本发明涉及一种糖尿病遗传风险评估试剂盒，并用于评估个体糖尿病及其相关并发症的遗传风险。
背景技术：
糖尿病是由遗传因素和环境因素共同作用下以高血糖为特征的代谢性疾病，已成为全球最严重的公共卫生问题之一。截止2015年，全球成年糖尿病患者数量已达4.15亿，且仍呈上升趋势，预计2040年该数字将会达到6.42亿。最新数据显示：2013年中国居民患糖尿病患病率为10.9％，接近美国2011-2012年糖尿病患病率(12％-14％)，糖尿病前期流行率高达35.7％，中国糖尿病患者已位居世界首位。中国糖尿病发病还呈现年轻化趋势，2010年早发糖尿病所占比例已达13.5％，发病越早并发症风险越，诸如：bmi更高、血糖更难控制、血压更高、血脂谱中ldl水平升高及hdl水平下降明显等。糖尿病发病越早与更高的全因死亡率风险有关，主要归因于随年龄增长而呈指数增加的心血管疾病死亡率，并主要取决于糖尿病病程，即发病发生越早心血管事件风险越高，且糖尿病合并心血管疾病的数量与死亡风险增加和年龄别预期寿命显著更短相关。是故，中国糖尿病防治形势非常严峻。
dcct、ukpds以及steno-2等里程碑研究长期后续随访研究结果，说明了糖尿病早期干预的重要性，对干预时机的把握有可能成为决定整个结局的重要决定因素，干预的时机有时甚至比干预本身更加重要。因而，有必要确定和筛查发生糖尿病，尤其是早发糖尿病的高风险人群，探索如何改变生活方式以预防或延迟2型糖尿病的发生。最新型糖尿病遗传学研究发现：特定的遗传位点以及整体的遗传风险共同导致β细胞功能障碍，是导致中国人2型糖尿病的主要原因。从遗传的角度来讲，糖尿病遗传易感研究为糖尿病的早期预防提供一种新的策略。
糖尿病发病率在中国还存在民族差异，如：汉族与非汉族之间以及非汉族之间。在非汉族人群中，无论是城市还是农村，新疆维吾尔族糖尿病发生率更高，且知晓率、治疗率和控制率均非常低。不健康的生活方式在维吾尔族糖尿病患者人群中亦普遍存在，除了有中国糖尿病患者总体人群的共性特点外，还有与维吾尔族自身独特饮食习惯有关的个性特点，如：高脂高糖高盐饮食模式下的烤肉、面食以及奶茶等。在不考虑糖尿病遗传背景前提下，健康的生活方式与低糖尿病风险及其相关心血管事件(如：高血压、心肌梗死，心力衰竭，脑卒中等)的风险有关。虽然有可能改变不健康的生活方式，但不可能改变遗传结构。健康生活方式带来的心血管获益往往被高遗传风险所抵消。故，中国维吾尔族糖尿病防控过程中，强调危险因素的综合评估与不良生活方式的管理的同时，不能忽视对糖尿病的遗传背景的临床评估。
目前已知糖尿病的遗传易感候选基因有很多，但与raas有关的基因研究却较少。血管紧张素转换酶2(angiotensinconvertingenzyme2，ace2)作为raas关键调节酶，人类ace2基因定位于x染色体的xp22位点上，基因全长约39.98kb，包含20个内含子，18个外显子。ace2编码的蛋白是i型膜结合糖蛋白，由805个氨基酸组成，包括羧基端跨膜锚定区、氨基端信号肽区、胞膜外的金属蛋白酶锌结合域hexxh三个结构部分。ace2基因序列具有高度多态性，且人群研究结果显示ace2基因多态性与糖尿病及其相关并发症相关联，其可作为糖尿病的遗传易感候选基因。虽然已经证实ace2基因多态性与糖尿病密切相关，但其存在高度的遗传异质性。在后基因时代，对维吾尔族人群中ace2遗传异质性的早期识别，有助于实施糖尿病早期精准的个体化防治以及长期获益。
技术实现要素：
针对前述问题，本发明提供了一种用于检测糖尿病及其相关并发症的遗传风险的试剂盒。
该试剂盒包括：
检测ace2基因单核苷酸多态位点rs1978124的特异性pcr引物对及延伸引物；
检测ace2基因单核苷酸多态位点rs2074192的特异性pcr引物对及延伸引物；
检测ace2基因单核苷酸多态位点rs4848188的特异性pcr引物对及延伸引物；
检测ace2基因单核苷酸多态位点rs879922特异性pcr引物对及延伸引物；
pcr反应组件(包括taqdna聚合酶、ntp混合物、mgcl2溶液、10×pcrbuffer溶液、去离子水等)；
pcr产物纯化组件(包括虾碱性磷酸酶(sap)、sapbuffer、去离子水等)
pcr单碱基延伸反应组件(包括iplex酶、iplex引物混合物、iplex终止液、iplexbuffer、去离子水等)
本试剂盒中所述的特异性引物对是针对ace2基因单核苷酸多态位点rs1978124、rs2074192、rs4848188和rs879922，能特异性扩增出包含这4个单核苷酸多态位点dna片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能轻易完成的。试剂盒中包含具有seqidnq.1和2、3和4、5和6、7和8所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的技术进行合成，本发明的引物不限于这4对引物，所有可用于pcr技术检测这4个ace2单核苷酸多态位点的引物对均在本发明范围内。
本试剂盒中所述的延伸引物是针对ace2基因单核苷酸多态位点rs1978124、rs2074192、rs4848188和rs879922，用于对这4个单核苷酸多态位点进行基因型分型的引物。设计这类引物对是本领域技术人员能轻易完成的。试剂盒中包含具有seqidnq.9、10、11和12所示序列的延伸引物。特异性延伸引物对可用常规的技术进行合成，本发明的引物不限于这4条延伸引物，所有可用于dna测序技术检测这4个ace2单核苷酸多态位点基因分型的延伸引物均在本发明范围内。
进一步的，本试剂盒的组分及含量包括：①pcr反应组件：10ng/μldna1.0μl、5u/μltaqdna聚合酶0.2μl、0.5μmol/l引物混合物1.0μl、25mmol/ldntp混合物0.1μl、25mmol/lmgcl20.4μl、10×pcrbuffer0.5μl、去离子水1.8μl，每个反应体系总体积为5.0μl；②pcr产物纯化组件：步骤①终产物5.0μl、1.7u/μlsap0.3μl、sapbuffer0.17μl、去离子水1.53μl，每个反应体系总体积为7.0μl；③pcr单碱基延伸反应组件：步骤②终产物7.0μl、iplex酶0.041μl、iplex引物混合物0.94μl、iplex终止液0.2μl、iplexbuffer0.2μl、去离子水0.619μl，每个反应体系总体积为9.0μl。本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒保存温度为-20℃。
进一步的，本发明试剂盒的使用方法包括步骤：(1)提取受检者dna；(2)进行pcr扩增反应(反应条件为：94℃15min→(94℃20s→56℃30s→72℃60s，45循环)→72℃3min→4℃保持)；(3)在pcr反应结束后，将pcr产物用虾碱性磷酸酶处理，以去除反应体系中游离的dntps(反应条件为：37℃40min→85℃5min→4℃保持)；(4)单碱基延伸反应(反应条件为：94℃30s→(94℃5s→52℃5s→80℃5s，40循环)→72℃3min→4℃保持)；(5)树脂纯化；(6)芯片点样及质谱检测确定这4个ace2单核苷酸多态位点的基因型。
进一步的，本发明所涉及试剂盒通过检测与糖尿病及其相关并发症发生密切相关的ace2基因单核苷酸多态位点，来评估受检者发生糖尿病及其相关并发症遗传风险级别，从基因层面指导受检者早期从生活方式层面进行干预，有针对性的预防糖尿病及其相关并发症，以降低糖尿病的发病率。
附图说明
图1使用typer4.0软件对ace2基因单核苷酸多态位点rs1978124分型示意图
图2使用typer4.0软件对ace2基因单核苷酸多态位点rs2074192分型示意图
图3使用typer4.0软件对ace2基因单核苷酸多态位点rs4848188分型示意图
图4使用typer4.0软件对ace2基因单核苷酸多态位点rs879922分型示意图
具体实施例
实施例1糖尿病遗传风险评估试剂盒的使用
步骤一、纳入受试者
共纳入136例正常对照人群(正常对照组)和128例糖尿病人群(糖尿病组)，两组除在性别构成、年龄、舒张压、血脂水平(ldl、chol、lp(a)、apoa1/apo比值)、肾功能水平(cr、bun、ua)、肝功能(alt、ast、aib)、hscrp和raas活性(ace、renin、ald(卧位))方面差异无统计学意义外(all＞0.05)，在收缩压、bmi、血脂水平(trig、hdl)、血糖(fbs、hba1c)、血电解质(血清钠浓度、血清钾浓度)、raas活性(angi、angii)以及24小时微量白蛋白尿等差异均有统计学意义(allp＜0.05)，见表1。
表1正常对照组与糖尿组组受试者临床基线特征
步骤二、采集受试者dna样本
采集每例受试者血样标本2ml，用酚/氯仿抽提基因组dna。
步骤三、pcr反应
使用试剂盒中的pcr反应组件。其中，含有下列针对ace2基因单核苷酸多态位点rs1978124、rs2074192、rs4848188和rs879922的特异性引物对：
(1)针对ace2基因单核苷酸位点rs1978124的特异性引物对：
上游引物：acgttggatgaagctgctgatgtagaagtg(seqidnq.1)
下游引物：acgttggatggagagaactttggaaacctg(seqidnq.2)
(2)针对ace2基因单核苷酸位点rs2074192的特异性引物对：
上游引物：acgttggatgcccttaaacacagcagtcac(seqidnq.3)
下游引物：acgttggatgttaggttcatcaacagctcc(seqidnq.4)
(3)针对ace2基因单核苷酸位点rs4848188的特异性引物对：
上游引物：acgttggatgctctgtgttcccttctgttg(seqidnq.5)
下游引物：acgttggatggatattctactcagaaacg(seqidnq.6)
(4)针对ace2基因单核苷酸位点rs879922的特异性引物对：
上游引物：acgttggatgggcagtttattgtacattgtg(seqidnq.7)
下游引物：acgttggatggctccagcaaattcaaggac(seqidnq.9)
针对前述4个ace2单核苷酸多态位点分别进行4次独立的pcr反应，每个反应体系总体积为5.0μl。包括：10ng/μldna1.0μl、5u/μltaqdna聚合酶0.2μl、0.5μmol/l引物混合物1.0μl、25mmol/ldntp混合物0.1μl、25mmol/lmgcl20.4μl、10×pcrbuffer0.5μl、去离子水1.8μl。反应条件为：94℃15min→(94℃20s→56℃30s→72℃60s，45循环)→72℃3min→4℃保持。
步骤四、pcr产物纯化。
在pcr反应结束后，使用本试剂盒中的pcr纯化组件对pcr产物进行纯化。每个pcr产物纯化反应体系总体积为7.0μl，包括：步骤三中终产物5.0μl、1.7u/μl虾碱性磷酸酶(sap)0.3μl、sapbuffer0.17μl、去离子水1.53μl。反应条件为：37℃40min→85℃5min→4℃保持。
步骤五、dna测序反应
使用本试剂盒中的pcr单碱基延伸反应组件。其中，含有下列针对ace2单核苷酸多态位点rs1978124、rs2074192、rs4848188和rs879922的特异性延伸引物：
(1)针对ace2基因单核苷酸位点rs1978124的特异性延伸引物：ccatatctctatctgatggac(seqidnq.9)；
(2)针对ace2基因单核苷酸位点rs2074192的特异性延伸引物：caagggtggaaatgtataaatggttgg(seqidnq.10)；
(3)针对ace2基因单核苷酸位点rs4848188的特异性延伸引物：ggggaacgtagaattttagttgaatg(seqidnq.11)；
(4)针对ace2基因单核苷酸位点rs879922的特异性延伸引物：ctcaaggactggggtta(seqidnq.12)。
每个pcr单碱基延伸反应体系总体积为9.0μl。包括：步骤四中终产物7.0μl、iplex酶0.041μl、特异性延伸引物混合物0.94μl、iplex终止液0.2μl、iplexbuffer0.2μl、去离子水0.619μl。反应条件为：94℃30s→(94℃5s→52℃5s→80℃5s，40循环)→72℃3min→4℃保持。
步骤六、树脂纯化。
在384/6mgdimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干，后使用liquidhandler机器臂在384样本板的每个孔中加16μl水，继续将384样本板轻轻翻转过来扣在dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中，接着将384样本板放置离心机中室温旋转混匀60分钟。
步骤七、芯片点样及质谱检测基因分型。
启动massarraynanodispenserrs1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔spectrochip(sequenom)芯片上，并用maldi-tofms分析，检测结果使用typer4.0软件(sequenom)分型并输出结果。
熟悉dna测序技术的本领域技术人员能过通过辨识dna测序图谱确定受试者所检测的前述4个ace2基因单核苷酸多态位点的基因型。
实施例2糖尿病遗传易感风险评估
步骤一：采集受试者dna。由专业人员采集受试者血样样本2ml。
步骤二、基因分型检测。使用本发明提供的试剂盒，按实施例1中相关步骤，对受试者基因组所携带的ace2基因单核苷酸多态位点rs1978124、rs2074192、rs4848188和rs879922进行dna测序分析，确定这4个ace2基因单核苷酸多态位点的基因型。
步骤三、对ace2基因单核苷酸多态位点rs1978124、rs2074192、rs4848188和rs879922的基因型进行相对风险(or)赋值，如表2所示。
表2不同ace2基因单核苷酸多态位点基因型发生糖尿病相对风险
步骤三、对ace2基因单核苷酸多态位点rs1978124、rs2074192、rs4848188和rs879922的基因型进行相对风险(or)赋值，如表2所示。
步骤四、根据所检测出ace2基因单核苷酸多态位点rs1978124、rs2074192、rs4848188和rs879922的基因型，按如下标准判断受试者发生糖尿病风险的程度(或级别)：or≤1：低风险；1＜or＜2：中风险；≥2：高风险。
步骤五、通过鉴定受试者ace2基因单核苷酸多态位点rs1978124、rs2074192、rs4848188和rs879922的基因型，出具个体发生糖尿病的遗传易感风险分析报告。报告中详细说明受检者发生糖尿病以及糖尿病相关并发症(如权利要求8-10所述)的遗传易感风险的程度(或级别)，并由医学专业人员向受试者详细说明或解读以及给予相应的医学专业意见。
虽然本发明以较优的实施例公开如上，但并非用以限定本发明的实施范围。任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的范围内，当可作些许改进，即凡是依照本发明所做的同等改进，应为本发明的范围所涵盖。