本发明涉及一种视觉系统损伤的评价方法，特别涉及一种人工光源视觉系统损伤的评价方法。
背景技术
人视网膜色素上皮细胞(rpe细胞)内含有黑色素颗粒，进入眼内的光线大部分经此层吸收。不同屈光状态下，由于色相差的缘故，rpe吸收的不同波长色光的光密度是不一样的，这可能对rpe的生长、形态、功能等有一定影响，从而影响视力。细胞生物学和分子生物学研究证实高色温led光源对人眼角膜上皮细胞、晶体上皮细胞、人原代视网膜色素上皮细胞光损伤作用；有研究发现，高色温led对小鼠视网膜外核层细胞有损伤，而对角膜和晶状体未见损伤。随着科技的发展，手机、笔记本等电子设备日益普及，人们暴露在电子设备光照的环境下的时间越来越长，但这些光照是否对人眼视网膜造成影响未能引起人们足够的重视。
因此，有必要对各种新型人工光源的安全谱及安全阈值进行进一步研究，建立一种新型人工光源视觉系统损伤评价的方法。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种人工光源视觉系统损伤的评价方法，可以检测各种人工光源对视觉系统的损伤情况，高效、灵敏。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种人工光源视觉系统损伤的评价方法，包括以下步骤：
s1、将存储有人视网膜细胞的冻存管迅速放入37℃的水浴中解冻10min；
s2、将解冻后的人视网膜细胞转移到离心管中，以10000-12000rpm的转速离心3-5min，弃除上清；
s3、往离心管中加入3-5mldmem高糖培养液，轻轻混匀后接种于培养瓶中，然后置于培养箱中进行复苏培养，每两天更换一次培养液；
s4、当细胞在培养瓶中长满90％以上后，将培养液弃除，往培养瓶中加入灭菌胎牛血清清洗3遍；
s5、往培养瓶中加入2ml消化液，37℃消化30min；
s6、往含消化液的培养瓶中加入2ml完全培养液，终止消化液的消化作用；
s7、往清洗后的培养瓶中加入1.5ml0.1％edta溶液，轻轻震荡将瓶底内的细胞溶解，使细胞完全脱落成细胞悬液；
s8、将细胞悬液转移到离心管中，并置于离心机中以10000-12000rpm的转速离心5min，弃除上清；
s9、往离心管中加入适量dmem高糖培养液，然后将其转移到多个新培养瓶中，并置于培养箱中培养；
s10、按s4-s9的方法进行传代培养，往第3代或第4代细胞的培养箱中置入人工光源，分别选取12h、18h和24h光照培养的传代细胞进行后续实验；
s11、以上述光照培养的传代细胞为材料提取rna，并以mrna为模板逆转录合成cdna，然后以cdna为模板，对人视网膜细胞引起炎性因子设计特异引物进行荧光定量pcr，根据炎性因子的表达量判断人视网膜细胞的损伤情况。
优选地，所述人视网膜细胞为人视网膜色素上皮细胞或视网膜神经胶质细胞。
优选地，所述人视网膜细胞存储在冻存管中，然后将冻存管置于液氮中保存。
优选地，所述dmem高糖培养液中含有10％体积的胎牛血清。
优选地，所述培养箱的培养条件为37℃，5％二氧化碳。
优选地，所述完全培养液包含20％胎牛血清、1％青链霉素和hams-f12培养液。
优选地，所述消化液为0.5％胰蛋白酶。
优选地，所述人工光源包括led灯、手机屏幕、笔记本屏幕。
优选地，s10步骤中设置有对照组，对照组以锡箔纸包裹避光培养。
优选地，s11步骤中所述rna的a260/280比值为1.9-2.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明提供的一种人工光源视觉系统损伤的评价方法，可以检测各种人工光源对视觉系统的损伤情况，高效、灵敏；
(2)采用本发明的人工光源视觉系统损伤的评价方法检测led灯、手机屏幕和笔记本屏幕三种人工光源对人视网膜色素上皮细胞的损伤情况，检测结果发现led灯、手机屏幕和笔记本屏幕光照环境下，人视网膜色素上皮细胞会发生一定程度的损伤，并且光照时间的越长，损坏程度越大；
(3)采用本发明的人工光源视觉系统损伤的评价方法检测led灯、手机屏幕和笔记本屏幕三种人工光源对视网膜神经胶质细胞的损伤情况，检测结果发现led灯、手机屏幕和笔记本屏幕光照环境下，视网膜神经胶质细胞会发生一定程度的损伤，并且光照时间的越长，损坏程度越大。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
一种人工光源视觉系统损伤的评价方法，包括以下步骤：
s1、将存储有人视网膜色素上皮细胞的冻存管迅速放入37℃的水浴中解冻10min；
s2、将解冻后的人视网膜色素上皮细胞转移到离心管中，以10000rpm的转速离心3min，弃除上清；
s3、往离心管中加入3mldmem高糖培养液，轻轻混匀后接种于培养瓶中，然后置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中进行复苏培养，每两天更换一次培养液；
s4、当细胞在培养瓶中长满90％以上后，将培养液弃除，往培养瓶中加入灭菌胎牛血清清洗3遍；
s5、往培养瓶中加入2ml消化液，37℃消化30min；
s6、往含消化液的培养瓶中加入2ml完全培养液，终止消化液的消化作用；
s7、往清洗后的培养瓶中加入1.5ml0.1％edta溶液，轻轻震荡将瓶底内的细胞溶解，使细胞完全脱落成细胞悬液；
s8、将细胞悬液转移到离心管中，并置于离心机中以10000rpm的转速离心5min，弃除上清；
s9、往离心管中加入适量dmem高糖培养液，然后将其转移到多个新培养瓶中，并置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养；
s10、按s4-s9的方法进行传代培养，往第3代细胞的培养箱中置入led灯，对照组以锡箔纸包裹避光培养，分别选取12h、18h和24h光照培养的传代细胞进行后续实验；
s11、以上述光照培养的传代细胞和对照组细胞为材料分别提取rna，并检测rna的纯度，rna的a260/280比值应处于1.9-2.0之间，然后以mrna为模板逆转录合成cdna，再以cdna为模板，对人视网膜色素上皮细胞引起炎性因子设计特异引物进行荧光定量pcr，由于引起人视网膜细胞损伤的炎性因子包括nf-κb、mcp-1和il-8，人视网膜在发生病变时，这三种炎性因子表达量会增加，因此根据nf-κb、mcp-1和il-8这三种炎性因子的表达量可以判断人视网膜色素上皮细胞的损伤情况。为保证实验的准确性，本实验进行三次重复。其中，nf-κb、mcp-1和il-8这三种炎性因子所采用的引物如下：
荧光定量pcr结束后，将各对照组12h、18h和24hled灯光照培养后人视网膜色素上皮细胞nf-κb、mcp-1和il-8这三种炎性因子的表达量标记为(1±0.00)，并记录各实验组三种炎性因子表达量与对照组三种炎性因子表达量的比值，结果发现，led灯光照12h、18h和24h光照培养后人视网膜色素上皮细胞nf-κb因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.43±0.14)、(1.52±0.15)和(1.61±0.34)倍；mcp-1因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.38±0.23)、(1.47±0.34)和(1.52±0.51)倍；il-8因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.49±0.35)、(1.61±0.61)和(1.73±0.41)倍。由此可见，led灯光照环境下，人视网膜色素上皮细胞会发生一定程度的损伤，并且光照时间的越长，损坏程度越大。
实施例2
一种人工光源视觉系统损伤的评价方法，包括以下步骤：
s1、将存储有人视网膜色素上皮细胞的冻存管迅速放入37℃的水浴中解冻10min；
s2、将解冻后的人视网膜色素上皮细胞转移到离心管中，以11000rpm的转速离心4min，弃除上清；
s3、往离心管中加入4mldmem高糖培养液，轻轻混匀后接种于培养瓶中，然后置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中进行复苏培养，每两天更换一次培养液；
s4、当细胞在培养瓶中长满90％以上后，将培养液弃除，往培养瓶中加入灭菌胎牛血清清洗3遍；
s5、往培养瓶中加入2ml消化液，37℃消化30min；
s6、往含消化液的培养瓶中加入2ml完全培养液，终止消化液的消化作用；
s7、往清洗后的培养瓶中加入1.5ml0.1％edta溶液，轻轻震荡将瓶底内的细胞溶解，使细胞完全脱落成细胞悬液；
s8、将细胞悬液转移到离心管中，并置于离心机中以11000rpm的转速离心5min，弃除上清；
s9、往离心管中加入适量dmem高糖培养液，然后将其转移到多个新培养瓶中，并置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养；
s10、按s4-s9的方法进行传代培养，往第3代细胞的培养箱中置入手机屏幕光源，对照组以锡箔纸包裹避光培养，分别选取12h、18h和24h光照培养的传代细胞进行后续实验；
s11、以上述光照培养的传代细胞和对照组细胞为材料分别提取rna，并检测rna的纯度，rna的a260/280比值应处于1.9-2.0之间，然后以mrna为模板逆转录合成cdna，再以cdna为模板，对人视网膜色素上皮细胞引起炎性因子设计特异引物进行荧光定量pcr，由于引起人视网膜色素上皮细胞损伤的炎性因子包括nf-κb、mcp-1和il-8，因此根据nf-κb、mcp-1和il-8这三种炎性因子的表达量可以判断人视网膜色素上皮细胞的损伤情况。为保证实验的准确性，本实验进行三次重复。其中，nf-κb、mcp-1和il-8这三种炎性因子所采用的引物如下：
荧光定量pcr结束后，将各对照组12h、18h和24h手机屏幕光照培养后人视网膜色素上皮细胞nf-κb、mcp-1和il-8这三种炎性因子的表达量标记为(1±0.00)，并记录各实验组三种炎性因子表达量与对照组三种炎性因子表达量的比值，结果发现，手机屏幕光照12h、18h和24h光照培养后人视网膜色素上皮细胞nf-κb因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.22±0.31)、(1.31±0.43)和(1.44±0.33)倍；mcp-1因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.28±0.12)、(1.36±0.35)和(1.43±0.27)倍；il-8因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.27±0.25)、(1.39±0.52)和(1.48±0.11)倍。由此可见，手机屏幕光照环境下，人视网膜色素上皮细胞会发生一定程度的损伤，并且光照时间的越长，损坏程度越大。
实施例3
一种人工光源视觉系统损伤的评价方法，包括以下步骤：
s1、将存储有人视网膜色素上皮细胞的冻存管迅速放入37℃的水浴中解冻10min；
s2、将解冻后的人视网膜色素上皮细胞转移到离心管中，以12000rpm的转速离心5min，弃除上清；
s3、往离心管中加入5mldmem高糖培养液，轻轻混匀后接种于培养瓶中，然后置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中进行复苏培养，每两天更换一次培养液；
s4、当细胞在培养瓶中长满90％以上后，将培养液弃除，往培养瓶中加入灭菌胎牛血清清洗3遍；
s5、往培养瓶中加入2ml消化液，37℃消化30min；
s6、往含消化液的培养瓶中加入2ml完全培养液，终止消化液的消化作用；
s7、往清洗后的培养瓶中加入1.5ml0.1％edta溶液，轻轻震荡将瓶底内的细胞溶解，使细胞完全脱落成细胞悬液；
s8、将细胞悬液转移到离心管中，并置于离心机中以12000rpm的转速离心5min，弃除上清；
s9、往离心管中加入适量dmem高糖培养液，然后将其转移到多个新培养瓶中，并置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养；
s10、按s4-s9的方法进行传代培养，往第4代细胞的培养箱中置入笔记本屏幕光源，对照组以锡箔纸包裹避光培养，分别选取12h、18h和24h光照培养的传代细胞进行后续实验；
s11、以上述光照培养的传代细胞和对照组细胞为材料分别提取rna，并检测rna的纯度，rna的a260/280比值应处于1.9-2.0之间，然后以mrna为模板逆转录合成cdna，再以cdna为模板，对人视网膜色素上皮细胞引起炎性因子设计特异引物进行荧光定量pcr，由于引起人视网膜色素上皮细胞损伤的炎性因子包括nf-κb、mcp-1和il-8，因此根据nf-κb、mcp-1和il-8这三种炎性因子的表达量可以判断人视网膜色素上皮细胞的损伤情况。为保证实验的准确性，本实验进行三次重复。其中，nf-κb、mcp-1和il-8这三种炎性因子所采用的引物如下：
荧光定量pcr结束后，将各对照组12h、18h和24h笔记本屏幕光照培养后人视网膜色素上皮细胞nf-κb、mcp-1和il-8这三种炎性因子的表达量标记为(1±0.00)，并记录各实验组三种炎性因子表达量与对照组三种炎性因子表达量的比值，结果发现，笔记本屏幕光照12h、18h和24h光照培养后人视网膜色素上皮细胞nf-κb因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.25±0.26)、(1.37±0.52)和(1.46±0.13)倍；mcp-1因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.30±0.32)、(1.39±0.31)和(1.46±0.54)倍；il-8因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.29±0.17)、(1.42±0.76)和(1.53±0.37)倍。由此可见，笔记本屏幕光照环境下，人视网膜色素上皮细胞会发生一定程度的损伤，并且光照时间的越长，损坏程度越大。
实施例4
一种人工光源视觉系统损伤的评价方法，包括以下步骤：
s1、将存储有视网膜神经胶质细胞的冻存管迅速放入37℃的水浴中解冻10min；
s2、将解冻后的视网膜神经胶质细胞转移到离心管中，以10000rpm的转速离心3min，弃除上清；
s3、往离心管中加入3mldmem高糖培养液，轻轻混匀后接种于培养瓶中，然后置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中进行复苏培养，每两天更换一次培养液；
s4、当细胞在培养瓶中长满90％以上后，将培养液弃除，往培养瓶中加入灭菌胎牛血清清洗3遍；
s5、往培养瓶中加入2ml消化液，37℃消化30min；
s6、往含消化液的培养瓶中加入2ml完全培养液，终止消化液的消化作用；
s7、往清洗后的培养瓶中加入1.5ml0.1％edta溶液，轻轻震荡将瓶底内的细胞溶解，使细胞完全脱落成细胞悬液；
s8、将细胞悬液转移到离心管中，并置于离心机中以10000rpm的转速离心5min，弃除上清；
s9、往离心管中加入适量dmem高糖培养液，然后将其转移到多个新培养瓶中，并置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养；
s10、按s4-s9的方法进行传代培养，往第3代细胞的培养箱中置入led灯，对照组以锡箔纸包裹避光培养，分别选取12h、18h和24h光照培养的传代细胞进行后续实验；
s11、以上述光照培养的传代细胞和对照组细胞为材料分别提取rna，并检测rna的纯度，rna的a260/280比值应处于1.9-2.0之间，然后以mrna为模板逆转录合成cdna，再以cdna为模板，对视网膜神经胶质细胞分泌的细胞因子设计特异引物进行荧光定量pcr，由于视网膜神经胶质细胞分泌的细胞因子包括vegf和tgf-β，人视网膜在发生病变时，这两种细胞因子表达量会增加，因此根据vegf和tgf-β这两种细胞因子的表达量可以判断视网膜神经胶质细胞的病变情况。为保证实验的准确性，本实验进行三次重复。其中，vegf和tgf-β这两种细胞因子所采用的引物如下：
荧光定量pcr结束后，将各对照组12h、18h和24hled灯光照培养后视网膜神经胶质细胞vegf和tgf-β这两种细胞因子的表达量标记为(1±0.00)，并记录各实验组两种细胞因子表达量与对照组两种细胞因子表达量的比值，结果发现，led灯光照12h、18h和24h光照培养后视网膜神经胶质细胞vegf细胞因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.21±0.34)、(1.25±0.41)和(1.27±0.37)倍；tgf-β细胞因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.24±0.13)、(1.27±0.35)和(1.29±0.10)倍。由此可见，led灯光照环境下，视网膜神经胶质细胞会发生一定程度的损伤，并且光照时间的越长，损坏程度越大。
实施例5
一种人工光源视觉系统损伤的评价方法，包括以下步骤：
s1、将存储有视网膜神经胶质细胞的冻存管迅速放入37℃的水浴中解冻10min；
s2、将解冻后的视网膜神经胶质细胞转移到离心管中，以11000rpm的转速离心4min，弃除上清；
s3、往离心管中加入4mldmem高糖培养液，轻轻混匀后接种于培养瓶中，然后置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中进行复苏培养，每两天更换一次培养液；
s4、当细胞在培养瓶中长满90％以上后，将培养液弃除，往培养瓶中加入灭菌胎牛血清清洗3遍；
s5、往培养瓶中加入2ml消化液，37℃消化30min；
s6、往含消化液的培养瓶中加入2ml完全培养液，终止消化液的消化作用；
s7、往清洗后的培养瓶中加入1.5ml0.1％edta溶液，轻轻震荡将瓶底内的细胞溶解，使细胞完全脱落成细胞悬液；
s8、将细胞悬液转移到离心管中，并置于离心机中以11000rpm的转速离心5min，弃除上清；
s9、往离心管中加入适量dmem高糖培养液，然后将其转移到多个新培养瓶中，并置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养；
s10、按s4-s9的方法进行传代培养，往第3代细胞的培养箱中置入手机屏幕光源，对照组以锡箔纸包裹避光培养，分别选取12h、18h和24h光照培养的传代细胞进行后续实验；
s11、以上述光照培养的传代细胞和对照组细胞为材料分别提取rna，并检测rna的纯度，rna的a260/280比值应处于1.9-2.0之间，然后以mrna为模板逆转录合成cdna，再以cdna为模板，对视网膜神经胶质细胞分泌的细胞因子设计特异引物进行荧光定量pcr，由于视网膜神经胶质细胞分泌的细胞因子包括vegf和tgf-β，人视网膜在发生病变时，这两种细胞因子表达量会增加，因此根据vegf和tgf-β这两种细胞因子的表达量可以判断视网膜神经胶质细胞的病变情况。为保证实验的准确性，本实验进行三次重复。其中，vegf和tgf-β这两种细胞因子所采用的引物如下：
荧光定量pcr结束后，将各对照组12h、18h和24h手机屏幕光照培养后视网膜神经胶质细胞vegf和tgf-β这两种细胞因子的表达量标记为(1±0.00)，并记录各实验组两种细胞因子表达量与对照组两种细胞因子表达量的比值，结果发现，led灯光照12h、18h和24h光照培养后视网膜神经胶质细胞vegf细胞因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.23±0.23)、(1.26±0.53)和(1.30±0.38)倍；tgf-β细胞因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.25±0.26)、(1.28±0.43)和(1.31±0.23)倍。由此可见，手机屏幕光照环境下，视网膜神经胶质细胞会发生一定程度的损伤，并且光照时间的越长，损坏程度越大。
实施例6
一种人工光源视觉系统损伤的评价方法，包括以下步骤：
s1、将存储有视网膜神经胶质细胞的冻存管迅速放入37℃的水浴中解冻10min；
s2、将解冻后的视网膜神经胶质细胞转移到离心管中，以12000rpm的转速离心5min，弃除上清；
s3、往离心管中加入5mldmem高糖培养液，轻轻混匀后接种于培养瓶中，然后置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中进行复苏培养，每两天更换一次培养液；
s4、当细胞在培养瓶中长满90％以上后，将培养液弃除，往培养瓶中加入灭菌胎牛血清清洗3遍；
s5、往培养瓶中加入2ml消化液，37℃消化30min；
s6、往含消化液的培养瓶中加入2ml完全培养液，终止消化液的消化作用；
s7、往清洗后的培养瓶中加入1.5ml0.1％edta溶液，轻轻震荡将瓶底内的细胞溶解，使细胞完全脱落成细胞悬液；
s8、将细胞悬液转移到离心管中，并置于离心机中以12000rpm的转速离心5min，弃除上清；
s9、往离心管中加入适量dmem高糖培养液，然后将其转移到多个新培养瓶中，并置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养；
s10、按s4-s9的方法进行传代培养，往第4代细胞的培养箱中置入笔记本屏幕光源，对照组以锡箔纸包裹避光培养，分别选取12h、18h和24h光照培养的传代细胞进行后续实验；
s11、以上述光照培养的传代细胞和对照组细胞为材料分别提取rna，并检测rna的纯度，rna的a260/280比值应处于1.9-2.0之间，然后以mrna为模板逆转录合成cdna，再以cdna为模板，对视网膜神经胶质细胞分泌的细胞因子设计特异引物进行荧光定量pcr，由于视网膜神经胶质细胞分泌的细胞因子包括vegf和tgf-β，人视网膜在发生病变时，这两种细胞因子表达量会增加，因此根据vegf和tgf-β这两种细胞因子的表达量可以判断视网膜神经胶质细胞的病变情况。为保证实验的准确性，本实验进行三次重复。其中，vegf和tgf-β这两种细胞因子所采用的引物如下：
荧光定量pcr结束后，将各对照组12h、18h和24h笔记本屏幕光照培养后视网膜神经胶质细胞vegf和tgf-β这两种细胞因子的表达量标记为(1±0.00)，并记录各实验组两种细胞因子表达量与对照组两种细胞因子表达量的比值，结果发现，笔记本屏幕光照12h、18h和24h光照培养后视网膜神经胶质细胞vegf细胞因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.30±0.21)、(1.34±0.36)和(1.38±0.24)倍；tgf-β细胞因子的表达量是对照组(1±0.00)的(1.28±0.62)、(1.33±0.22)和(1.37±0.17)倍。由此可见，笔记本屏幕光照环境下，视网膜神经胶质细胞会发生一定程度的损伤，并且光照时间的越长，损坏程度越大。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。