本发明涉及益生菌产品技术领域，具体涉及一种包埋型益生菌产品的活菌数量检测方法。
背景技术
益生菌(probiotics)是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌，其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。
益生菌是一个适合在低温环境下生存的菌种，2001年3月中国卫生部发布了卫法监发〔2001〕84号，益生菌类保健食品评审规定第十条明确指出不提倡以液态形式生产益生菌类保健食品活菌产品因益生菌已经过科学实验认证液态存活非常难，且益生菌怕水，所以消费者在购买益生菌的时候一定要选择冷藏运输，或者在超市冰柜冷藏柜中的益生菌粉状而其他一些液态饮料以及网络销售的无冷藏运送的产品益生菌存活非常低。由于人体内的胃酸、胆汁及各种消化酶的不良影响，益生菌到达肠道时其存活率极大地降低，因此，人们通常会服用包埋型益生菌产品，包埋层的存在使益生菌获得一定的可以抵御胃酸、胆汁和消化酶的能力，最后能以较高的活菌数定值于肠黏膜上发挥作用。
包埋型益生菌因受到包埋物质的保护作用，一般传统计数分析方法无法有效地将包埋层溶离使活菌适当释放而连带影响分析结果。吐温80是一种温和的表面活性剂，表面活性剂的作用是增加憎水性物质与水相融的能力，如常用于某些中草药注射液，以免其少量难溶性成分的析出，加入量为1％一2％。因此将吐温80加入到稀释缓冲液中能够促进活菌的释放，使分析结果更加准确可信。活菌计数的原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落，通过计算培养基中菌落的数量来计算活菌数，因此培养基必须澄清干净，但是吐温80作为表面活性剂有较强的发泡能力，在使用的过程中会产生大量的泡沫，不利于准确计量，并且吐温80有异味，活菌检测过程中异味污染检测空间，使检测人员带来不适感。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种包埋型益生菌产品的活菌数量检测方法，解决了现有技术中检测误差大，结果不科学的问题。
一种包埋型益生菌产品的活菌数量检测方法，所述活菌数量检测方法包括以下步骤：
(1)预处理：称取适量待测的包埋型益生菌产品置无菌研钵中研磨至细粉；
(2)制备菌体悬液：称取1-5mg步骤(1)中制备的细粉，加到50ml离心管中，加入30-50ml稀释缓冲液，涡旋震荡器震荡充分溶解包埋层，得到菌体悬液；
(3)梯度稀释：震荡混匀步骤(2)制得的菌体悬液，取1-5ml混匀后的菌体悬液，加入稀释缓冲液稀释成4个浓度梯度，对应的稀释倍数为5-15倍、50-150倍、500-1500倍、5000-15000倍；
(4)菌落培养：吸取步骤(3)中的梯度稀释液加到无菌培养皿中，加入mrs培养基混匀，静置，凝固后，封口膜封口，倒置于培养箱进行培养；
(5)菌落计数：对步骤(4)中的培养皿进行菌落计数，得活菌检测结果。
进一步的，步骤(2)中所述的稀释缓冲液由如下重量百分比的物质组成：kh2po40.3-0.6％，na2hpo40.5-0.7％，nacl0.6-1.0％，吐温800.5-1.5％，聚氧丙烯甘油醚0.01-0.03％，β-环状糊精0.04-0.08％，余量为纯化水。
本发明中梯度稀释菌体悬液，因为菌落计数的时候是统计培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数，此时一个菌落代表一个活菌，如果菌体悬液浓度过高，将无法清晰分辨单个菌落，如果浓度过低，经过培养，培养皿中将无法长出菌落，因为稀释的时候并不知道有没有稀释过度，所以要用不同浓度的稀释液分别做实验，最后统计活菌数。本发明中聚氧丙烯甘油醚是一种无色或淡黄色的拈稠状液体，具有较强而持久的消泡能力，加入到稀释缓冲液中，可消除吐温80产生的泡沫，很好地避免了因泡沫而影响活菌数量计数准确性的问题，并且这种消泡剂无毒性,聚氧丙烯甘油醚对细菌生长没有影响可在医药、酿造等工业的广泛应用,本发明的活菌数量检测方法可以准确地检测活菌的数量，并且无毒无害，不用担心试剂加入杀死活菌，另外聚氧丙烯甘油醚也是一种表面活性剂，可与吐温80协同作用，提高包埋层的溶解性，促进活菌更有效地释放。
本发明β-环状糊精是一种白色或几乎白色的结晶固体或结晶性粉末，是一种新型的分子包裹材料，可与多种化合物形成包合物，使其稳定、增溶、缓释、乳化、抗氧化、抗分解、保温、防潮，具有掩蔽异味的作用，β-环状糊精用于提升吐温80的稳定性，提高包埋层的溶解性，并且能够有效地去除吐温80产生的异味，优化检测方法。
进一步的，步骤(4)中所述的mrs培养基由如下重量份的物质组成：总量蛋白胨9-11份，牛肉膏9-11份，酵母膏4-6份，柠檬酸氢二铵1-3份，葡萄糖15-25份，吐温800.5-1.5份，乙酸钠4-6，磷酸氢二钾1-3份，磷酸镁0.5-0.6份，硫酸锰0.2-0.3份，琼脂15-20份，蒸馏水500-1000份。
本发明选用mrs培养基，当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使ph下降，再加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌。
进一步的，步骤(4)中所述的mrs培养基的ph为6.2-6.6。
进一步的，步骤(4)中所述梯度稀释液与所述mrs培养基的体积比为1：(100-150)，所述菌落培养的培养温度为37±1℃，所述菌落培养的时间为24-48h。
进一步的，步骤(5)所述菌落计数方法为：选取菌落数在30-300之间的培养皿进行计数。
本发明选择菌落数在30-300的培养皿进行计数，主要是因为小于30说明稀释倍数太大，菌液浓度分布不均，各平板之间菌落数差异会很大，造成误差，而大于300菌落的生长受到抑制，并且难以区分各个菌落准确计数，造成误差。
进一步的，步骤(5)所述菌落计数时设计了空白对照组，所述空白对照组为步骤(2)中的稀释缓冲液。
本发明在同样的条件下设计空白对照组，用于检测实验是否处于正常状态，很好地排除杂菌和其他因素的干扰。
进一步的，所述的研钵、50ml离心管、稀释缓冲液、mrs培养基和培养皿使用前都经过121℃，25min的高压灭菌处理。
进一步的，所述所有处理操作均在超净工作台上进行。
本发明的研钵、50ml离心管、稀释缓冲液、mrs培养基和培养皿使用前都经过高温高压灭菌，并且所有操作步骤都在无菌环境进行，很好地避免了杂菌污染，对活菌数量计数造成干扰，从而提高活菌数量检测的可靠性。
本发明的有益效果是：本发明加入吐温80作为表面活性剂，促进包埋层溶解，让益生菌得到全部释放，添加聚氧丙烯甘油醚、β-环状糊精，消除泡沫以及异味，计数误差小，检测结果可靠，严格无菌操作，避免杂菌污染，检测结果可信度高，有很好的推广价值。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
一种包埋型益生菌产品的活菌数量检测方法，包括以下步骤：
(1)预处理：称取适量待测的包埋型益生菌产品置无菌研钵中研磨至细粉；
(2)制备菌体悬液：称取1mg步骤(1)中制备的细粉，加到50ml离心管中，加入30ml稀释缓冲液，涡旋震荡器震荡充分溶解包埋层，得到菌体悬液；
(3)梯度稀释：震荡混匀步骤(2)制得的菌体悬液，取1ml混匀后的菌体悬液，加入稀释缓冲液稀释成4个浓度梯度，对应的稀释倍数为5倍、50倍、500倍、5000倍；
(4)菌落培养：吸取步骤(3)中的梯度稀释液加到无菌培养皿中，加入mrs培养基混匀，静置，凝固后，封口膜封口，倒置于培养箱进行培养；
(5)菌落计数：对步骤(4)中的培养皿进行菌落计数，得活菌检测结果。
所述步骤(2)中的稀释缓冲液由如下重量百分比的物质组成：kh2po40.3％，na2hpo40.5％，nacl0.6％，吐温800.5％，聚乙二醇0.05％，聚氧丙烯甘油醚0.01％，β-环状糊精0.04％，余量为纯化水。
所述步骤(4)中的mrs培养基由如下重量份的物质组成：总量蛋白胨9份，牛肉膏9份，酵母膏4份，柠檬酸氢二铵1份，葡萄糖15份，吐温800.5份，乙酸钠4，磷酸氢二钾1份，磷酸镁0.5份，硫酸锰0.2份，琼脂15份，蒸馏水500份。
所述步骤(4)中的mrs培养基的ph为6.2。
所述步骤(4)中梯度稀释液与mrs培养基的体积比为1：100，菌落培养的培养温度为37±1℃，菌落培养的时间为24h。
所述步骤(5)菌落计数方法为：选取菌落数在30-300之间的培养皿进行计数。
所述步骤(5)菌落计数时设计了空白对照组，空白对照组为步骤(2)中的稀释缓冲液。
所述研钵、50ml离心管、稀释缓冲液、mrs培养基和培养皿使用前都经过121℃，25min的高压灭菌处理。
所述所有处理操作均在超净工作台上进行。
实施例2
一种包埋型益生菌产品的活菌数量检测方法，包括以下步骤：
(1)预处理：称取适量待测的包埋型益生菌产品置无菌研钵中研磨至细粉；
(2)制备菌体悬液：称取3mg步骤(1)中制备的细粉，加到50ml离心管中，加入40ml稀释缓冲液，涡旋震荡器震荡充分溶解包埋层，得到菌体悬液；
(3)梯度稀释：震荡混匀步骤(2)制得的菌体悬液，取3ml混匀后的菌体悬液，加入稀释缓冲液稀释成4个浓度梯度，对应的稀释倍数为10倍、100倍、1000倍、10000倍；
(4)菌落培养：吸取步骤(3)中的梯度稀释液加到无菌培养皿中，加入mrs培养基混匀，静置，凝固后，封口膜封口，倒置于培养箱进行培养；
(5)菌落计数：对步骤(4)中的培养皿进行菌落计数，得活菌检测结果。
所述步骤(2)中的稀释缓冲液由如下重量百分比的物质组成：kh2po40.5％，na2hpo40.6％，nacl0.8％，吐温801％，聚乙二醇0.75％，聚氧丙烯甘油醚0.05％，β-环状糊精0.06％，余量为纯化水。
所述步骤(4)中的mrs培养基由如下重量份的物质组成：总量蛋白胨10份，牛肉膏10份，酵母膏5份，柠檬酸氢二铵2份，葡萄糖20份，吐温801份，乙酸钠5，磷酸氢二钾2份，磷酸镁0.55份，硫酸锰0.25份，琼脂17份，蒸馏水750份。
所述步骤(4)中的mrs培养基的ph为6.4。
所述步骤(4)中梯度稀释液与mrs培养基的体积比为1：125，菌落培养的培养温度为37±1℃，菌落培养的时间为36h。
所述步骤(5)菌落计数方法为：选取菌落数在30-300之间的培养皿进行计数。
所述步骤(5)菌落计数时设计了空白对照组，空白对照组为步骤(2)中的稀释缓冲液。
所述研钵、50ml离心管、稀释缓冲液、mrs培养基和培养皿使用前都经过121℃，25min的高压灭菌处理。
所述所有处理操作均在超净工作台上进行。
实施例3
一种包埋型益生菌产品的活菌数量检测方法，包括以下步骤：
(1)预处理：称取适量待测的包埋型益生菌产品置无菌研钵中研磨至细粉；
(2)制备菌体悬液：称取5mg步骤(1)中制备的细粉，加到50ml离心管中，加入50ml稀释缓冲液，涡旋震荡器震荡充分溶解包埋层，得到菌体悬液；
(3)梯度稀释：震荡混匀步骤(2)制得的菌体悬液，取5ml混匀后的菌体悬液，加入稀释缓冲液稀释成4个浓度梯度，对应的稀释倍数为15倍、150倍、1500倍、15000倍；
(4)菌落培养：吸取步骤(3)中的梯度稀释液加到无菌培养皿中，加入mrs培养基混匀，静置，凝固后，封口膜封口，倒置于培养箱进行培养；
(5)菌落计数：对步骤(4)中的培养皿进行菌落计数，得活菌检测结果。
所述步骤(2)中的稀释缓冲液由如下重量百分比的物质组成：kh2po40.6％，na2hpo40.7％，nacl1.0％，吐温801.5％，聚乙二醇0.1％，聚氧丙烯甘油醚0.1％，β-环状糊精0.08％，余量为纯化水。
所述步骤(4)中的mrs培养基由如下重量份的物质组成：总量蛋白胨11份，牛肉膏11份，酵母膏6份，柠檬酸氢二铵3份，葡萄糖25份，吐温801.5份，乙酸钠6，磷酸氢二钾3份，磷酸镁0.6份，硫酸锰0.3份，琼脂20份，蒸馏水1000份。
所述步骤(4)中的mrs培养基的ph为6.6。
所述步骤(4)中梯度稀释液与mrs培养基的体积比为1：150，菌落培养的培养温度为37±1℃，菌落培养的时间为48h。
所述步骤(5)菌落计数方法为：选取菌落数在30-300之间的培养皿进行计数。
所述步骤(5)菌落计数时设计了空白对照组，空白对照组为步骤(2)中的稀释缓冲液。
所述研钵、50ml离心管、稀释缓冲液、mrs培养基和培养皿使用前都经过121℃，25min的高压灭菌处理。
所述所有处理操作均在超净工作台上进行。
对比实施例1
本对比实施例1与实施例2相比，省去步骤2中的吐温80，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例2
本对比实施例1与实施例2相比，省去步骤2中的聚氧丙烯甘油醚，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例3
本对比实施例1与实施例2相比，省去步骤2中的β-环状糊精，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例4
本对比实施例1与实施例2相比，省去步骤2中的吐温80、聚氧丙烯甘油醚和β-环状糊精，除此外的方法步骤均相同。
对照组
申请号为：201611028452.6公开的一种包埋型益生菌产品的活菌数量检测方法。
为了对比本发明效果，选用市面上同一批制得的包埋型益生菌含片(产品中生产的活菌含量值为：3.3-3.5×109cfu/g)作为实验对象，分别用上述实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4、对照组的方法进行检测，对应检测的对比数据如下表1所示：
表1
从上述表格可以看出，在与申请号为201611028452.6公开的一种包埋型益生菌产品的活菌数量检测方法相比，本发明能使包埋层溶解，有效地提高了益生菌的释放，解决了现有技术中包埋型益生菌产品的活菌数量检测方法检测误差大，检测结果不可靠的问题。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。