测奥沙利铂作用肝癌细胞后yap、cyr61以及凋亡相关蛋白bcl2和裂解半胱天冬酶底物(cleavedcaspasesubstrate)的变化结果。
图3是实时荧光定量pcr实验检测奥沙利铂作用肝癌细胞后yap和cyr61基因mrna表达水平的变化结果。
图4是免疫荧光实验检测奥沙利铂作用肝癌细胞后yap在细胞中的定位情况。
图5中a是采用shrna慢病毒载体敲减yap基因的表达，cck8检测奥沙利铂对两组细胞活性的影响结果。图5中b是采用shrna慢病毒载体敲减yap基因的表达，蛋白质印迹法检测奥沙利铂作用yap敲减的肝癌细胞中yap、cyr61以及凋亡相关蛋白bcl2和裂解半胱天冬酶底物(cleavedcaspasesubstrate)的变化情况。
图6是分别在bel-7404和smmc-7721中采用琼脂糖凝胶电泳鉴定实时荧光定量pcr产物的特异性结果，图6中a与b分别为两次独立重复实验。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明的实验路线如下：
1.采用奥沙利铂干预肝癌细胞，采用实时荧光定量pcr和蛋白质印迹法检测肝癌细胞中yap和cyr61基因拷贝数和蛋白表达的变化；采用蛋白质印迹法检测肝癌细胞中凋亡相关蛋白的表达变化；采用免疫荧光技术检测奥沙利铂干预后yap在细胞中的定位情况。
2.yap和cyr61基因在检测肝癌细胞中奥沙利铂化疗敏感性的作用。
3.采用shrna结合慢病毒技术干扰肝癌细胞中yap基因的表达，发现奥沙利铂所致细胞生长抑制提高，使得奥沙利铂化疗敏感性提高，表明yap基因的表达水平与奥沙利铂的敏感性呈负相关。
4.设计了众多对gapdh基因引物序列和yap基因引物序列(见表1，表1中列出其中的5对)，分别在bel-7404和smmc-7721肝癌细胞中进行实时荧光定量pcr扩增，使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，评价pcr产物的特异性，进而评价引物质量。
表1pcr引物序列
5.经过上述技术方案4优选后，采用优选的gapdh和yap基因的引物设计试剂盒。
实施例1
一、实验方法
1.细胞培养：人肝癌细胞bel-7404和smmc-7721生长于含10％胎牛血清dmem高糖培养基中，在37℃、5％co2饱和湿度的培养箱中传代培养，实验用细胞均处于对数生长期。2-3天常规消化传代1次，细胞消化使用胰蛋白酶-edta消化液(0.25％)。
2.细胞增殖cck8实验：将5000个对数生长期的肝癌细胞接种至96孔板中，完全培养基200μl/孔，每个样本设置3个复孔，此外设置一个空白孔作为空白对照，置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养24h后，更换为含有不同浓度奥沙利铂(0、1.25、2.5、5、10、20μg/ml)的培养基。继续培养24h后，更换为含有10％cck8试剂的培养基，培养1-4h，待培养基变为黄色时，采用酶标仪读取每孔在波长为450nm处的吸光度。根据吸光度计算细胞活性。细胞活性＝(加药孔od值－空白孔od值)/(对照孔od值－空白孔od值)。细胞活性为50％时对应的奥沙利铂的浓度即为半抑制浓度。实验至少重复3次。
3.蛋白质印迹实验
3.1将5*105个对数生长期的肝癌细胞接种至6孔板，完全培养基2ml/孔，置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养24h后，加入半抑制浓度(即10μg/ml)的奥沙利铂，继续培养24h后，收集细胞。
3.2提取细胞总蛋白：使用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞于1.5mlep管中，室温1000rpm/min离心10min。使用pbs洗两次，加入ip蛋白裂解液50～100μl/孔，置于4℃裂解1h，4℃12000g离心10min，上清为目标蛋白，吸取上清至新的ep管中，置于冰上备用。
3.3制作标准曲线，bca定量：使用预先配好的标准品(c＝0.5μg/μl)，取96孔板，按表2浓度梯度布孔加样。
表2蛋白定量绘制标准曲线
加好后，每孔加入200μl的ab液，bca试剂a液:b液＝50:1，轻轻振荡混匀后，37℃培养30min，酶标仪检测562nm处的吸光度，绘制标准曲线，得出方程，计算蛋白浓度。
3.4蛋白变性：每100μl样品中加入20μl的6×蛋白上样缓冲液，100℃水浴10min，变性蛋白样品。根据蛋白浓度计算上样量，置于-80℃或-20℃保存。
3.5配胶：根据表3配制10％分离胶，混匀后立即倒入玻璃板中，使用无水乙醇液封，1h后倒掉无水乙醇，根据表4配制5％浓缩胶，混匀后立即倒入玻璃板中，插入梳子，静置1h后置于4℃保存。
表310％分离胶配制方法
表45％浓缩胶的配制方法
3.6安装好电泳装置，倒入电泳缓冲液，拔去梳子，最左边孔加入marker5μl，上蛋白样品，接通电源80v电泳1～2h。
3.7根据待测蛋白的分子量和marker切取相应的胶，剪取相应大小的nc膜，并用圆珠笔在一角作好标记，将胶、滤纸和其它转膜所需的物品在转膜缓冲液中浸湿，制作转膜“三明治”，即黑色板-海绵-厚滤纸-凝胶-膜-厚滤纸-海绵-白色板，冰上200ma转膜，30～100kd以下转膜1h，100kd以上转膜2h，约每1kd转膜1min。
3.8取出nc膜，5％脱脂奶粉摇床封闭60min，回收封闭液。
3.9加入一抗，一抗按1:1000稀释，4℃摇床过夜。
3.10洗涤一抗，pbst洗3次，每次10min。
3.11在暗盒中孵二抗，二抗按1:2000稀释。
3.12pbst洗涤3次，每次10min。
3.13配制ecl显色剂，a液和b液各500μl，混匀，将膜放在ep手套上，滴加显色剂，曝光。
4.实时荧光定量pcr检测基因拷贝数的变化
4.1将5*105个对数生长期的肝癌细胞接种至6孔板，完全培养基2ml/孔，置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养24h后，加入半抑制浓度(即10μg/ml)的奥沙利铂，继续培养24h后，收集细胞。
4.2提取细胞总rna：使用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞于1.5mlep管中，室温1000rpm/min离心10min。使用pbs洗两次，每管加入1mltrizol，吹打混匀，室温静置5min，加入200μl氯仿，剧烈震荡混匀30s，待氯仿充分乳化后，4℃12000g离心20min。将上清转移至新的ep管中(注意不要吸到中间蛋白层)，向吸出的上清中加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒ep管混匀后置于-20℃静置20min，4℃12000g离心10min以沉淀rna。吸弃上清，加入250μldepc水配制的70％冷乙醇溶液，混匀后4℃12000g离心10min，弃去乙醇，室温风干沉淀，加入50μldepc水溶解rna，分光光度计测定rna浓度与a260/280值后置于-80℃保存。
4.3逆转录合成cdna：取3000ng总rna，5×qrtsuper-mix2μl，剩余用无酶超纯水补至10μl，在pcr仪中逆转录合成cdna，逆转录条件：25℃10min，42℃30min，85℃5min，cdna分装后置于-20℃保存。
4.4实时荧光定量pcr：取正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl(引物序列见表1)，2×sybrgreenqpcrmix10μl，待检cdna模板2μl，50×roxdye20.4μl，无酶去离子水5.6μl。每个反应设置3个复孔，同时设置无模板对照。经优化qpcr的反应条件如下：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火及延伸45s，40个循环。设置在延伸阶段收集荧光信号，quantstudio软件分析得到样本中个基因的循环阈值(cq值)。qpcr反应结束后进行熔解曲线检测，95℃15s，60℃60s，95℃15s，1个循环。每个样本实验重复3次。
5.琼脂糖凝胶电泳
5.1配制适量的电泳缓冲液及制胶缓冲液(tbe)；
5.2配制2％的琼脂糖凝胶，称取2g的琼脂粉，加入制胶瓶中，加入100ml的tbe；
5.3盖松瓶盖，在微波炉中加热溶解琼脂糖，沸腾后，摇动瓶，反复三次，使其充分溶解；
5.4将溶解好的琼脂糖溶液倒入制胶板，凝胶厚度在8mm左右，用枪头赶走气泡；
5.5室温下使胶凝固，拔掉梳子，放入电泳槽使用；
5.6向pcr产物加入适量loadingbuffer及1/10的sybrgreenl，充分混匀后使用；
5.7上样，沿着胶孔边缘匀速加入样品，尽量避免破坏胶孔；
5.8向预留孔中加入dnamarkerd2000；
5.9盖好电泳槽的盖子，接通电源，电压80v～120v进行电泳；
5.10电泳结束后用凝胶成像观察并记录电泳结果。
6.免疫荧光实验：将细胞爬片铺于24孔板中，每孔接种1000个细胞，完全培养基200μl。置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养24h后，加入半抑制浓度(即10μg/ml)的奥沙利铂，继续培养24h，吸去培养基，pbs洗1次，5min，用4％多聚甲醛固定20min，用0.2％tritonx100和1％bsa的pbs进行透膜和封闭1h。用封闭液稀释一抗(1:100～1:400)，4℃孵育过夜。用pbs洗涤细胞3次，每次5min，dapi孵育20min，pbs洗3次，每次5min，封片，共聚焦显微镜拍照。
7.敲减yap肝癌稳转株的构建
7.1确定嘌呤霉素最适剂量：将5*105个对数生长期肝癌细胞接种于6孔板，每孔加入2ml完全培养基，细胞贴壁后各孔分别加入不同剂量嘌呤霉素，每日倒置显微镜下观察细胞生长状态，选择3天致所有肝癌细胞死亡的嘌呤霉素剂量作为筛选阳性克隆所需嘌呤霉素的最适剂量。
7.2转染：将5*105个对数生长期肝癌细胞接种于6孔板，每孔加入2ml完全培养基，配制转染试剂，将3μgplko.1-yapshrna质粒(plko.1购于addgene公司，货号：#8453；yapshrna的编码序列seqidno:23为aagctttgagttctgacatcc；插入位点：u6promoter和hpgkpromoter之间)加入150μl无血清细胞基础培养基室温25℃孵育5min，再加入含18μlpei转染试剂，混匀，室温孵育10～15min后加入6孔板，置于细胞培养箱培养24h后按步骤7.1获得的最适剂量加入嘌呤霉素培养。
7.396孔板单克隆形成法筛选阳性克隆：培养24～48h后胰酶消化细胞并计数，按1000-2000个细胞到a1个孔，进行倍比稀释，每孔加入200μl含有最适剂量嘌呤霉素的完全培养基培养，培养7天左右，每2-3天换液一次，待有单克隆形成，继续培养至细胞长到80％～90％后，细胞传代至24孔板、12孔板、6孔板后westernblot检测yap的表达，挑选出yap显著敲低阳性单克隆。
7.4扩增培养：将步骤7.3中挑选出的阳性单克隆细胞继续扩增培养，培养时在完全培养基中仍需按最适剂量加入嘌呤霉素，每2-3天换液一次。
上述技术方案中，在步骤7.2中设有shrna质粒阴性对照实验及未转染阴性细胞对照实验。
二、实验结果
图1是使用cck8实验检测奥沙利铂在肝癌细胞bel-7404和smmc-7721中的半抑制浓度(ic50)结果。
图2是蛋白质印迹法检测奥沙利铂作用肝癌细胞后yap、cyr61以及凋亡相关蛋白bcl2和裂解半胱天冬酶底物(cleavedcaspasesubstrate)的变化结果。
图3是实时荧光定量pcr实验检测奥沙利铂作用肝癌细胞后yap和cyr61基因mrna表达水平的变化结果。
图4是免疫荧光实验检测奥沙利铂作用肝癌细胞后yap在细胞中的定位情况。
以上结果表明，奥沙利铂(oxa)促进肝癌细胞中yap表达，药物敏感性低。
图5中a是采用shrna慢病毒载体敲减yap基因的表达，cck8检测奥沙利铂对两组细胞活性的影响结果。
图5中b是采用shrna慢病毒载体敲减yap基因的表达，蛋白质印迹法检测奥沙利铂作用yap敲减的肝癌细胞中yap、cyr61以及凋亡相关蛋白bcl2和裂解半胱天冬酶底物(cleavedcaspasesubstrate)的变化情况。
以上结果表明，抑制yap，奥沙利铂(oxa)敏感性增高。
由此可见，yap基因的表达水平与奥沙利铂的敏感性呈负相关，yap及cyr61基因的拷贝数变化与肝癌细胞对奥沙利铂的化疗敏感性密切相关，yap和cyr61基因可作为奥沙利铂肝癌化疗敏感性的生物标记物。
图6是分别在bel-7404和smmc-7721中采用琼脂糖凝胶电泳鉴定实时荧光定量pcr产物的特异性结果，图6中a与b分别为两次独立重复实验。结合两次实验结果证明，gapdh5与yap5的pcr产物特异性高，引物质量显著优于表1中其他引物和发明人实际设计的但未列出在本申请文件中的引物。
实施例2
采用优选的gapdh和yap基因的引物设计试剂盒。本试剂盒采用实时荧光定量pcr扩增体系，每20μl反应体系包括：一对检测yap基因拷贝数的扩增引物序列，或一对检测cyr61基因拷贝数的扩增引物序列，或一对检测内参基因gapdh基因拷贝数的引物序列(见表5)，其正向引物(10μm)体积均为1μl，反向引物(10μm)体积均为1μl，2×sybrgreenqpcrmix的体积为10μl，50×roxdye2的体积为0.4μl，待检cdna模板2μl，无酶去离子水5.6μl。在该试剂盒中，加入了对cyr61的扩增，由于cyr61是明确的yap的下游靶基因，因此联合检测yap及cyr61能够确保更加准确的评估结果。
表5试剂盒中pcr引物序列
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
sequencelisting
<110>上海市中医医院
<120>一种检测奥沙利铂对于肝癌化疗敏感性的试剂盒及其应用
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