本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有调控骨骼肌肌母细胞成肌分化功能的寡核苷酸，药物及其用于促进骨骼肌损伤修复的应用方法。
背景技术
骨骼肌损伤是事故创伤、灾害损伤、运动损伤或化学毒物所致损伤的常见病。骨骼肌损伤后自然愈合过程缓慢，愈合能力有限，常常伴有肌肉纤维瘢痕形成，功能恢复常常不完全，严重者甚至丧失运动能力。传统治疗骨骼肌损伤的方法包括休息、冰敷、加压、抬高患肢、热疗、水浴等，治疗过程漫长，疗效较差。目前临床上尚缺乏特别有效的骨骼肌损伤治疗方法。因此，如何有效预防骨骼肌损伤后修复不良，有效地促进骨骼肌再生愈合，提高骨骼肌的愈合质量，成为再生医学领域极具挑战性的世界难题。
骨骼肌损伤后的自然病理过程可分为三期：①炎症期：肌肉损伤处血肿形成，损伤肌肉坏死、退化。中性粒细胞浸润，巨噬细胞趋化到损伤处吞噬坏死组织；②修复期：位于损伤肌肉周围处于静止期的卫星细胞，受细胞因子刺激活化，趋化到损伤处增殖、分化形成新生肌管，并与残余的肌纤维融合；同时伴有成纤维细胞增殖，如果损伤范围过大，成纤维细胞的过度增殖分化形成瘢痕性组织，从而造成骨骼肌的愈合失常和功能不良；③塑形期：再生骨骼肌成熟，瘢痕组织机化。
损伤的骨骼肌经自然愈合往往不能完全恢复到损伤前的功能状态，最近研究表明其主要原因是骨骼肌肌母细胞增殖分化与成纤维细胞的增殖分化失衡有关。故当前促进骨骼肌修复的研究主要集中在剌激骨骼肌肌母细胞增殖分化和抑制损伤骨骼肌纤维化两个方向。
microrna作为一类具有生物学活性的非编码小分子rna，参与了各种组织器官发育和疾病的发生、发展调控过程。dicer基因编码的蛋白是mirna成熟加工过程中所必需的核酸内切酶。组织条件性敲除dicer基因后小鼠的骨骼肌发育出现异常(骨骼肌组织含量减少，肌纤维形态异常等)，表明mirna在骨骼肌发育过程中发挥重要作用。
研究报道蛇心脏毒素(cardiotoxin，ctx)致伤小鼠骨骼肌再生过程中mir-1和mir-125b表达量上调，胰岛素样生长因子2(igf-2)(mir-125b下游靶基因)表达量增加，igf-2调节成肌细胞分化，从而促进新生肌纤维的再生融合进程。诸多mirna参与调控损伤骨骼肌的再生修复过程，提示外源性寡核苷酸的应用可能成为促进骨骼肌损伤修复的一种有效方法。
研究发现发育印迹基因h19在人和小鼠胚胎中广泛表达，具有调控胚胎生长、胎儿发育及小儿行为发展等重要功能。最新研究表明h19基因的转录本内包含有mir-675，并且其转录本在成年小鼠骨骼肌中呈持续性高表达，提示h19基因通过mrna参与了骨骼肌的发育与功能调控。
技术实现要素：
本发明针对上述问题，目的在于提供一种寡核苷酸、包含该寡核苷酸的药物及应用方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明实施例公开了一种寡核苷酸，其包含如seqidno:1和seqidno:2所示序列。
另一方面，本发明实施例公开了一种药物，其包含上述寡核苷酸。
进一步地，本发明实施例公开上述寡核苷酸及包含该寡核苷酸药物的应用方法：注射位点为损伤骨骼肌与正常组织交界边缘四个对角；注射深度为损伤骨骼肌与正常组织边缘内侧中心；注射剂量为目的寡核苷酸生理盐水溶液200nm/位点/次(体积为50ul)；注射时间(次数)为损伤后第7天、第12天、第17天分别注射1次(共3次)。
第三方面，所述骨骼肌损伤包括急性顿挫伤、挤压伤、爆炸伤或化学物质所致的骨骼肌损伤。
第四方面，本发明实施例公开了上述寡核苷酸用于治疗骨骼肌损伤。
第五方面，本发明实施例公开了上述药物用于治疗骨骼肌损伤的应用方法。
本发明的有益效果是：
经实验证明，本发明实施例公开的寡核苷酸及其制成的药物，在骨骼肌损伤愈合过程中，该寡核苷酸序列具有显著地抑制转录因子samd4表达，进而促进骨骼肌肌母细胞成肌分化的生物学功能。该寡核苷酸及含该寡核苷酸之药物的应用方法具有成本低、操作简便、无风险，促进骨骼肌损伤后新生肌纤维再生修复快，骨骼肌功能恢复良好的优点。
附图说明
图1为添加目的寡核苷酸或对照序列培养72h后c2c12细胞成肌分化形态和肌细胞生成素基因(myogenine,myog)与肌球蛋白重链基因(myosinheavychain,mhc)的转录表达分析，其中，左侧图中右下标尺表示50μm，右侧图中*符号表示实验组与对照组比较p<0.01。
图2为添加目的寡核苷酸或对照序列培养72h后c2c12细胞表达smad4蛋白的结果，其中，beta-actin作为免疫印迹分析内参。
图3为小鼠后腿胫骨前肌心脏毒素(cardiotoxin，ctx)损伤局部微量注射目的寡核苷酸或对照序列处理21天后修复组织h&e染色、结蛋白(desmin)免疫组化染色和再生骨骼肌纤维横切面积分析，其中，左侧图中右下标尺表示50μm，右侧图中*符号表示实验组与对照组比较p<0.01。
图4为后腿胫骨前肌心脏毒素(cardiotoxin，ctx)损伤局部微量注射目的寡核苷酸或对照序列处理28天后的小鼠跑步测试评估骨骼肌愈合质量结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对临床上尚未有调控骨骼肌细胞成肌分化发挥促愈作用的有效方法，本发明拟解决的技术问题是提供一条具有调控骨骼肌肌母细胞成肌分化的寡核苷酸及其促进损伤骨骼肌修复的应用方法。
目的寡核苷酸序列如序列表中seqidno:1和seqidno:2所示。
除了上述目的寡核苷酸序列外，还包括含有seqidno:1和seqidno:2所示序列药物。上述促进损伤骨骼肌修复的应用方法是指：注射位点为损伤骨骼肌与正常组织交界边缘四个对角；注射深度为损伤骨骼肌与正常组织边缘内侧中心；注射剂量为目的寡核苷酸生理盐水溶液200nm/位点/次(体积为50ul)；注射时间(次数)为损伤后第7天、第12天、第17天分别注射1次(共3次)。所述目的寡核苷酸在骨骼肌肌母细胞内可抑制转录因子samd4的表达。所述目的寡核苷酸及含有该寡核苷酸药物，可用于骨骼肌损伤后的治疗。所述骨骼肌损伤包括急性顿挫伤、挤压伤、爆炸伤或化学物质所致的骨骼肌损伤。
其中，
目的寡核苷酸序列(双链)：
seqidno:1正义链：5’-cuguaugcccucaccgcuca-3’
seqidno:2反义链：3’-gacauacgggaguggcgagu-5’
实施例1目的寡核苷酸促进骨骼肌肌母细胞成肌分化
根据对小鼠各组织基因转录本的高通量分析，发现h19基因的转录本在成体骨骼肌中显著性高表达，利用q-pcr验证了这一结果。基于此提出以rna发挥功能的h19印迹基因具有调控骨骼肌发育与功能的科学假设。应用公开的基因功能分析软件从h19转录本中筛选出1条具有潜在功能的寡核苷酸，选用小鼠骨骼肌肌母细胞株c2c12作为体外模型，探讨目的寡核苷酸对c2c12细胞的增殖分化作用。
c2c12细胞培养：细胞株购自美国atcc公司，按照atcc公布的方法培养。即细胞系接种于25cm2培养瓶中，在含10％胎牛血清、1000u/ml青霉素、100ug/ml的高糖dmem培养基(growthmedium,gm)中，置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养和传代，保持细胞不完全汇合，每2-3d传代一次。传代细胞记录好传代代数，每次实验的各组均使用同一代数的细胞。
c2c12细胞诱导成肌分化：将生长状态良好的c2c12细胞传代接种于细胞培养板(corningcostar公司，6孔板，约8000个细胞/孔)在gm培养基中生长至约60％的融合度时，弃去原培养基，以pbs洗1次，实验组换用含有工作浓度为150nm目的寡核苷酸(委托广州锐博生物科技有限公司合成)gm培养基中继续培养3天(每组3个复孔，独立重复3次实验)进行成肌分化诱导，换液48h/次。同时设置平行对照组，对照组除应用的对照序列(双链rna，正义链：5’-uuuguacuacacaaaaguacu–3’；反义链：5’-aguacuuuuguguaguacaaa–3’)外，其它处理同实验组。倒置显微镜观察成肌分化各时相点细胞的形态学改变，并采集图像。在分化诱导72h时收集细胞，提取rna，对骨骼肌早期分化标记分子成肌素myog(myogenin)和晚期分化标记分子mhc(myosinheavychain)的转录水平进行rt-qpcr定量检测。
细胞总rna的提取选用invitrogen公司trizol试剂，定量rt-pcr选用宝生物工程(大连)有限公司的逆转录和
表1定量pcr引物
两步法进行定量rt-pcr反应
a.逆转录反应
a.反应体系如下：
b.反应条件：
b.pcr反应
a.25ul反应体系如下：
b.反应条件：
定量pcr反应在abi
结果：对照组c2c12细胞形态较均一，呈扁平梭形，胞体较大，折光性强，呈分裂增殖状态；实验组在加入目的寡核苷酸诱导3d后，细胞呈细长梭形，多个细胞首尾相接形成纵横交错的细长纤维束状的肌管(图1)。定量pcr分析表明：与对照组比较，实验组细胞的myog和mhc转录水平分别提高了约9倍和50倍。
结论：目的寡核苷酸可有效促进骨骼肌肌母细胞成肌分化。
实施例2目的寡核苷酸抑制骨骼肌肌母细胞smad4的表达
研究发现目的寡核苷酸可有效促进骨骼肌肌母细胞成肌分化，提示目的寡核苷酸可能具有通过调控骨骼肌细胞的周期蛋白，进而促进骨骼肌损伤修复的功能。研究表明tgf-β—smad信号通路在骨骼肌损伤愈合过程中起着重要的调控作用。smad蛋白家族成员作为tgf-β下游的受体激酶，在tgf-β信号通路中扮演着重要的介导功能。根据结构和功能的不同，smads被分为3个亚族：受体激活型(包括smad1/2/3/5/8)、受体抑制型(包括smad6/7)和通用型(smad4)。smad4与其它smad蛋白分子协同作用是tgf-β超家族信号转导途径的关键环节，其不仅调控下游基因的表达，而且参与相关信号通路的交互对话。因此，我们推测目的寡核苷酸可能介导了smad4的表达，从而促进骨骼肌细胞成肌分化。为此，选用小鼠骨骼肌肌母细胞株c2c12作为体外模型，探讨目的寡核苷酸调控增殖后期c2c12细胞的smad4表达特点。
方法和步骤：
(1)c2c12细胞培养与分化
细胞培养与诱导分化的条件同优选实施例1。实验设对照组(gm培养基培养)和诱导分化组(gm培养基+150nm目的寡核苷酸共培养)(目的寡核苷酸委托广州锐博生物科技有限公司合成)，每组3个复孔；独立重复3次实验。
(2)细胞蛋白提取
细胞诱导分化培养72h后，去掉6孔细胞培养板中的培养基，加入0.5ml4℃预冷的蛋白裂解液(赛默飞世尔科技有限公司)，使用移液枪反复吹打培养板底部，然后放置冰上裂解30min，1200rpm、4℃离心15min，吸取上清至新的1.5ml离心管中，于-20℃冰箱保存。
(3)sds-page电泳
①玻璃板对齐后放入夹中卡紧,然后垂直卡在架子上，准备灌胶；
②当水和分离胶层之间出现一条折射线时，再等3-5min使胶充分凝固，然后倒去分离胶上层的水，并用吸水纸将水吸干；
③配制4％浓缩胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶。剩余空间灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中(插梳子时要使梳子保持水平)。等浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出；
④用自来水冲洗浓缩胶后，将其放入电泳槽中；
⑤取出上样样品至200μl的ep管中，加入5×sds上样缓冲液至终浓度为1×。将样品于沸水中煮5min使蛋白变性，冰上冷却，用微量进样器取10μl蛋白样品(20μg总蛋白/样品)上样，缓慢加入；
⑥电泳：首先80v恒压条件下让样品跑至分离胶，然后改为120v恒压条件使样品跑到胶底，终止电泳，进行转膜。
(4)转膜
①将膜切成与凝胶尺寸大小一致，置于甲醇中浸透10秒后立即转入转膜液中平衡20min；
②转移：用3张滤纸贴于2张多孔垫料，将pvdf膜和胶夹于中间(膜位于正极方向)，在400ma条件下转膜120min；
③立春红染色，肉眼确认蛋白条带已转移至膜上。
(5)杂交
①将pvdf膜浸于含5％脱脂奶粉的tbst于摇床(50rpm)中常温下封闭2h；
②将封闭的膜转移至含一抗(小鼠smad4单克隆抗体，购于santacruzbiotechnology公司，工作浓度稀释比例1：500)、含5％脱脂奶粉的tbst于4℃摇床中过夜；
③洗膜：用tbst漂洗3次，10min/次；
④将膜转移至含有二抗(hrp标记山羊抗小鼠igg,购于beyotimebiotechnology公司，工作浓度稀释比例1：5000)和5％脱脂奶粉的tbst中，于室温摇床孵育2h；
⑤洗膜：用tbst漂洗3次，10min/次。
(6)化学发光检测
①膜显色：选用化学发光试剂盒(
②在e-gelimager凝胶成像系统中扫描，完成灰度分析。
结果：目的寡核苷酸处理组细胞smad4蛋白表达量(smad4/beta-actin)显著降低，仅相当于对照组的40％(图2)。
结论：目的寡核苷酸通过抑制smad4蛋白表达发挥促进骨骼肌肌母细胞成肌分化。
实施例3创缘微量注射目的寡核苷酸可显著促进损伤骨骼肌肌纤维的再生
基于上述实施例发现目的寡核苷酸具有促进c2c12细胞成肌分化的功能，推测在损伤骨骼肌局部外源性添加目的寡核苷酸可能加快增殖后的骨骼肌肌母细胞的成肌分化进程，从而促进新生肌纤维的融合和结构重朔。故拟筛选出使用目的寡核苷酸的优选方案，通过he染色和免疫组织化学观察损伤骨骼肌的再生进程，分析新生骨骼肌纤维大小，评估目的寡核苷酸的治疗效果。
(1)骨骼肌损伤再生模型的制备：8-12周龄balb/c小鼠雌雄各3只(购置并寄养于第三军医大学实验动物中心)，每只小鼠双后腿胫骨前肌中心部位分别注射50ul×10umctx制备骨骼肌化学性物质致伤小鼠模型。
(2)微量注射目的寡核苷酸的优化方案：在损伤后第7天开始在左后腿胫骨前肌损伤周缘注射目的寡核苷酸(委托广州锐博生物科技有限公司合成)生理盐水溶液，右腿对应部位注射同体积pbs(作对照处理)。注射位点为损伤骨骼肌与正常组织交界边缘四个对角；注射深度为损伤骨骼肌与正常组织边缘内侧中心；注射剂量为200nm/位点/次(体积为50ul)；注射时间(次数)为损伤后第7天、第12天、第17天分别注射1次(共3次)。
(3)取材与石腊切片制备：致伤后第21天将小鼠脱臼处死，立即取下胫骨前肌ctx致伤骨骼肌组织，长×宽×厚约为0.5cm×0.5cm×0.5cm，按下列步骤制作切片。
①固定：10％甲醛，室温，2天；
②脱水：75％乙醇，37℃，2h→80％乙醇，37℃，2h→90％乙醇，37℃，2h→95％乙醇(ⅰ)，室温，过夜→95％乙醇(ⅱ),37℃，1h→无水乙醇(ⅰ)，37℃，1h→无水乙醇(ⅱ)，37℃，1h；
③透明：二甲苯(ⅰ),37℃，10min→二甲苯(ⅱ),37℃，10min，→二甲苯(ⅲ),37℃，10min；
④浸蜡：石蜡(ⅰ)，60℃，30min→石蜡(ⅱ)，60℃，40min→石蜡(ⅲ),60℃，40min；
⑤石蜡包埋：应用leicaeg1150全自动组织包埋机，按说明书操作完成；
⑥石蜡切片：应用leicarm2255全自动轮转切片机，按说明书操作完成；
⑦切片烘干与放置备用：将切片分割开，投入到40℃的温水浴中展片(leicahi1220摊片机)后贴片至载玻片上，在烫板(leicahi1210烤片机)上60℃烤干。
(4)切片he染色：组织切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。无水乙醇中浸泡5分钟；95％乙醇中浸泡5分钟；70％乙醇中浸泡5分钟；最后入蒸馏水浸泡2分钟；将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色5分钟。酸水及氨水中分色，各数秒钟。流水冲洗5分钟后入蒸馏水片刻。入70％和90％酒精中脱水各5分钟。入酒精伊红染色液染色2—3分钟。染色后经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明，用中性树胶封片。
(5)desmin免疫荧光染色：
①脱蜡：二甲苯(ⅰ),5min→二甲苯(ⅱ),5min→100％乙醇，2min→95％乙醇，1min→80％乙醇，1min→75％乙醇，1min→蒸馏水洗，2min；
②3％h2o2室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；
③过氧化酶(3％甲醇)阻断溶液，常温10min；pbs漂洗，5min×3次；
④5％山羊血清封闭，37℃孵育30min；pbs漂洗，5min×3次；
⑤加入一抗(鼠源单克隆desmin抗体，购自santacruzbiotechnology公司，稀释浓度1：500)4℃摇床中孵育18h；pbs漂洗，10min×3次；
⑥加入二抗(cy3标记山羊抗小鼠igg,购于beyotimebiotechnology公司，工作浓度稀释比例1：5000)，37℃孵育1h；pbs漂洗，10min×3次；
⑦dapi染核1min，pbs漂洗，2min；
⑧用中性树胶封片保存，待观察。
(6)照相与统计分析：用正置显微镜(olypumsbx53)×20倍镜下观察损伤骨骼肌的再生情况(包括形态与结构、炎性细胞浸润、新生肌纤维大小等)，同时应用nikondigitalsightds-fil照像机抓取图像，每个样本随机摄取10个视野，每个视野中随机选10个新生肌纤维，采用thevolocity软件(version6.1；perin-elmer)测量新生肌纤维的大小。选用unpairedstudent’st-test统计比较实验组与对照组中新生肌纤维的相对大小。
结果：目的寡核苷酸处理组的新生肌纤维明显比对照组粗大、结构完整、纹理清晰，对照组骨骼肌修复组织尚伴有大量炎性细胞浸润(图3中he染色结果所示)；desmin染色进一步显示了目的寡核苷酸处理组的新生肌纤维比对照组粗大，结构纹理完整有序(图3中desmin免疫组化结果所示)，目的寡核苷酸处理组再生骨骼肌纤维横切面积大于600cm2的百分率显著高于对照组，且小于600cm2的百分率显著低于对照组(图3中再生骨骼肌纤维横切面积统计分析结果所示)。
结论：采用优选的目的寡核苷酸微量注射方案可以有效地促进损伤骨骼肌的新生肌纤维再生和结构重塑。
实施例4目的寡核苷酸可以显著地促进小鼠损伤骨骼肌的功能恢复
实验过程
前述实施例结果表明目的寡核苷酸可以通过抑制smad4基因的表达，进而加速骨骼肌肌母细胞的分化，促进新生骨骼肌纤维的形成。为评估目的寡核苷酸是否具有促进损伤骨骼肌的功能恢复，拟通过小鼠的跑步测试试验进行评估。
实验小鼠：选用8-10周龄balb/c小鼠作为受试对象，分为正常组、致伤对照组和致伤目的寡核苷酸(委托广州锐博生物科技有限公司合成)治疗组，每组6只，雌雄各3只。ctx损伤双后腿胫骨前肌小鼠模型的制备同优选实施例3。致伤治疗组小鼠双后腿均接受目的寡核苷酸局部微量注射治疗，治疗方案同优选实施例3中所述。致伤对照组小鼠双后腿接受微量pbs局部注射，处理方案同优选实施例3。
跑步实验：3组小鼠在完全相同的条件下饲养，跑步实验从损伤治疗后第28天开始进行。跑步测试在平板跑步机(exer3/6columbusinstruments)上进行。实验分为训练和正式测试两个阶段。跑步机条件设置：20度下坡倾斜角，起始速度10米/分钟，3分钟后，以1米/分钟的加速度增速至20米/分钟，然后以20米/分钟的速度一直跑到小鼠疲劳为止，设置小鼠停在刺激器上的次数为100(示为疲劳表现)。正式测试前训练两次，隔天进行。训练结束第3天开始正式测试，隔天进行测试1次，总共测试3次。
结果：目的寡核苷酸治疗组小鼠跑步持续时间显著长于ctx损伤对照处理组；治疗组小鼠的运动能力接近于正常组(图4)。
结论：目的寡核苷酸可以有效地促进损伤骨骼肌的功能恢复。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
序列表
<110>中国人民解放军陆军军医大学
<120>促进骨骼肌损伤修复的寡核苷酸、药物及应用
<130>18p99008-cn
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工合成(artificialsequence)
<400>1
cuguaugcccucaccgcuca20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工合成(artificialsequence)
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gacauacgggaguggcgagu20
<210>3
<211>24
<212>dna
<213>人工合成(artificialsequence)
<400>3
atgacatcaagaaggtggtgaagc24
<210>4
<211>24
<212>dna
<213>人工合成(artificialsequence)
<400>4
gaagagtgggagttgctgttgaag24
<210>5
<211>22
<212>dna
<213>人工合成(artificialsequence)
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tccaaaccgtctctgcactgtt22
<210>6
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<213>人工合成(artificialsequence)
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<213>人工合成(artificialsequence)
<400>7
agcgcaggctcaagaaagtgaatg24
<210>8
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<213>人工合成(artificialsequence)
<400>8
ctgtaggcgctcaatgtactggat24