本发明涉及基因工程的技术领域，具体而言，涉及一种翻译共转移信号肽及重组甲基对硫磷水解酶的制备方法。
背景技术：
有机磷类农药对人的危害作用从剧毒到低毒不等。能抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使乙酰胆碱积聚，引起毒蕈碱样症状、烟碱样症状以及中枢神经系统症状，严重时可因肺水肿、脑水肿、呼吸麻痹而死亡。重度急性中毒者还会发生迟发性猝死。某些种类的有机磷中毒可在中毒后8-14天发生迟发性神经病，有机磷中毒者血胆碱酯酶活性降低。这类毒性巨大的化合物从上世纪中叶开始被广泛用作农业杀虫剂使用，其残留已经对食品和环境安全造成了巨大的威胁。
由于有机磷农药较低的水溶性，使用简单的物理清洗方法如水洗不能有效的将其从食物表面去除。使用表面活性剂清洗虽对其有一定的去除效果，但表面活性剂的残留会引起二次污染。酶作为一种具有催化功能的蛋白质，可以高效的将高毒的有机磷农药降解为低毒的小分子水溶性的化合物，并且本身无毒无害，不会引起二次污染，为解决农药残留问题的一个最安全有效的方法。
目前对有机磷农药通过有机磷降解酶进行清除方法，工艺不成熟，无法满足工业化生产的需求，且现有技术中，通过增加甲基对硫磷水解酶(mph)在毕赤酵母中分泌表达从而对有机磷农药进行降解的技术的发酵时间短，酶活性低，限制了mph在生产上的大规模应用。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的提供一种翻译共转移信号肽及重组甲基对硫磷水解酶的制备方法。要解决的技术问题在于通过翻译共转移信号肽的引导，增加甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达量，克服现有有机磷农药降解酶制备技术中，发酵产酶时间短，酶活低的问题。
为解决上述问题，本发明提供一种翻译共转移信号肽，其氨基酸序列如seqidno.1所示。
优选地，其核苷酸序列如seqidno.2所示。
此外，本发明还提供一种重组质粒，包含如上述所述的翻译共转移信号肽。
优选地，所述重组质粒是由所述翻译共转移信号肽与甲基对硫磷水解酶的编码基因进行重组获得的重组质粒。
此外，本发明还提供一种转化体，其特征在于，所述转化体为由上述所述的重组质粒转化宿主细胞获得的转化体；
所述宿主细胞包括毕赤酵母x33。
此外，本发明还提供一种重组甲基对硫磷水解酶的制备方法，包括：取如上述所述的转化体，经过发酵，过滤，干燥，即得。
本发明提供一种翻译共转移信号肽及重组甲基对硫磷水解酶的制备方法，其中所述翻译共转移信号肽可引导甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母菌株x33中的高效分泌表达，远高于毕赤酵母通用信号肽α-factor的分泌表达水平，可以极大的降低甲基对硫磷水解酶的生产成本，使得甲基对硫磷水解酶作为一种安全环保的酶制剂大规模应用于食品或环境中的农药残留的降解成为可能。
附图说明
应当理解的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为x33-α-factor-chbd-mph对照菌株的产酶曲线；
图2为本发明构建菌株x33-ost1-mph的产酶曲线；
图3为去离子水作为对照的农药残留试纸检测结果；
图4为柠檬作为供试品的农药残留试纸检测结果；
图5为使用mph粉酶去除柠檬表面农药残留后的农药残留试纸检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例的方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。
但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
本发明提供一种翻译共转移信号肽，其氨基酸序列如seqidno.1所示。
优选地，其核苷酸序列如seqidno.2所示。
上述，本发明提供的翻译共转移信号肽ost1为酿酒酵母内质网腔蛋白的信号肽，具有seqidno.1所示的氨基酸序列。其对应的核苷酸序列如seqidno.2所示，长度为22个氨基酸，富含高度疏水性氨基酸w与f，是一类不同于毕赤酵母通用信号肽α-factor的翻译共转移信号肽。
上述，采用翻译共转移的信号肽可以有效地避免甲基对硫磷水解酶在转移进入内质网腔之前过快的折叠，增加mph进入内质网腔的效率，从而增加mph在毕赤酵母中的分泌表达量。
综上，本发明提供一种翻译共转移信号肽，可引导甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母菌株x33中的高效分泌表达，远高于毕赤酵母通用信号肽α-factor的分泌表达水平，可以极大的降低甲基对硫磷水解酶的生产成本，使得甲基对硫磷水解酶作为一种安全环保的酶制剂大规模应用于食品或环境中的农药残留的降解成为可能。
此外，本发明还提供一种重组质粒，包含如上述所述的翻译共转移信号肽。
优选地，所述重组质粒是由所述翻译共转移信号肽与甲基对硫磷水解酶的编码基因进行重组获得的重组质粒。
在本发明中，通过以ppiczαa-α-factor-mph为模板，以mphost1f:ttgttcttgtgtttcttcaacgtgtcttctgctgccgcaccgcaggtgcgcacctcgg和mphost1r:tccaacaatccaagagaaccaaacttgtctcatcgtttcgaataattagttgttttttg为引物，进行信号肽置换突变，从而得到由所述翻译共转移信号肽插入甲基对硫磷水解酶编码基因的上游进行重组获得的重组质粒ppiczαa-ost1-mph。
此外，本发明还提供一种转化体，所述转化体为由上述所述的重组质粒转化宿主细胞获得的转化体；
所述宿主细胞包括毕赤酵母x33。
上述，通过对突变重组质粒ppiczαa-ost1-mph转化毕赤酵母x33宿主细胞获得转化体，以便于进行对于转化体的相关实验，从而制备重组甲基对硫磷水解酶的相关制剂。
此外，本发明还提供一种重组甲基对硫磷水解酶的制备方法，包括：取如上述所述转化体，经过发酵，过滤，干燥，即得。
取上述转化体，首先通过发酵罐在一定预设条件下进行发酵，进而将发酵所得产物进行过滤得到发酵液，通过对所述发酵液进行干燥，最终得到具有高活力的mph粉剂，即为重组甲基对硫磷水解酶的粉剂。
上述，发酵过程，可以包括如下方式：
取发酵罐，采用bsm培养基，配方为磷酸、硫酸钙、硫酸钾、七水硫酸镁、氢氧化钾、甘油和自来水。灭菌30min，冷却后加入ptm1微量元素溶液，接入摇瓶菌种控温28℃，ph4.8条件下发酵。
通过控制通风量及转速控制溶氧始终大于20％。待底料中甘油耗尽，溶氧反弹后开始流加25％甘油；待流加结束，溶氧反弹，饥饿半小时后开始流加100％甲醇，流加速率从30g/h逐步增加到80g/h，每隔一定时间取样检测酶活，即得x33-ost1-mph发酵液。
上述，过滤过程，可以包括如下步骤：
取x33-ost1-mph发酵液，添加适量821型细硅藻土作为助滤剂，选用0.2m2板框滤布，进行板框过滤，得到滤液。
上述，干燥过程，可以包括如下步骤：
在上述滤液中添加辅料(20％复合淀粉，为玉米淀粉:水溶淀粉＝1:4)，搅拌形成匀浆液，进行喷雾干燥，设定进料温度180℃、出口温度70℃，获得重组甲基对硫磷水解酶的高活力mph粉剂。
此外，上述干燥过程还可以为将x33-ost1-mph发酵液过滤后的滤液，直接置入带式干燥机中在真空环境下进行带式干燥，带干温度设置为80-90℃，对所得到的带干后的干燥块状物进行粉碎过筛，即得到重组甲基对硫磷水解酶的高活力mph粉剂。使用真空带式干燥法进行干燥，可避免在干燥过程中加入其他辅料，对最终得到的产品的绝对含量造成影响，且带式干燥速度快、损失少。其中，带式干燥机可以包括有为双层、三层，甚至三层以上的多层干燥带的带式干燥机，通过设定带干温度、真空度和进料速度从而实现对物料的干燥，优点为大大减少了干燥过程中对物料有效物质含量的损失。
为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。申请人声明，本发明通过如下所述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
一、实验条件：
1、实验采用的菌株及载体
含有甲基对硫磷水解酶基因片段的原始质粒pet-22b(+)-mph为中科院武汉病毒所周宁一课题组所构建，其中mph编码基因序列如seqidno.3所示；
毕赤酵母分泌表达载体ppiczαa与表达菌株x33为invitrogen公司产品。
2、酶类及其他生化试剂
kod-plus-neo：高保真pcr酶为东洋纺(上海)生物科技有限公司产品；
内切酶，连接酶及t4polynucleotidekinase：thermofisherscientific公司产品；
zeocin：生工生物工程(上海)股份有限公司产品；
琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、pcr产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司产品；
底物甲基对硫磷标品：北京坛墨质检科技有限公司产品。
llb(低盐lb)培养基用于培养大肠杆菌(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，0.5％nacl)；
ypd培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖)用于培养毕赤酵母；
ypg培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，1％甘油)用于bmmy培养基诱导前毕赤酵母增菌；
bmmy培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，100mm磷酸钾缓冲液,ph6.0，1.34％ynb，4×10-5％biotin，0.5％甲醇)用于毕赤酵母摇瓶诱导产酶；
bsm培养基(85％磷酸26.7ml/l，硫酸钙0.93g/l，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g/l，氢氧化钾4.13g/l，甘油40.0g/l，ptm14.35ml/l)用于毕赤酵母发酵罐水平产酶。
二、甲基对硫磷水解酶的活性分析方法：
活力检测采用测定对硝基苯酚的生成速率法，具体方法如下：
先向试管中加入3160μl0.1mph9.5的tris-hcl缓冲液和40μl10mm甲基对硫磷甲醇溶液，混匀后于25℃水浴预热5min，再加入80μl酶稀释液后即刻混匀并开始计时，依次记录第30s、405nm吸光度a1和第90s、405nm吸光度a2。注意适当稀释原酶液以控制30s吸光值a1落在0.15-0.25可信区间范围之内。
同一样品做两个平行，两个平行测定值的相对误差不超过10.0％，二者的平均值为最终的酶活力测定值。
酶活力按照下列公式计算：
式中：x中样品中甲基对硫磷水解酶的活力，u/ml；vt—反应总体积(3280μl)；vs—样品体积(80μl)；17.7(对硝基苯酚在405nm的摩尔消光系数(cm2/mmol)；1.0，光径(cm)；δa，90s与30s405nm吸光度差(a2-a1)；n；稀释倍数；t释反应时间(1min)。
甲基对硫磷水解酶酶活力定义为：在25℃和ph9.5的条件下，以0.125mm甲基对硫磷为底物，每分钟产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位。
三、实施例：
实施例1：
1、以pet-22b(+)-mph为模板，以mphf(ecori):actggaattcgccgcaccgcaggtgcgcacctcgg和mphr(noti):actggcggccgctcacttggggttgacgaccgagtagttc为引物，使用kod-plus-neo高保真pcr酶进行pcr扩增，扩增条件为：94℃预变性2min，然后98℃变性10s，68℃退火30s，68℃延伸45s，33个循环后，68℃保温7min，获得两端带有ecori与noti酶切位点的mph片段；
2、对获得的mph片段进行琼脂糖凝胶电泳回收，ecori与noti双酶切，与同样经过ecori与noti双酶切的ppiczαa载体进行连接，转化大肠杆菌dh5α，涂布于25ug/mlzeocin的llb平板，得到抗zeocin的转化子；对转化子进行质粒提取，测序确认正确后，得到目标质粒，目标质粒命名为ppiczαa-α-factor-mph；
3、以ppiczαa-α-factor-mph为模板，以mphost1f:ttgttcttgtgtttcttcaacgtgtcttctgctgccgcaccgcaggtgcgcacctcgg和mphost1r:tccaacaatccaagagaaccaaacttgtctcatcgtttcgaataattagttgttttttg为引物(page纯化)，使用kod-plus-neo高保真pcr酶进行pcr扩增，扩增条件为：94℃预变性2min，然后98℃变性10s，68℃退火30s，68℃延伸4min，33个循环后，68℃保温7min，获得线性化的信号肽置换的突变质粒ppiczαa-ost1-mph；
4、使用dpni去除模板质粒ppiczαa-α-factor-mph，对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化，t4polynucleotidekinase磷酸化，连接环化转化大肠杆菌dh5α，涂布于25ug/mlzeocin的llb平板，得到抗zeocin的转化子。对转化子进行质粒小提，测序确认正确后，得到信号肽置换的突变质粒ppiczαa-ost1-mph。大提ppiczαa-ost1-mph质粒并使用saci进行线性化后转化毕赤酵母x33，涂布于100ug/mlzeocin的ypds平板获得毕赤酵母转化子。随机挑选16个转化子接种于25mlypg培养基中，28℃震荡培养2天，离心，倾去上清，加入25mlbmmy培养基28℃继续震荡培养3天，每天补加0.5％的甲醇。诱导结束后，以甲基对硫磷为底物测定摇瓶上清液酶活力。选取上清液酶活最高的转化子进行发酵罐小试实验；
5、发酵罐小试实验采用上海国强生化工程装备有限公司生产的30l不锈钢全自动发酵罐，发酵培养基为bsm培养基，初始料液体积15l。接种量5％-10％，控温28℃，ph4.8发酵。通过控制通风量及转速控制溶氧始终大于20％。待底料中甘油耗尽，溶氧反弹后开始流加25％甘油(含ptm1)，待流加结束，溶氧反弹，饥饿半小时后开始流加100％甲醇(含ptm1)，流加速率从30g/h逐步增加到80g/h，每隔一定时间取样检测酶活；
6、制备高活力的甲基对硫磷水解酶粉剂：
x33-ost1-mph放罐体积23l，添加429g821型细硅藻土作为助滤剂，选用0.2m2板框滤布，进行板框过滤，得到13.8l滤液(1100u/ml)。
在上述滤液中添加20％复合淀粉(玉米淀粉:水溶淀粉＝1:4)，搅拌形成匀浆液，进行喷雾干燥，设定进料温度180℃、出口温度70℃，获得3.53kg酶活力3572u/g的甲基对硫磷水解酶酶粉，酶活力收率为83.11％。
实施例2：
按照pingwang等的现有技术的方法制备甲基对硫磷水解酶。
1、参照pingwang等的方法，在mph的n端添加chbd标签并且在两者之间引入kex2蛋白酶酶切位点ekreaea，去除mphc端的内质网保留信号序列及点突变增加mph的耐酸性，按照毕赤酵母密码子偏爱性进行全基因合成，序列如seqidno.4所示；
2、以合成的puc57-chbd-mph为模板，以mphmodif(ecori):actggaattcatggccgagcaatctgacaaggacg和mphmodir(noti):actggcggccgctcatttgggattaacaacactataatta为引物，使用kod-plus-neo高保真pcr酶进行pcr扩增，扩增条件为：94℃预变性2min，然后98℃变性10s，61℃退火30s，68℃延伸60s，33个循环后，68℃保温7min，获得两端带有ecori与noti酶切位点的chbd-mph片段；
3、对获得的chbd-mph片段进行琼脂糖凝胶电泳回收，ecori与noti双酶切，与同样经过ecori与noti双酶切的ppiczαa载体进行连接，转化大肠杆菌dh5α，涂布于25ug/mlzeocin的llb平板，得到抗zeocin的转化子；
4、对转化子进行质粒小提，测序确认正确后，得到目标质粒ppiczαa-α-factor-chbd-mph。大提ppiczαa-α-factor-chbd-mph质粒并使用saci进行线性化处理后转化毕赤酵母x33，涂布于100ug/mlzeocin的ypds平板获得毕赤酵母转化子。随机挑选16个转化子接种于25mlypg培养基中，28℃震荡培养2天，离心，倾去上清，加入25mlbmmy培养基28℃继续震荡培养3天，每天补加0.5％的甲醇。诱导结束后，以甲基对硫磷为底物测定摇瓶上清液酶活力。选取上清液酶活最高的转化子进行发酵罐小试实验；
5、发酵罐小试实验采用上海国强生化工程装备有限公司生产的30l不锈钢全自动发酵罐，发酵培养基为bsm培养基，初始料液体积15l。接种量5％-10％，控温28℃，ph4.8发酵。通过控制通风量及转速控制溶氧始终大于20％。待底料中甘油耗尽，溶氧反弹后开始流加25％甘油(含ptm1)，待流加结束，溶氧反弹，饥饿半小时后开始流加100％甲醇(含ptm1)，流加速率从30g/h逐步增加到80g/h，每隔一定时间取样检测酶活；
6、甲基对硫磷水解酶粉剂的制备：
x33-α-factor-chbd-mph放罐体积21l，添加392g821型细硅藻土作为助滤剂，选用0.2m2板框滤布，进行板框过滤，得到13.0l滤液(70.3u/ml)。
在上述滤液中添加20％复合淀粉(玉米淀粉:水溶淀粉＝1:4)，搅拌形成匀浆液，进行喷雾干燥，设定进料温度180℃、出口温度70℃，获得3.10kg酶活力210u/g的甲基对硫磷水解酶酶粉，酶活力收率为71.23％。
四、实验结果：
1、产酶曲线：
图1为x33-α-factor-chbd-mph(实施例2中的产品，作为本发明产品的对照)对照菌株产酶曲线，从图中可以看出，对照菌株可以分泌表达mph。诱导前5h酶活增长较快，在5h时可达到140u/ml，随后酶活缓慢增长，在诱导27h时可达到158u/ml。
图2为x33-ost1-mph(实施例1中的产品，为应用本发明所提供方法所制备的产品)的产酶曲线。从图中可以看出，本发明构建的菌株产酶水平明显高于对照菌株。本发明构建菌株x33-ost1-mph在甲醇诱导24h时即可产生1218u/ml的酶活力，其后酶活缓慢增长，在72h达到最高的1663u/ml，较对照菌株有极大的优势。
2、mph粉酶去除农药残留效果评估
农药速测卡(购于北京智云达科技有限公司)能够检测蔬菜水果试样中的农药残留(简称农残)。速测卡加试样反应后颜色越蓝，表明农残越少，颜色越白，表示农残越多。
通过农药速测卡比色法，对蔬菜进行连续农残跟踪检测，发现约40％的蔬菜检出农残。将检出农残的蔬菜逐一用mph粉酶浸泡，再经农药速测卡比色发现，农残几乎被完全去除，去除农残率达97％以上。其中柠檬作为农药残留去除实验待测品的实验结果如图3-5所示。
从图3-5中可以看出，市售柠檬检出含有农残(图4试纸)，试纸反应后未变蓝，呈现淡橙色(来源于柠檬试样自身的底色染色)。使用实施例1所提供的甲基对硫磷水解酶粉剂溶液浸泡后，再使用农药速测卡比色发现(图5试纸)，试纸呈现蓝色，证明农残被实施例1所提供的甲基对硫磷水解酶粉剂有效去除。图3试纸为使用去离子水作为试样的对照，试纸呈现蓝色，证明试纸有效。
sequencelisting
<110>武汉新华扬生物股份有限公司；湖北华扬科技发展有限公司
<120>翻译共转移信号肽及重组甲基对硫磷水解酶的制备方法
<130>2017-12-12
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