本发明涉及多肽化合物合成技术领域，尤其涉及一种依那曲肽的固相合成法。
背景技术：
依那曲肽英文名称edotreotide，cas号为：204318-14-9，分子式c65h92n14o18s2，分子量：1421.65。序列为dota-d-phe-cys-tyr-d-trp-lys-thr-cys-thr-ol(cys2-cys7)，由八个氨基酸组成，一端标记dota，并含有一对二硫键的环八肽。是一种结合多种核素的物质，能够定位恶性癌细胞而不损害正常细胞，主要用于治疗和诊断某些类型的癌症，适用的特异性癌症包括神经母细胞瘤、儿童脑肿瘤和胃肠道癌症。
但是该化合物目前缺少工业化合成的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的依那曲肽的合成方法。主要解决该化合物目前缺少工业化合成的方法的技术问题。
本发明的技术方案为：一种依那曲肽的固相合成法，包括以下步骤：
（1）将fmoc-thr(tbu)-ol与二氯三苯基氯树脂偶联得到fmoc-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂；
（2）通过固相合成法依次连接剩下的氨基酸，得到依那曲肽树脂肽i：
fmoc-d-phe-cys(acm)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-lys(boc)-thr(tbu)-cys(acm)-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂；
（3）树脂上用碘氧化成环，得到依那曲肽树脂肽ii:
fmoc-d-phe-cys-tyr(tbu)-d-trp(boc)-lys(boc)-thr(tbu)-cys-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂(cys2-cys7)；
（4）脱fmoc保护，偶联dota(otbu)3-cooh，得到依那曲肽树脂肽iii:
dota(otbu)3-d-phe-cys-tyr(tbu)-d-trp(boc)-lys(boc)-thr(tbu)-cys-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂(cys2-cys7)；
（5）裂解得到依那曲肽粗品，再经反相色谱纯化精制、冻干得到依那曲肽精品。
具体步骤如下：
在二氯三苯基氯树脂中，加入fmoc-thr(tbu)-ol，加入二氯甲烷，diea，搅拌反应2小时，再加入甲醇震荡反应30分钟，过滤除去滤液；用二氯甲烷洗涤树脂三次，干燥，得到fmoc-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂。
将fmoc-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂置于多肽反应器中，加入脱保护试剂，氮气搅拌反应30分钟，抽干，再用dmf洗涤5次，加入相应的保护氨基酸，dic/hobt/diea为缩合剂，dmf做溶剂，反应60-120分钟，茚三酮检测反应终点，反应结束后抽真空排干反应液，用dmf洗涤3次，再加入脱保护试剂，依次循环，直至连完最后一个d型苯丙氨酸，得到依那曲肽树脂肽i，如式i所示；
fmoc-d-phe-cys(acm)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-lys(boc)-thr(tbu)-cys(acm)-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂
式i
脱保护试剂为体积比20%哌啶/dmf溶液，反应中所提到保护氨基酸依次是fmoc-cys(acm)-oh，fmoc-thr(tbu)-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-d-trp(boc)-oh，fmoc-tyr(tbu)-oh，fmoc-cys(acm)-oh，fmoc-d-phe-oh。
在依那曲肽树脂肽i中，加入环化试剂，搅拌反应10-30分钟，真空排干液体，用dmf洗涤5次，得到依那曲肽树脂肽ii，如式ii所示；
fmoc-d-phe-cys-tyr(tbu)-d-trp(boc)-lys(boc)-thr(tbu)-cys-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂(cys2-cys7)
式ii
环化试剂为碘的甲醇溶液或碘的dmf溶液，其浓度在1mm-10mm之间。
在依那曲肽树脂肽ii中，加入体积比20%哌啶/dmf脱保护试剂，氮气搅拌反应30分钟，抽干，再用dmf洗涤5次，加入dota(otbu)3-cooh，hatu/nmm为缩合剂，dmf做溶剂，反应30-60分钟，茚三酮检测反应终点，反应结束后抽真空排干反应液，用dmf洗涤3次，再用甲醇洗涤三次收缩树脂，真空干燥12小时得到依那曲肽树脂肽iii，如式iii所示；
dota(otbu)3-d-phe-cys-tyr(tbu)-d-trp(boc)-lys(boc)-thr(tbu)-cys-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂(cys2-cys7)
式iii
在依那曲肽树脂肽iii中，加入裂解试剂，常温条件下反应2小时，抽滤滤去树脂颗粒，收集滤液，加入乙醚结晶析出白色固体，抽滤除去滤液，收集白色固体滤饼，真空干燥24小时得到依那曲肽粗品，再经反相色谱纯化精制、冻干得到依那曲肽精品。
裂解试剂的体积配比为tfa:tis:h2o=95:3:2。
本发明中一些常用缩写具有以下含义：
dic:n,n'-二异丙基碳二亚胺
hobt:1-羟基苯并三氮唑
hatu：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸盐；
nmm：n-甲基吗啉；
diea：n,n-二异丙基乙胺；
fmoc：芴甲氧羰基；
tbu：叔丁基
boc：叔丁氧羰基
acm：乙酰氨基甲基
thr-ol：苏氨醇；
cys：半胱氨酸；
thr：苏氨酸；
lys：赖氨酸；
trp：色氨酸；
tyr：酪氨酸；
phe：苯丙氨酸
dota：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-n,n,n,n-四乙酸；
dmf：n,n-二甲基甲酰胺；
tfa：三氟乙酸
tis：三异丙基硅烷
2cl-trtcl树脂：二氯三苯基氯树脂。
本发明的有益效果是：本发明创造性的选择了acm作为cys的保护基，先在树脂上氧化成环，再标记核素dota，避免常规液相方法成环容易造成大量废水，该方法反应条件温和，无毒害，收率高，污染小，利于后期工业化放大，具有极大的应用价值。
附图说明
图1为本发明产物色谱图。
图2为本发明产物质谱图。
具体实施方式
以下将参照实例对本发明做进一步的详细描述，但本发明不限于这具体实例。
实施例1
（1）制备fmoc-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂
称取二氯三苯基氯树脂10g，fmoc-thr(tbu)-ol3.84g（mw:383.5，10mmol），加入180ml二氯甲烷，20mldiea，反应2小时，加入100ml甲醇，反应30分钟，过滤除去滤液，树脂用二氯甲烷洗涤3次，得到fmoc-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂；
（2）制备依那曲肽树脂肽i
将fmoc-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂置于多肽反应器中，加入200ml脱保护试剂，氮气搅拌反应30分钟，抽干，dmf洗涤5次，称取保护氨基酸，缩合剂，加入到反应器中，再加入100mldmf，氮气搅拌反应60-120分钟，茚三酮检测反应终点，反应结束后排干反应液，dmf洗涤3次，反复循环，直至连完最后一个氨基酸，得到依那曲肽树脂肽i；
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
fmoc-cys(acm)-oh（4.15g），
fmoc-thr(tbu)-oh（3.98g），
fmoc-lys(boc)-oh（4.69g），
fmoc-d-trp(boc)-oh（5.27g），
fmoc-tyr(tbu)-oh（4.6g），
fmoc-cys(acm)-oh（4.15g），
fmoc-d-phe-oh（3.87g）；
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：dic（1.55ml），hobt（1.35g），diea（3.31ml）；脱保护试剂为体积比20%的哌啶/dmf混合溶液；
（3）制备依那曲肽树脂肽ii
在依那曲肽树脂肽i中加入浓度为2mm的碘的甲醇溶液，搅拌反应20分钟，真空排干液体，用dmf洗涤5次，得到依那曲肽树脂肽ii；
（4）制备依那曲肽树脂肽iii
在依那曲肽树脂肽ii中，加入体积比20%哌啶/dmf脱保护试剂，氮气搅拌反应30分钟，抽干，再用dmf洗涤5次，加入dota(otbu)3-cooh(5.73g)，hatu(3.6g)，nmm(2.27ml)，dmf做溶剂，反应30-60分钟，茚三酮检测反应终点，反应结束后抽真空排干反应液，用dmf洗涤3次，再用甲醇洗涤三次收缩树脂，真空干燥12小时得到依那曲肽树脂肽iii
（5）制备依那曲肽
取步骤（4）中的依那曲肽树脂肽iii共18.9g置于500ml圆底烧瓶中，加入200ml裂解液，配比为tfa:tis:h2o=95:3:2（v/v），置于摇床中常温震荡反应2小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，加入乙醚结晶析出白色固体，抽滤除去滤液，收集白色固体滤饼，真空干燥24小时得到依那曲肽粗品7g，再经反相色谱纯化精制、冻干得到纯度98%依那曲肽精品3.2g，收率达到45%。产品的色谱和质谱见图1、2。
实施例2
（1）制备fmoc-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂
称取二氯三苯基氯树脂10g，fmoc-thr(tbu)-ol3.84g（mw:383.5，10mmol），加入180ml二氯甲烷，20mldiea，反应2小时，加入100ml甲醇，反应30分钟，过滤除去滤液，树脂用二氯甲烷洗涤3次，得到fmoc-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂；
（2）制备依那曲肽树脂肽i
将fmoc-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂置于多肽反应器中，加入200ml脱保护试剂，氮气搅拌反应30分钟，抽干，dmf洗涤5次，称取保护氨基酸，缩合剂，加入到反应器中，再加入100mldmf，氮气搅拌反应60-120分钟，茚三酮检测反应终点，反应结束后排干反应液，dmf洗涤3次，反复循环，直至连完最后一个氨基酸，得到依那曲肽树脂肽i；
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
fmoc-cys(acm)-oh（4.15g），
fmoc-thr(tbu)-oh（3.98g），
fmoc-lys(boc)-oh（4.69g），
fmoc-d-trp(boc)-oh（5.27g），
fmoc-tyr(tbu)-oh（4.6g），
fmoc-cys(acm)-oh（4.15g），
fmoc-d-phe-oh（3.87g）；
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：dic（1.55ml），hobt（1.35g），diea（3.31ml）；脱保护试剂为体积比20%的哌啶/dmf混合溶液；
（3）制备依那曲肽树脂肽ii
在依那曲肽树脂肽i中加入浓度为5mm的碘的甲醇溶液，搅拌反应15分钟，真空排干液体，用dmf洗涤5次，得到依那曲肽树脂肽ii；
（4）制备依那曲肽树脂肽iii
在依那曲肽树脂肽ii中，加入体积比20%哌啶/dmf脱保护试剂，氮气搅拌反应30分钟，抽干，再用dmf洗涤5次，加入dota(otbu)3-cooh(5.73g)，hatu(3.6g)，nmm(2.27ml)，dmf做溶剂，反应30-60分钟，茚三酮检测反应终点，反应结束后抽真空排干反应液，用dmf洗涤3次，再用甲醇洗涤三次收缩树脂，真空干燥12小时得到依那曲肽树脂肽iii；
（5）制备依那曲肽
取步骤（4）中的依那曲肽树脂肽iii共19.2g置于500ml圆底烧瓶中，加入200ml裂解液，配比为tfa:tis:h2o=95:3:2（v/v），置于摇床中常温震荡反应2小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，加入乙醚结晶析出白色固体，抽滤除去滤液，收集白色固体滤饼，真空干燥24小时得到依那曲肽粗品7.1g，再经反相色谱纯化精制、冻干得到纯度98%依那曲肽精品3.5g，收率达到49%。产品的色谱和质谱见图1、2。
实施例3
（1）制备fmoc-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂
称取二氯三苯基氯树脂10g，fmoc-thr(tbu)-ol3.84g（mw:383.5，10mmol），加入180ml二氯甲烷，20mldiea，反应2小时，加入100ml甲醇，反应30分钟，过滤除去滤液，树脂用二氯甲烷洗涤3次，得到fmoc-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂；
（2）制备依那曲肽树脂肽i
将fmoc-thr(tbu)-ol-2cl-trtcl树脂置于多肽反应器中，加入200ml脱保护试剂，氮气搅拌反应30分钟，抽干，dmf洗涤5次，称取保护氨基酸，缩合剂，加入到反应器中，再加入100mldmf，氮气搅拌反应60-120分钟，茚三酮检测反应终点，反应结束后排干反应液，dmf洗涤3次，反复循环，直至连完最后一个氨基酸，得到依那曲肽树脂肽i；
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
fmoc-cys(acm)-oh（4.15g），
fmoc-thr(tbu)-oh（3.98g），
fmoc-lys(boc)-oh（4.69g），
fmoc-d-trp(boc)-oh（5.27g），
fmoc-tyr(tbu)-oh（4.6g），
fmoc-cys(acm)-oh（4.15g），
fmoc-d-phe-oh（3.87g）；
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：dic（1.55ml），hobt（1.35g），diea（3.31ml）；脱保护试剂为体积比20%的哌啶/dmf混合溶液；
（3）制备依那曲肽树脂肽ii
在依那曲肽树脂肽i中加入浓度为5mm的碘的dmf溶液，搅拌反应15分钟，真空排干液体，用dmf洗涤5次，得到依那曲肽树脂肽ii；
（4）制备依那曲肽树脂肽iii
在依那曲肽树脂肽ii中，加入体积比20%哌啶/dmf脱保护试剂，氮气搅拌反应30分钟，抽干，再用dmf洗涤5次，加入dota(otbu)3-cooh(5.73g)，hatu(3.6g)，nmm(2.27ml)，dmf做溶剂，反应30-60分钟，茚三酮检测反应终点，反应结束后抽真空排干反应液，用dmf洗涤3次，再用甲醇洗涤三次收缩树脂，真空干燥12小时得到依那曲肽树脂肽iii；
（5）制备依那曲肽
取步骤（4）中的依那曲肽树脂肽iii共19g置于500ml圆底烧瓶中，加入200ml裂解液，配比为tfa:tis:h2o=95:3:2（v/v），置于摇床中常温震荡反应2小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，加入乙醚结晶析出白色固体，抽滤除去滤液，收集白色固体滤饼，真空干燥24小时得到依那曲肽粗品7.1g，再经反相色谱纯化精制、冻干得到纯度98%依那曲肽精品3.7g，收率达到52%。产品的色谱和质谱见图1、2。