本发明涉及生物技术领域，具体涉及导电四型菌毛及其编码基因和含有该基因的载体和相应的生产菌株及其应用。
背景技术：
四型菌毛(typeivpili，t4p)存在于自然界多数细菌中，其功能包括颤动能力(twitching)、在生物或非生物表面的吸附能力、dna的摄入能力及电子的传递能力等等。四型菌毛结构蛋白分子量较小，介于7-20kda之间。该结构蛋白的n端结构具有保守性，也即，一段疏水性的保守α-螺旋(包含一段跨膜结构域和一段蛋白互作结构域)，c端结构各异。根据四型菌毛基因的同源性，可将其划分为t4ap，t4bp两类：t4ap类菌毛的基因相对同源，存在于许多环境微生物中，如假单胞菌、希瓦氏菌(shewanella)、地杆菌等；t4bp类菌毛的基因分化程度较大，多存在于肠杆菌科细菌中，如大肠杆菌(escherichiacoli)及霍乱弧菌(vibriocholerae)等。
硫还原地杆菌(geobactersulfurreducens)的四型菌毛(gspili)属于t4ap型，是迄今为止唯一被公认的具有胞外电子传递能力的导电四型菌毛，因其具备开发成为生物电子材料的潜力而被科学家们所熟知。该菌毛的结构蛋白pila由61个氨基酸构成。硫还原地杆菌为严格厌氧菌，生长缓慢，限制了该菌的导电四型菌毛在生物电子材料方面的开发。
技术实现要素：
假单胞菌广泛存在于自然环境中，属于好氧菌，生长快，易培养且遗传操作较成熟。其中铜绿假单胞菌具有产电能力，是可用于微生物燃料电池的细菌。微生物燃料电池是利用微生物产生的电能作为能源的装置。希瓦氏菌和硫还原地杆菌是微生物燃料电池研究的模式菌株。本项发明的申请人近期发现，利用分子生物学手段，在铜绿假单胞菌中可以获得高效导电的导电四型菌毛，从而有此发明。
本发明的第一个方面提供一种导电四型菌毛，其菌毛蛋白pila的氨基酸序列与seqidno：1所示的氨基酸序列具有至少50％的同源性。
本发明的第二方面提供了一类基因，该基因编码如上所述的导电四型菌毛。
本发明的第三方面提供了一种载体，该载体含有如上所述的基因。
本发明的第四方面提供了一种生产上述导电四型菌毛的相应菌株，该菌株具有如上所述的基因，或如上所述的载体，并能在菌体表面高效表达导电的导电四型菌毛。
本发明的第五方面提供了如上所述的导电四型菌毛、如上所述的基因、如上所述的载体以及如上所述的菌株在生物导电材料和/或微生物燃料电池中的应用。
本发明的第六方面提供了一种增加细菌在微生物燃料电池中的产电量的方法，该方法包括：通过遗传改造细菌四型菌毛的菌毛蛋白(氨基酸替换，截短等)，以增强四型菌毛的导电能力，从而改变细菌在微生物燃料电池中的产电量。
本发明的技术方案可取得如下的技术性效果：
(1)本发明提供了一种较方便获得导电四型菌毛的方法及相应生产菌株，使导电四型菌毛在材料领域的应用成为可能；
(2)本发明提供了改良四型菌毛导电性能的方法；
(3)本发明提供了一种增加微生物燃料电池产电量的方法。
附图说明
图1显示了铜绿假单胞菌pao1(图1a)、及其δpila(图1b)突变株和δpila/ppa61(图1c)在透射电子显微镜下的图片，其中，空心箭头及f表示鞭毛，实心箭头及p表示四型菌毛。
图2显示了铜绿假单胞菌pao1四型菌毛(papila菌毛)样品形貌图(图2a)、表达papila截短蛋白(papila1-61)的相应菌株的四型菌毛(papila1-61菌毛)样品形貌图(图2b)和表达增加papila截短蛋白中的芳香族氨基酸数目的蛋白的相应菌株的四型菌毛(papila1-61m3菌毛)样品形貌图(图2c)。
图3显示了铜绿假单胞菌pao1四型菌毛(papila菌毛)样品电流图(图3a)、表达papila截短蛋白(papila1-61)的相应菌株的四型菌毛(papila1-61菌毛)样品电流图(图3b)和表达增加papila截短蛋白中的芳香族氨基酸数目的蛋白的相应菌株的四型菌毛(papila1-61m3菌毛)样品电流图(图3c)。
图4显示了铜绿假单胞菌pao1四型菌毛(papila菌毛)样品i-v曲线图(图4a)、表达papila截短蛋白(papila1-61)的相应菌株的四型菌毛(papila1-61菌毛)样品i-v曲线图(图4b)和表达增加papila截短蛋白中的芳香族氨基酸数目的蛋白的相应菌株的四型菌毛(papila1-61m3菌毛)样品i-v曲线图(图4c)。如图所示papila1-61m3有相对最好的导电性能。
图5显示了铜绿假单胞菌pao1四型菌毛(papila菌毛)样品、表达papila截短蛋白(papila1-61)的相应菌株的四型菌毛(papila1-61菌毛)、硫还原地杆菌pila所得的相应菌毛(gspila菌毛)和表达增加papila截短蛋白中的芳香族氨基酸数目的蛋白的相应菌株的四型菌毛(papila1-61m3菌毛)样品的电阻图。如图所示papila1-61m3菌毛的电阻最小，papila菌毛的电阻类似gspila菌毛。
图6显示了表达不同导电能力菌毛的铜绿假单胞菌在微生物燃料电池中的生物产电量。检测菌株分别为野生型pao1/pherd20t、缺失papila的突变株δpila/pherd20t、表达全长papila的菌株δpila/ppa、表达gspila的菌株δpila/pgs、表达papila截短蛋白的菌株δpila/ppa61和表达增加papila截短蛋白芳香族氨基酸数目的菌株δpila/ppa61m3(本发明中pherd20t为载体质粒)。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
根据本发明的第一方面提供一种导电四型菌毛，其菌毛蛋白pila的氨基酸序列与seqidno：1所示的氨基酸序列具有至少50％的同源性。
根据本发明，所述导电四型菌毛的菌毛蛋白pila氨基酸序列与seqidno：1所示的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性。
本发明的发明人在研究的过程中发现，四型菌毛蛋白截短(序列与seqidno：1所示的氨基酸序列具有至少50％的同源性)后不仅能够在δpila缺失菌株中形成四型菌毛，并且相比于其全长序列(例如，seqidno：2)还表现出更加优异的电子传输性能。因此，优选的，所述导电四型菌毛的氨基酸序列如seqidno：1所示。
根据本发明，所述seqidno：1序列优选来自铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌的四型菌毛结构蛋白(papila)全长由149个氨基酸(seqidno：2)构成，与地杆菌菌毛蛋白gspila的n端结构相同，其序列相似度为51％，两种蛋白的c端结构差异较大，papila的c端结构除了无规则卷曲外，还有αβ-环及β-折叠结构。本发明的发明人在研究的过程中发现，铜绿假单胞菌的四型菌毛截短后(seqidno：1)能够在电子传输中表现出更加优越的性能。
根据本发明一种具体的实施方式，本发明的导电四型菌毛的氨基酸序列还可以为在具有seqidno：1所示的氨基酸序列的基础上进行氨基酸序列改变，具体的，在seqidno：1所示的氨基酸序列的基础上进行一个或几个氨基酸的取代，但取代后所获得的氨基酸序列仍具有电子传输性能。
本发明的发明人在研究中进一步发现，通过使用芳香族氨基酸对seqidno：1所示的氨基酸序列中的一个或几个非芳香族氨基酸的取代后所获得的氨基酸序列所形成的导电四型菌毛能够在电子传输上表现出更加优异的性能。因此，根据本发明一种优选的实施方式，所述导电四型菌毛具有使用芳香族氨基酸取代seqidno：1所示的氨基酸序列中的一个或几个非芳香族氨基酸的氨基酸序列。
本发明的发明人在研究中还发现，当所述取代的位点位于seqidno：1所示的氨基酸序列中第38位、第57位和第63位中的至少一位，或者所述取代的位点位于seqidno：2所示的氨基酸序列中第38位、第57位和第63位中的至少一位时，所形成的导电四型菌毛能够在电子传输上表现出更加优异的性能。
根据本发明一种优选的实施方式，所述取代的位点位于seqidno：1所示的氨基酸序列中第38位、第57位和第63位。
根据本发明一种优选的实施方式，所述芳香族氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸中的至少一种；根据本发明进一步优选的实施方式，所述芳香族氨基酸为苯丙氨酸和酪氨酸。
进一步优选的，所述导电四型菌毛的氨基酸序列如seqidno：3所示。
根据本发明的第二方面，提供了一种基因，该基因编码如上任意一项所述的导电四型菌毛。
能够理解的是，在获知了相应的氨基酸序列后，本领域技术人员能够根据编码该氨基酸的密码子获知其编码的基因序列。并且，公知的，密码子具有简并性，因此，本申请所述的编码如上所述的导电四型菌毛的相应基因，包括各种因密码子简并性所获得的基因序列。
根据本发明一种优选的实施方式，编码seqidno：1所示的氨基酸序列的基因的核苷酸序列如seqidno：4所示。
根据本发明一种优选的实施方式，编码seqidno：3所示的氨基酸序列的基因的核苷酸序列如seqidno：5所示。
根据本发明的第三方面，提供一种载体，该载体含有如上所述的基因。
根据本发明，所述载体可以为本领域公知的各种载体，本领域技术人员可以根据实际需求选择合适的载体，所述载体可以为但不限于质粒pherd20t。
根据本发明的第四方面，提供一种菌体，该菌体具有如上所述的基因，或如上所述的载体。
优选的，该菌体选自假单胞菌属或希瓦氏菌属中的一种。更优选为铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌为好养菌，具有极强的生存能力，广泛分布于自然界中，获取及培养极为便利，而且遗传操纵系统较完善。有利于导电四型菌毛的大量获取。
本发明中，所述铜绿假单胞菌可以为现有的具有导电四型菌毛的铜绿假单胞菌，但本发明特别优选铜绿假单胞菌pao1。因此，根据本发明一种优选的实施方式，所述铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌pao1。其中，所述铜绿假单胞菌pao1的获得可以通过常规的商购途径获得，或者通过其他的可获得途径获得。所述铜绿假单胞菌pao1在文献geneticrecombinationinpseudomonasaeruginosa.jgenmicrobiol,1955.13(3):p.572-81中进行了详细的记载。
根据本发明的第五方面，提供了如上所述的导电四型菌毛、如上所述的基因、如上所述的载体或如上所述的菌体在生物导电材料和/或微生物燃料电池中的应用。
根据本发明的第六方面，提供了一种增加细菌在微生物燃料电池中的产电量的方法，该方法包括：通过遗传改造细菌的导电四型菌毛蛋白(氨基酸替换，截短等)，以增强导电四型菌毛的导电能力，从而改变细菌在微生物燃料电池中的产电量。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
铜绿假单胞菌pao1：参考文献：geneticrecombinationinpseudomonasaeruginosa.jgenmicrobiol,1955.13(3):p.572-81。
铜绿假单胞菌papila缺失菌株(δpila)：参考文献：functionalexpressionofheterologoustype4fimbriaeinpseudomonasaeruginosa.gene,1996.175:p.143–150。
铜绿假单胞菌papila及flic(鞭毛主要结构蛋白)双缺失菌株(δpilaδflic)构建方法参考文献：aspiderwebstrategyoftypeivpili-mediatedmigrationtobuildafibre-likepslpolysaccharidematrixinpseudomonasaeruginosabiofilms.environmicrobiol,2013.15:p2238-53。
lb固体培养基：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、nacl10g、琼脂糖20g，h2o1000ml。
lb液体培养基：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、nacl10g，h2o1000ml。
抗生素的使用：
大肠杆菌氨苄青霉素(amp)工作浓度为100μg/ml；铜绿假单胞菌羧苄青霉素(carb)工作浓度为300μg/ml。
papila蛋白表达质粒ppa的构建为常规克隆方法，所用的质粒pherd20t参考文献pbad-basedshuttlevectorsforfunctionalanalysisoftoxicandhighlyregulatedgenesinpseudomonasandburkholderiaspp.andotherbacteria.applenvironmicrobiol,2008.74(23):p.7422-6。所用的引物为paf：ggaattcgtgttggcggaccagctt(seqidno：6)，par：ggaattccatatggaatctctccgttgattattatgtatagg(seqidno：7)(斜体为酶切位点)。
papila截短蛋白(papila1-61)表达质粒ppa61的构建，所用质粒同上，所用的引物为pafggaattcgtgttggcggaccagctt(seqidno：7)，pa61r：cccaagcttttaaattttgctaccagcaattcc(seqidno：8)。
papila1-61定点突变蛋白(papila1-61m3)表达质粒ppa61m3的构建，所用质粒同上，所用定点突变方法参考文献site-directedmutagenesis.methodsenzymol,2013.529:p.241-8。所用的引物为32f：tatgttgcgcgttcgtatggtgcttcggcg(seqidno：9)，32r：cgccgaagcaccatacgaacgcgcaacata(seqidno：10)；51f：actgttgaagagtcgttctcgcgtggaattgct(seqidno：11)，51r：agcaattccacgcgagaacgactcttcaacagt(seqidno：12)；57f：tcgcgtggaattgctggtagcaaaattaaaatt(seqidno：13)，57r：aattttaattttgctaccagcaattccacgcga(seqidno：14)(下划线部分为突变序列)。
微生物燃料电池为常规u型双室装置，石墨电极，外接1千欧电阻，参考文献photocatalyticallyimprovedazodyereductioninamicrobialfuelcellwithrutile-cathode.bioresourtechnol,2010.101(10),3500-5.阳极室与阴极室分别装有含有对数期菌液的m9培养基(葡萄糖4g、磷酸氢二钠12.8g、磷酸二氢钾3g、氯化钠0.5g、氯化铵1g、1mol/l硫酸镁2ml、1mol/l氯化钙100μl，h2o1000ml)和1mol/l氯化钾溶液。微生物燃料电池所产电压由电压表测得，电流由欧姆定律(电压＝电流×电阻)转换而得。工作电极上的生物量由分光光度计测得。
实施例1
本实施例用于说明papila截短蛋白(papila1-61)在铜绿假单胞菌δpila菌株中导电四型菌毛的形成。
(1)将铜绿假单胞菌pao1/vector，papila缺失突变株δpila/vector及δpila/ppa61接种至lb(carb)固体培养基平板上，37℃静置过夜培养(此处vector为pherd20t)。
(2)从完成步骤1的平板上挑取pao1/vector、δpila/vector及δpila/ppa61的单克隆，将其重悬在10μl蒸馏水中，取铜网置于菌悬液上3s，用滤纸吸走多余的菌液，重复清洗三次后，用0.2％乙酸铀酰对样品进行染色处理，用透射电子显微镜观察样品的导电四型菌毛形态。
结果见图1。pao1/vector(图1a)、δpila/ppa61(图1c)菌细胞中可以观察到四型菌毛，而δpila/vector(图1b)菌细胞中不能，说明papila截短蛋白(papila1-61)可以在铜绿假单胞菌中形成四型菌毛。其中，空心箭头及f表示鞭毛，实心箭头及p表示四型菌毛。
实施例2
本实施例用于说明铜绿假单胞菌pao1的四型菌毛的电子传递能力。
1、将铜绿假单胞菌δpilaδflic/ppa接种至lb(carb)固体培养基平板上，37℃静置培养过夜。
2、从完成步骤1的平板上挑取单克隆，接种至加有1重量％阿拉伯糖的lb(carb)液体培养基中，37℃200rpm震荡培养至od600值为2左右。
3、取1ml步骤2中的菌液，13000g离心1min。弃上清。
4、将完成步骤3的菌体沉淀重悬于500μl的150mm乙醇胺溶液(ph10.5)中，并置于涡旋振荡仪上，轻柔振荡1min。
5、将完成步骤4的菌液13000g离心1min，保留上清。
6、将完成步骤5的上清中加入500μl的10％硫酸铵溶液，颠倒混匀后放置于室温3h。
7、重复步骤3-6，以进一步除去残留的菌细胞。
8、将完成步骤7的溶液13000g离心1min，弃上清后，重悬于100μl的150mm乙醇胺溶液，并取60μl滴在干净的高定向热裂解石墨(highlyorientedpyrolyticgraphite,hopg)基底上，置于室温过夜干燥。
9、将完成步骤8中的hopg置于原子力显微镜(brukericon)中，选取peakforcetuna模块，peakforcetuna探针进行实验。先在扫描模式(scanmode)下获取四型菌毛样品形貌图(heightsensorimage)，再加2v的偏压(samplebiasvoltage)于探针，获得电流图(tunacurrentimage)，随后，将扫描模式转换为渐进模式(rampmode)，先获取hopg基底的i-v曲线图，确保探针具有良好的导电性能后，选取6-8根四型菌毛，其中每根四型菌毛上取6-8个点，采集i-v曲线图。
完成上述处理后，采用nanoscopeanalysis1.5software进行数据处理。并根据i-v曲线图，推算出所测量的导电四型菌毛的电阻值，其中，i-v曲线图中斜率越大，说明样品电阻值越小；斜率越小，说明样品电阻值越大。
其中，铜绿假单胞菌pao1四型菌毛(papila菌毛)样品形貌图如图2a所示，电流图如图3a所示，i-v曲线图如图4a所示，电阻如图5所示。铜绿假单胞菌papila全长蛋白(papila)四型菌毛的i-v曲线的斜率偏小，样品电阻值约为505mω，具有电子传递的功能。
实施例3
本实施例用于说明表达papila截短蛋白(papila1-61)的δpilaδflic菌株的四型菌毛导电性能。
1、将铜绿假单胞菌δpilaδflic/ppa61接种至lb(carb)固体培养基平板上，37℃静置培养过夜。
2、重复实施例2中的步骤2-9。
其中，表达papila截短蛋白(papila1-61)的δpilaδflic菌株的四型菌毛(papila1-61菌毛)样品形貌图如图2b所示，电流图如图3b所示，i-v曲线图如图4b所示，电阻如图5所示。papila1-61四型菌毛的i-v曲线图斜率要大于papila，其电阻值约为25mω，为papila全长蛋白的1/20。说明将papila从c端截短后，可以增强其电子传递能力。
实施例4
本实施例用于说明增加papila截短蛋白中的芳香族氨基酸数目(papila1-61m3)的相应菌株的四型菌毛导电性能。
1、将铜绿假单胞菌δpilaδflic/ppa61m3接种至lb(carb)固体培养基平板上，37℃静置培养过夜。
2、同实施例3中的步骤2。
其中，增加papila截短蛋白中的芳香族氨基酸数目的相应菌株的四型菌毛(papila1-61m3菌毛)样品形貌图如图2c所示，电流图如图3c所示，i-v曲线图如图4c所示，电阻如图5所示。papila1-61m3四型菌毛的i-v曲线图斜率要大于papila1-61，其电阻值约为3.6mω，为papila1-61的1/7，papila的1/140。说明增加papila1-61中的芳香族氨基酸数目，可以进一步增强其四型菌毛的电子传递能力。
本专利检测了铜绿假单胞菌pao1菌株papila全长蛋白四型菌毛和papila截短蛋白四型菌毛及相应点突变四型菌毛的导电能力。发现随着papila的c端结构的截短，电子传递能力有所增强，同时，随着截短蛋白papila1-61中芳香族氨基酸数目的增加，其电子传递能力进一步增强。
实施例5
本实施例用于说明表达papila截短蛋白的δpila菌株的产电量。
1、将pao1/pherd20t、缺失全长papila的突变株δpila/pherd20t、表达全长papila的菌株δpila/ppa、表达gspila的菌株δpila/pgs、表达papila截短蛋白的菌株δpila/ppa61和表达增加papila截短蛋白的芳香族氨基酸数目的菌株δpila/ppa61m3(pherd20t为载体质粒)接种至lb(carb)固体培养基平板上，37℃静置培养过夜。
2、从完成步骤1中的平板上，挑取单克隆菌株于1重量％阿拉伯糖的200mllb(carb)液体培养基中，37℃200rpm震荡培养至od600值为0.5左右。
3、将完成步骤2中的菌液，13000g离心4min，弃上清后，重悬于200ml的m9培养基中，将重悬后的菌液，注入已灭菌的微生物燃料电池阳极室。
4、向微生物燃料电池注入150ml1m氯化钾溶液。
5、每隔1h用万用表测量一次电压值。
6、待培养完毕后，将工作电极取出，放入装有200ml的蒸馏水中，用超声震荡仪将工作电极中的细菌重悬于蒸馏水中后，分光光度计测量od600。
表达papila截短蛋白的δpila菌株，其生物产电量相比pao1/vector而言提高了约3.3倍(图6)。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110>中国科学院微生物研究所
<120>导电四型菌毛及其编码基因和含有该基因的载体和相应的生产菌株及其应用
<130>wsw
<160>14
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>67
<212>prt
<213>p.aeruginosa
<400>1
metlysalaglnlysglyphethrleuilegluleumetilevalval
151015
alaileileglyileleualaalailealaileproglntyrglnasn
202530
tyrvalalaargsergluglyalaseralaleualathrileasnpro
354045
leulysthrthrvalglugluserleuserargglyilealaglyser
505560
lysilelys
65
<210>2
<211>149
<212>prt
<213>p.aeruginosa
<400>2
metlysalaglnlysglyphethrleuilegluleumetilevalval
151015
alaileileglyileleualaalailealaileproglntyrglnasn
202530
tyrvalalaargsergluglyalaseralaleualathrileasnpro
354045
leulysthrthrvalglugluserleuserargglyilealaglyser
505560
lysilelysileglythrthralaserthralathrgluthrtyrval
65707580
glyvalgluproaspalaasnlysleuglyvalilealavalalaile
859095
gluaspserglyalaglyaspilethrphethrpheglnthrglythr
100105110
serserprolysasnalathrlysvalilethrleuasnargthrala
115120125
aspglyvaltrpalacyslysserthrglnaspprometphethrpro
130135140
lysglycysaspasn
145
<210>3
<211>67
<212>prt
<213>p.aeruginosa
<400>3
metlysalaglnlysglyphethrleuilegluleumetilevalval
151015
alaileileglyileleualaalailealaileproglntyrglnasn
202530
tyrvalalaargsertyrglyalaseralaleualathrileasnpro
354045
leulysthrthrvalglugluserpheserargglyilealatyrser
505560
lysilelys
65
<210>4
<211>201
<212>dna
<213>p.aeruginosa
<400>4
atgaaagctcaaaaaggctttaccttgatcgaactgatgatcgtggttgcgatcatcggt60
atcctggcggcaattgccattccccagtatcagaactatgttgcgcgttcggaaggtgct120
tcggcgctggcgacgatcaacccgctgaagaccactgttgaagagtcgctgtcgcgtgga180
attgctggtagcaaaatttaa201
<210>5
<211>201
<212>dna
<213>p.aeruginosa
<400>5
atgaaagctcaaaaaggctttaccttgatcgaactgatgatcgtggttgcgatcatcggt60
atcctggcggcaattgccattccccagtatcagaactatgttgcgcgttcgtatggtgct120
tcggcgctggcgacgatcaacccgctgaagaccactgttgaagagtcgttctcgcgtgga180
attgcttatagcaaaatttaa201
<210>6
<211>25
<212>dna
<213>p.aeruginosa
<400>6
ggaattcgtgttggcggaccagctt25
<210>7
<211>42
<212>dna
<213>p.aeruginosa
<400>7
ggaattccatatggaatctctccgttgattattatgtatagg42
<210>8
<211>33
<212>dna
<213>p.aeruginosa
<400>8
cccaagcttttaaattttgctaccagcaattcc33
<210>9
<211>30
<212>dna
<213>p.aeruginosa
<400>9
tatgttgcgcgttcgtatggtgcttcggcg30
<210>10
<211>30
<212>dna
<213>p.aeruginosa
<400>10
cgccgaagcaccatacgaacgcgcaacata30
<210>11
<211>33
<212>dna
<213>p.aeruginosa
<400>11
actgttgaagagtcgttctcgcgtggaattgct33
<210>12
<211>33
<212>dna
<213>p.aeruginosa
<400>12
agcaattccacgcgagaacgactcttcaacagt33
<210>13
<211>33
<212>dna
<213>p.aeruginosa
<400>13
tcgcgtggaattgctggtagcaaaattaaaatt33
<210>14
<211>33
<212>dna
<213>p.aeruginosa
<400>14
aattttaattttgctaccagcaattccacgcga33