本发明涉及水产微生物应用
技术领域：
，具体涉及一种粪产碱杆菌及其筛选方法和应用。
背景技术：
：过量的氮素对水生动物具有一定的毒害作用,因此,养殖水体氮素的有效去除是水产业亟待解决的问题之一。养殖废水生物脱氮是目前水处理领域关注和研究的热点。养殖池塘是一个有机负荷高的自养型生态系统，它生物种类少，食物网简单，自身调节能力弱，稳定性差。养殖动物和底质沉积是氮、磷输出的主要途径，凡纳滨对虾养殖过程中总输入营养中14％～53％的氮沉积到底泥中，14％～28％存在于养殖水体中，造成了巨大的资源浪费和环境污染。而粪产碱杆菌通常具有强的脱氮能力。粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)广泛存在于在土壤等环境中，是一种微好氧型的固氮菌，对富营养化水体及养殖废水中的氨氮和cod具有很强的去除能力。针对不断恶化的养殖环境，急需筛选具备更高效脱氮和降解有机物能力的好氧型粪产碱杆菌，为水产养殖水环境优化提供新的可用菌株。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供一种粪产碱杆菌及其筛选方法和应用，具备更高效脱氮和降解有机物能力，对水产养殖水环境优化具有有益效果。为解决上述问题，本发明在于提供一种粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)y311，该菌分离自罗非鱼养殖水环境底泥，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：中国广州市先烈中路100号大院59号广东省微生物所实验楼五楼，邮编：510075，保藏日期是2018年4月3日，保藏编号为：gdmccno.60350。一方面，本发明在于提供上述粪产碱杆菌y311在治理水产养殖水环境污染中的用途。进一步地，所述粪产碱杆菌y311在降解水产养殖水环境中铵态氮、硝酸盐氮和cod中的用途。进一步地，所述水产养殖水环境是指罗非鱼养殖水环境。另一方面，本发明还提供了一种生物菌抑制剂，该生物菌抑制剂的活性成分为粪产碱杆菌y311的菌株粉剂、代谢产物、发酵液等。进一步地，所述粪产碱杆菌y311的最终浓度为106cfu/ml。另一方面，本发明提供一种筛选本发明所述的粪产碱杆菌y311的方法，具体步骤如下：1)取罗非鱼养殖水环境底泥于灭菌富集培养基，置于摇床进行富集培养；2)取步骤1)的上清液，梯度稀释后涂布在分离培养基培养，3)取步骤2)所得单菌落反复纯化培养，将纯化后的菌株于液体lb培养基中培养富集，4)将富集的菌株接种于富集培养基经复筛获得粪产碱杆菌y311。进一步地，所述富集培养基为乙酰胺2.0g，naoh0.6g，mgso4·7h2o0.05g，k2hpo48.2g，kcl0.5g，cuso4·5h2o0.5mg，caso4·2h2o0.5mg，znso4·7h2o0.5mg，fecl30.5mg，蒸馏水1000ml，ph7.0。进一步地，所述富集培养过程如下：a)取罗非鱼养殖水环境底泥于灭菌富集培养基，置于摇床中27℃，140rpm/min培养5d；b)取步骤a)上清液加入灭菌富集培养基，置于摇床中27℃，140rpm/min培养5d；c)取步骤b)上清液加入灭菌富集培养基，置于摇床中27℃，140rpm/min培养5d。进一步地，分离培养基为乙酰胺2.0g，naoh0.6g，mgso4·7h2o0.05g，k2hpo48.2g，kcl0.5g，cuso4·5h2o0.5mg，caso4·2h2o0.5mg，znso4·7h2o0.5mg，fecl30.5mg，琼脂14g，蒸馏水1000ml，ph7.0。进一步地，步骤2)中培养的条件为在生化培养箱中恒温30℃倒置培养2d。进一步地，所述步骤3)中反复纯化培养是指挑选步骤2)中生长快速、菌落边界明晰的单菌落在分离培养基中按步骤2)的培养条件培养。进一步地，所述液体lb培养基为胰蛋白胨10g，酵母提取物105g，nacl10g，蒸馏水1000ml，ph7.5。进一步地，所述步骤3)中培养富集的条件为27℃，200rpm/min培养16h。进一步地，所述步骤4)中复筛采用如下方式：菌株以107cfu/ml的接种量接种于富集培养基中，空白对照加入等体积的生理盐水，7d后测定各组氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、总氮、cod以及总磷的含量，选取对n素去除效果最佳的菌株即为粪产碱杆菌y311。粪产碱杆菌y311的菌落形态为：在lb平板上30℃培养12h后可形成扁平、圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落直径1～2mm。需氧，革兰氏阴性菌。最适生长ph值：6.5-7.5，最适生长温度：30-38℃，最适盐度0-10‰。有益效果本发明提供一种粪产碱杆菌及其筛选方法和应用，从罗非鱼养殖水环境底泥中筛选出对铵态氮、硝酸盐氮和cod的环境益生菌——粪产碱杆菌y311。该粪产碱杆菌y311能够在7d内对养殖废水中氨氮的去除率达到60.3％，对硝酸盐氮的去除率达到74.7％，对cod的去除率达到36.7％。本发明为在有氧条件下高效降解氨氮、硝酸盐氮和cod的环境益生菌，具有较强的应用价值。附图说明图1粪产碱杆菌y311的16srdna基因序列的nj系统进化树；图2粪产碱杆菌y311分离纯化图；图3粪产碱杆菌y311革兰氏染色后形态图；图4粪产碱杆菌y31116srdna基因pcr扩增图；图5粪产碱杆菌y311对nh4+-n的处理效果；图6粪产碱杆菌y311对no3--n的处理效果；图7粪产碱杆菌y311对cod的处理效果。具体实施方式材料试验所用样品采集于中国水产科学研究院珠江水产研究所高要水产良种基地罗非鱼养殖池塘底泥。培养基：液体lb培养基：胰蛋白胨(10g)，酵母提取物(105g)，nacl(10g)，蒸馏水1000ml，ph7.5。固体lb培养基：在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加琼脂15-20g/l。富集培养基：乙酰胺(2.0g)，naoh(0.6g)，mgso4·7h2o(0.05g)，k2hpo4(8.2g)，kcl(0.5g)，cuso4·5h2o(0.5mg)，caso4·2h2o(0.5mg)，znso4·7h2o(0.5mg)，fecl3(0.5mg)，蒸馏水1000ml，ph7.0。分离培养基：乙酰胺(2.0g)，naoh(0.6g)，mgso4·7h2o(0.05g)，k2hpo4(8.2g)，kcl(0.5g)，cuso4·5h2o(0.5mg)，caso4·2h2o(0.5mg)，znso4·7h2o(0.5mg)，fecl3(0.5mg)，琼脂14g，蒸馏水1000ml，ph7.0。主要试剂和仪器革兰氏快速染色液(珠海贝索生物有限公司),api20ne试剂盒(biomerieux),细菌dna提取试剂盒(omega),taq酶(takara),光学显微镜(zeiss),pcr仪器(sensoquest),恒温摇床(华利达实验设备有限公司)等。下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1菌株的筛选1菌种的富集与分离纯化1)粪产碱杆菌的富集(1)取4.5g罗非鱼养殖池塘底泥于100ml灭菌富集培养基中，置于摇床中27℃，140rpm/min培养5d；(2)取(1)中的上清10ml加入100ml灭菌富集培养基中，相同条件培养5d；(3)取(2)中的上清10ml加入100ml灭菌富集培养基中，相同条件培养5d。2)粪产碱杆菌的分离纯化(1)取富集过程中步骤(3)中的上清100ul，依次从10倍梯度稀释至106倍，分别涂布至分离培养基上，在生化培养箱中恒温30℃倒置培养2d；(2)挑选生长快速、菌落边界明晰的单菌落在分离培养基中反复纯化(纯化后效果如图2所示)；(3)将获得的6株菌株经过纯化后于液体lb培养基中27℃，200rpm/min培养16h，取0.5ml培养液于灭菌后的80％的甘油，混匀后置于-80℃冰箱保存备用。3)优势粪产碱杆菌的复筛(1)将获得6株菌株以107cfu/ml的接种量接种于富集培养基中，空白对照加入等体积的生理盐水，7d后测定各组氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、总氮、cod以及总磷的含量；(2)选取对n素去除效果最佳的菌株用于进一步研究。2菌种y311的鉴定1、对粪产碱杆菌y311的鉴定对粪产碱杆菌y311进行了形态学观察及染色、生化鉴定、16srdna基因序列克隆及序列分析，通过进化树分析，最终从分子水平上确定菌种y311为粪产碱杆菌。1)形态学观察与染色将菌株y311划线接种于lb平板上，置于30℃恒温培养箱中培养12h，观察菌落形态。挑选单菌落置于滴有生理盐水的载玻片上，涂布均匀后通过革兰氏染色在光学显微镜下观察菌体形态。(形态如图3所示)2)生化鉴定将纯化培养的菌株用api20ne试剂盒进行检测，操作方法详见试剂盒说明书。并参照伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)中细菌生理生化指标进行确认。3)16srrna基因序列克隆及序列分析用细菌dna提取试剂盒(omega)抽提细菌基因组dna，步骤参照说明书。以基因组dna为模板，27f:5’–agagtttgatcctggctcag-3’,1492r:5’–tacggctaccttgttacgactt-3’，扩增细菌的16srdna基因片段。pcr扩增的反应条件为：95℃4min；95℃30s，53℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测(结果如图4所示)，扩增产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。通过genbank中的blast程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行序列同源性分析，并下载相关细菌16srrna基因序列，通过clustalx软件进行多重比对，用mega7软件中邻接法(neighborjoining,nj)构建分子系统进化树并通过自检分析(boostrap)进行置信度检测，自检数据集为1000次。三、菌落形态与生理生化特性：粪产碱杆菌y311的菌落形态特征：在lb琼脂平板上30℃培养12h后可形成扁平、圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落直径1～2mm。需氧，革兰氏阴性菌。最适生长ph值：6.5-7.5，最适生长温度：30-38℃，最适盐度0-10‰。粪产碱杆菌y311的生理生化特性：菌株y311的羊蜡酸同化、苹果酸同化、枸橼酸钠同化、苯乙酸同化和细胞色素氧化酶实验检测为阳性，可以利用羊蜡酸、苹果酸、枸橼酸钠和苯乙酸。硝酸盐还原、吲哚、葡萄糖发酵型产酸、精氨酸双水解、脲酶、蛋白酶水解、α-葡萄糖苷酶水解、β-半乳糖苷酶、葡萄糖同化、阿拉伯糖同化、甘露糖同化、甘露醇同化、乙酰葡萄糖胺同化、麦芽糖同化、葡萄糖酸钾同化、己二酸同化实验检测为阴性，不能利用硝酸盐、左旋色氨酸、葡萄糖、左旋精氨酸、尿素、七叶苷柠檬酸铁、凝胶、4-硝基苯-β-d-吡喃半乳糖苷、左旋阿拉伯糖、右旋甘露糖、右旋甘露醇、n-乙酰基葡萄糖胺、d-麦芽糖、葡萄糖酸钾、己二酸。通过对菌株y311进行pcr扩增和测序，测得其16srrna基因片段为1382bp，其碱基序列如seqidno.1所示。使用ncbi网站对菌株y311的16srdna序列与数据库中各种菌的16srdna序列进行比对。登陆ncbi网站(美国国立生物技术中心网站)，使用blast在线将得到的16srdna序列提交到ncbi核酸数据库中，进行blast在线分析，结果表明序列与已报道的粪产碱杆菌16srrna基因序列(登录号:nzcp013119.1)同源性达100％。下载genbank中相关细菌16srrna基因序列，通过clustalx软件进行多重比对，用mega7软件中邻接法(neighborjoining,nj)构建分子系统进化树(图1)，结果显示，菌株y311和粪产碱杆菌在一个分支中，且菌株y311与其中的粪产碱杆菌alcaligenesfaecalisstrainsag5(gq422443.1)的亲缘关系最近。由此证明，菌株y311为粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)。.综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，菌株y311命名为粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)y311。粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)y311为新的菌株，已于2018年4月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号gdmccno:60350。从中国水产科学研究院珠江水产研究所高要水产良种基地罗非鱼养殖池塘底泥中分离出一株粪产碱杆菌，该菌株y311能够在有氧条件下高效降解氨氮、硝酸盐氮和cod，具有较强的应用价值。实施例2取1ml1.02×1010cfu/ml的y311生理盐水悬液，接种于180ml富集培养基[乙酰胺(2.0g)，naoh(0.6g)，mgso4·7h2o(0.05g)，k2hpo4(8.2g)，kcl(0.5g)，cuso4·5h2o(0.5mg)，caso4·2h2o(0.5mg)，znso4·7h2o(0.5mg)，fecl3(0.5mg)，蒸馏水1000ml，ph7.0]中，空白对照加入等体积的生理盐水(control)。7d后测定各组氨氮、硝酸盐氮和cod的含量。其中，nh4+-n含量采用纳氏试剂法测定；no3--n含量测定采用酚二磺酸法；cod测定采用重铬酸钾法。经过7d的处理，y311对nh4+-n的去除率达到60.3％，对no3--n的去除率达到74.7％，对cod达到36.7％，结果如表1及图5～7所示。表1.粪产碱杆菌y311对nh4+-n、no3--n和cod的处理效果分组nh4+-nno3--ncodcontrol2.23±0.19mg/l4.76±0.36mg/l1647.9±185.12mg/ly3110.89±0.20mg/l1.21±0.67mg/l1042.9±66.04mg/l去除率(％)60.374.736.7以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>中国水产科学研究院珠江水产研究所<120>粪产碱杆菌y311筛选方法和应用<130>2018<141>2018-05-31<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1382<212>dna<213>alcaligenesfaecalis<400>1cgaacggcagcgcgagagagcttgctctcttggcggcgagtggcggacgggtgagtaata60tatcggaacgtgcccagtagcgggggataactactcgaaagagtggctaataccgcatac120gccctacgggggaaagggggggatcgcaagacctctcactattggagcggccgatatcgg180attagctagttggtggggtaaaggctcaccaaggcaacgatccgtagctggtttgagagg240acgaccagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtgggg300aattttggacaatgggggaaaccctgatccagccatcccgcgtgtatgatgaagactcgg360gtgtaaagtacttttggcagaagaagaaaaaggtatcccctaatacgggatactgctgac420ggtatctgcagaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggt480gcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtgtgtaggcggttcggaaagaaagat540gtgaaatcccagggctcaaccttggaactgcatttttaactgccgagctagagtatgtca600gaggggggtagaattccacgtgtagcagtgaaatgcgtagatatgtggaggaataccgat660ggcgaaggcagccccctgggataatactgacgctcagacacgaaagcgtggggagcaaac720aggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgtcaactagctgttggggccgtt780aggccttagtagcgcagctaacgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggtcgcaagat840taaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggatgatgtggattaattcga900tgcaacgcgaaaaaccttacctacccttgacatgtctggaaagccgaagagatttggccg960tgctcgcaagagaaccggaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgaga1020tgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcattagttgctacgcaagagcact1080ctaatgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggc1140ccttatgggtagggcttcacacgtcatacaatggtcgggacagagggtcgccaacccgcg1200agggggagccaatctcagaaacccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgc1260gtgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggt1320cttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggtttcaccagaagtaggtagcctaac1380cg1382当前第1页12