一种检测猫疱疹病毒的核酸组合、试剂盒和方法与流程

本发明涉及猫疱疹病毒检测
技术领域：
，具体而言，涉及一种检测猫疱疹病毒的核酸组合、试剂盒和方法。
背景技术：
：猫疱疹病毒(fhv)是属于大型的病毒(100～130nm直径)，具有封套及双股的dna，于细胞核内进行增殖，并形成核内包涵体。猫感染fhv后表现出猫鼻性支气管炎(也简称为猫鼻支)是猫最常见的病毒感染。其典型症状以病毒引起的猫呼吸道感染为主，类似感冒的频繁打喷嚏、流鼻涕、咳嗽，发烧，猫精神差，废食。由于病毒侵害猫的眼结膜，所以，还有一个特征是患病的猫会出现流眼泪以致脓性分泌物，结膜水肿，严重的会导致猫的角膜溃疡甚至失明。而目前针对猫猫疱疹病毒病毒检测的试剂盒大多存在操作复杂、特异性差、灵敏度低以及检测结果准确性不高等缺陷。鉴于此，特提出本发明。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测猫疱疹病毒的核酸组合，采用该核酸组合检测猫疱疹病毒具有特异性好、灵敏度高以及检测结果可靠等优点。本发明的另一目的在于提供一种检测猫疱疹病毒的试剂盒，采用该试剂盒检测猫疱疹病毒具有操作方便、特异性好、灵敏度高以及检测结果可靠等优点。本发明的另一目的在于提供一种检测猫疱疹病毒的方法，利用该检测方法检测猫疱疹病毒具有操作方便、检测速度快、特异性好、灵敏度高以及检测结果可靠等优点。本发明是这样实现的：一种检测猫疱疹病毒的核酸组合，其包括用于检测猫疱疹病毒的碱基序列如seqidno.1所示的上游引物和如seqidno.2所示的下游引物。本发明提供的检测猫疱疹病毒的核酸组合，包括seqidno.1所示的上游引物和seqidno.2所示的下游引物，该引物对根据疱疹病毒i型包膜糖蛋白d的基因序列，利用primerpremier5.0软件以及ncbi的blast分析设计得到，避免了引物间的干扰，发卡结构和二聚体等常见问题。上游引物(seqidno.1)：tacttcaagccttacgacca；下游引物(seqidno.2)：tatcaatgccaccatccc。该引物扩增片段大小189bp。该核酸组合不仅可以通过荧光定量pcr方法检测猫疱疹病毒，也可以利用普通pcr结合琼脂糖凝胶电泳对猫疱疹病毒进行检测。利用该核酸组合检测猫疱疹病毒具有更强的特异性和较高的灵敏度，有利于提高检测结果的准确性和可靠度。一种检测猫疱疹病毒的试剂盒，其包括如上所述的核酸组合。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括：荧光定量pcr反应液。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述荧光定量pcr反应液中还含有：sybrgreeni、dntps、mg2+以及热启动dna聚合酶。sybrgreeni染料可以通过实时荧光定量pcr方法对猫疱疹病毒进行检测，在确保特异性和灵敏度的基础上，还大大地提高了检测速度和检测的便捷性。sybrgreeni是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，sybrgreeni发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，sybrgreeni的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出pcr体系存在的双链dna数量。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括：阳性标准品和阴性对照品。进一步地，在本发明的一些实施方案中，阳性标准品为含有阳性核酸序列的pmd18-t载体。阳性核酸序列为seqidno.1所示的上游引物和seqidno.2所示的下游引物的扩增片段。进一步地，在本发明的一些实施方案中，阴性对照品为ddh2o。一种检测猫疱疹病毒的方法，其包括：将如上所述的核酸组合加入至荧光定量pcr反应体系，进行荧光定量pcr反应。本发明提供的检测猫疱疹病毒的方法，利用如上所述的核酸组合进行pcr，具有操作方便、检测速度快、特异性好、灵敏度高以及检测结果可靠等优点。进一步地，在本发明的一些实施方案中，pcr反应体系中含有：sybrgreeni、dntps、mg2+以及热启动dna聚合酶。进一步地，在本发明的一些实施方案中，pcr反应体系中，上游引物的浓度为2-20μmol/l，下游引物的浓度为2-20μmol/l。引物浓度过高或过低均会对扩增结果产生影响。在本发明的一些实施例中，将引物浓度控制在2-20μmol/l的范围，可以避免引起错配和非特异性扩增，并减少引物间形成二聚体的概率，有利于提高扩增效果。优选的，在本发明的一些实施方案中，在pcr反应体系中，上游引物的浓度为10μmol/l，下游引物的浓度为10μmol/l。优选的，在本发明的一些实施方案中，荧光定量pcr反应的退火温度为55-60℃。优选的，在本发明的一些实施方案中，荧光定量pcr反应的退火温度为58℃。优选的，在本发明的一些实施方案中，荧光定量pcr反应的条件包括：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，38-42个循环。退火温度是影响pcr扩增效果例如特异性的重要因素，对于本发明的核酸组合来说，变性后将温度快速冷却至55-60℃，可以减少引物和模板的非特异性结合，提高扩增的特异性。本发明提供的检测方法可以以高特异性、高灵敏度、快速、定量准确对猫疱疹病毒进行荧光定量pcr检测，同时也对今后开展实验用猫的检测工作及实验猫标准化研究具有积极的促进作用，同时通过对猫疱疹病毒携带情况的检测，为猫质量控制标准的制定提供参考依据。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明实验例中的标准曲线图；图2为本发明实验例中的溶解曲线图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。病毒样品由青岛农业大学预防兽医实验室提供。反转录试剂盒(at301)购自全式金生物技术有限公司；实施例1本实施例提供的检测猫疱疹病毒的试剂盒包括：用于检测猫疱疹病毒的引物对，荧光定量pcr反应液、阳性标准品以及阴性对照品。荧光定量pcr反应液(购自mce(中国))含有：sybrgreeni、dntps、mg2+以及热启动dna聚合酶。该引物对包括上游引物和下游引物，上游引物碱基序列为：5’-tacttcaagccttacgacca-3’(seqidno.1)；下游引物碱基序列为：5’-tatcaatgccaccatccc-3’(seqidno.2)。该引物对扩增片段大小为189bp。阳性标准品通过如下方法制备：以猫疱疹病毒dna为模板，用上述的上游引物和下游引物所扩增，扩增片段连接到pmd18-t质粒载体，转入感受态细胞大肠杆菌，经抗性筛选，取阳性单克隆菌落继续培养，采用质粒提取试剂盒(omegabio-tek)提取质粒，质粒经测序和比对，核对正确后使用。阴性对照品为ddh2o。采用本实施例提供的检测猫疱疹病毒的试剂盒的对猫疱疹病毒进行荧光定量检测的方法：1荧光定量pcr反应体系：待测样品dna模板2μl、荧光定量pcr反应液10μl、上游引物10μmol/l、下游引物10μmol/l、加ddh2o至20μl。如果样品是rna病毒，需提取rna后，反转录成cdna后作为模板。2荧光定量pcr反应条件95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环。3结果判定在具体的检测中，可同时设立阳性对照和阴性对照，根据扩增曲线判断结果，阳性对照有明显扩增曲线，阴性对照没有扩增曲线出现，此时，阴性和阳性对照都成立，可进行判断；若待测样品扩增曲线ct值>40，或无扩增曲线，判定为阴性，若ct值<40且扩增曲线良好可直接判定为阳性。实验例1制作标准曲线将上述阳性标准品进行10倍梯度稀释，分别取1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106拷贝/μl，以每个稀释度作为模板，按实施例1的方法进行荧光定量pcr扩增，得到扩增反应的标准曲线，如图1所示，线性回归方程为：y＝-3.4049x+35.439，r2＝0.9914。由此，采用实施例1提供的猫疱疹病毒试剂盒在质粒浓度为101-106拷贝/μl的浓度范围内具有良好的线性关系。实验例2溶解曲线的结果如图2所示，扩增产物的溶解温度tm为77.1-77.6℃，无非特异性产物峰和引物二聚体。实验例3灵敏度检测取阳性标准品原液1.2×106拷贝/μl，进行10倍梯度稀释至1.2×101，采用实施例1的试剂盒和方法进行荧光定量pcr扩增，确定其最低检测限，结果如表1所示，在1.2×101copies/μl浓度上具有良好的扩增曲线，ct值为31.23，小于40，能够实现对样品的检测，说明实施例1的试剂盒具有较高的灵敏度。表1阳性标准品(copies/μl)ct值1.2×10614.781.2×10517.661.2×10420.151.2×10323.681.2×10228.571.2×10131.23实验例4特异性检测猫杯状病毒(fcv)、frtv、猫泛白胞减少症病毒(fpv)、犬瘟热病毒(cdv)、猫疱疹病毒(fhv)以及猫肠道冠状病毒((fecv))的dna或cdna为模板，采用实施例1的试剂盒和方法进行荧光定量pcr扩增，结果显示，仅有猫疱疹病毒样品有扩增曲线，其他病毒未有明显的扩增曲线，由此说明采用实施例1的猫疱疹病毒检测试剂盒和方法具有良好的特异性。实验例5重复性选取3个阳性标准品，采用实施例1的试剂盒和方法进行荧光定量pcr；结果显示，阳性标准品的ct值重复性试验cv值小于1％，说明方法的重复性好。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>青岛维特莱博生物科技有限公司<120>一种检测猫疱疹病毒的核酸组合、试剂盒和方法<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1tacttcaagccttacgacca20<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2tatcaatgccaccatccc18当前第1页12