一种高纯度褐藻寡糖的制备方法与流程

本发明涉及褐藻深加工领域，特别涉及一种高纯度褐藻寡糖的制备方法。

背景技术：

海带是一种具有多种保健功能的大型经济褐藻，在中国东部沿海分布广泛，其产量居世界之最。海带加工技术水平的提升促进了海带精深加工的发展，随着褐藻胶裂解酶及其高产微生物菌株的不断发现，褐藻胶裂解酶已成为海带精深加工的重要工具酶，随着其β消去机制研究的深入，干海带中高达20%以上的褐藻多糖可以被褐藻胶裂解酶降解为以甘露糖醛酸或古罗糖醛酸为基本单元的寡糖或单糖。褐藻寡糖具有显著的调节免疫、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血和抗氧化等功能，褐藻寡糖的相关研究也已成为国内外研究者关注的热点。

现有技术中干海带和鲜海带常被用作研究的原料，这种海带原料经不同来源的褐藻胶裂解酶酶解后，酶解液中褐藻寡糖的含量一般在0.5%-2.0%之间，同时酶解液中又含有大量的矿物质、碘、甘露醇、盐藻糖等多种营养成分，可以应用于许多食品行业中，有时过多的矿物质和碘会限制海带酶解液在食品行业中的应用。

然而褐藻寡糖类功能产品的发展也需要高纯度的褐藻寡糖，有报道称采用离子交换树脂柱从制备的海带寡糖匀浆中分离到纯度较高的寡糖混合物，由于褐藻寡糖是由古罗糖醛酸和甘露糖醛酸组成的聚合度不同的混合物，而且粘度大小不一，从众多组分中将褐藻寡糖分离出来非常困难，分离工艺繁琐且分离成本相对较高。

技术实现要素：

为了弥补现有技术很难得到高纯度褐藻寡糖的不足，本发明提供了一种低成本高纯度褐藻寡糖的制备方法。

本发明的技术方案为：

产褐藻胶裂解酶的棒状杆菌菌株XS1412C，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No：2015149，其保藏时间为：2015年03月30日。

一种高纯度褐藻寡糖的制备方法，包括步骤：

1）用水清洗海带汁生产中水浸提后的海带下脚料；

2）将海带下脚料用打浆机搅打成海带浆；

3）调整pH为6.5-8.5，加入菌株XS1412C发酵所产褐藻胶裂解酶，在25℃-35 ℃下搅拌酶解4 h-12h；

4）离心分离未酶解的海带渣（主要为纤维素），收集上清液即得高纯度褐藻寡糖。

作为优选方案，步骤1）中，海带下脚料为干海带加水浸泡0.2-2小时，然后升温至50-90℃浸提1-5小时后的海带。

作为优选方案，步骤2）中，将海带下脚料搅打成100-200目的海带浆。

作为优选方案，利用菌株XS1412C产褐藻胶裂解酶的方法为：发酵培养基配方：褐藻胶3g-10g、磷酸氢二钾0.3g-1.2g、氯化铵0.8g-3.5g、陈海水0.3L-1.0L，pH 6.5-8.5；发酵条件为：按3%-6%接种量接种培养基，在26℃-35 ℃，120r/min-200r/min振荡培养10h-20h，得到XS1412C菌的褐藻胶裂解酶酶液。

作为优选方案，步骤3）中，褐藻胶裂解酶的重量为海带浆重量的0.05%-1%。

作为优选方案，步骤3）中，酶解温度为28℃-32℃。

作为优选方案，步骤3）中，搅拌速度为100r/min-200r/min。

作为优选方案，步骤4）中，在转速4000-5000r/min下离心5-15min。

作为优选方案，步骤4）中，将高纯度褐藻寡糖溶液浓缩后喷雾干燥或冷冻干燥制得粉末状高纯度褐藻寡糖。

本发明的有益效果为：

1、利用海带汁生产的下脚料作为原料，而不是现有技术中所用的干海带或者鲜海带为原料，海带汁生产的下脚料海带经过水浸提后，矿物质、碘、甘露醇、半乳糖、盐藻聚糖等可溶性的绝大部分组分都进入到海带浸提液中，海带下脚料剩余的成分主要是以钙盐形式存在的褐藻多糖和海带纤维等，其成分简单，褐藻多糖含量相对提高，可用来生产高纯度的褐藻寡糖，同时可以省去繁琐的分离工序，降低生产成本，实现废物综合利用。

2、酶解过程中添加的褐藻胶裂解酶是利用筛选到的海洋微生物（菌株XS1412C）经发酵制备的，其粗酶酶活为230U/mL，浓缩后酶活可达1000U/mL，在pH呈中性和弱碱性条件下可以快速将褐藻多糖降解为褐藻寡糖（2~7糖和7糖以上的寡糖混合物），利用该褐藻胶裂解酶酶解过程条件温和，酶解速度快。

3、本发明所得褐藻寡糖总量占比大于80%，远远高于文献报道的18.9%。本发明所得褐藻寡糖中纯度非常高，非糖杂质含量小于15%。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例2所得产品的高效凝胶渗透色谱图。

具体实施方式

产褐藻胶裂解酶的棒状杆菌（Corynebacterium sp.）菌株XS1412C，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No：2015149，其保藏时间为：2015年03月30日；保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

褐藻胶裂解酶的制备：

发酵培养基配方：褐藻胶6g、磷酸氢二钾0.8g、氯化铵2.1g、陈海水0.6L，pH 7.2；

发酵：XS1412C菌按4%接种量接种培养基，在30 ℃，150r/min振荡培养15h，得到XS1412C菌的褐藻胶裂解酶粗酶液，粗酶酶活为230U/mL；经分离浓缩后酶活达1000U/mL。

高纯度褐藻寡糖的制备：

干海带加入浸提罐内，注入软化水（水的重量为海带重量的20倍），浸泡30分钟，然后升温至75℃，浸提2小时；浸提完毕，过滤，滤液用于制备海带汁，浸提后的海带作为高纯度褐藻寡糖的制备原料。

实施例1：

一种高纯度褐藻寡糖的制备方法：

取1000g浸提后的海带，用纯净水清洗干净；控水后用打浆机打成200目的海带浆；在自然pH下加入5g浓缩后的褐藻胶裂解酶酶液，转速150r/min，在28℃下酶解8h；在4200r/min条件下离心10min，收集上清液，采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定褐藻寡糖不同聚合度组成及相对含量。测得2～7糖的寡糖聚合度相对百分含量依次为12.2%，8.5%，17.1%，9.5 %，5.8%，5.2%；7糖以上的寡糖含量为27.6%；2～7糖总量为58.3%，褐藻寡糖总含量高达85.9%；非糖杂质含量仅为14.1%。检测结果表明该酶解液中褐藻寡糖含量纯度较高。

实施例2：

一种高纯度褐藻寡糖的制备方法：

取1000g浸提后的海带，用纯净水清洗干净；控水后用打浆机打成100目的海带浆；调整pH为6.5，加入3g浓缩后的褐藻胶裂解酶，转速120r/min，在30℃下酶解6h；在4200r/min条件下离心10min，收集上清液，采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定褐藻寡糖不同聚合度组成及相对含量，如图1所示。检测结果如表1所示，测得2～7糖的寡糖聚合度相对百分含量依次为12.8%，8.6%，17.4%，8.6 %，5.6%，4.9%；7糖以上的寡糖含量为29.1%；2～7糖总量为57.9%，褐藻寡糖总含量高达87%；非糖杂质含量仅为13.2%（由于百分含量计算过程中的四舍五入导致总和略高于100%）。检测结果表明该酶解液中褐藻寡糖含量纯度较高。

表1为实施例2所得褐藻寡糖产品的凝胶渗透色谱测试结果

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实施例3：

一种高纯度褐藻寡糖的制备方法：

取1000g浸提后的海带，用纯净水清洗干净；控水后用打浆机打成100目的海带浆；调整pH为8.5，加入7g浓缩后的褐藻胶裂解酶，转速180r/min，在35℃下酶解10h；在4200r/min条件下离心10min，收集上清液，采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定褐藻寡糖不同聚合度组成及相对含量。测得2～7糖的寡糖聚合度相对百分含量依次为10.2%，7.7%，16.5%，8.8%，6.5%，5.2%；7糖以上的寡糖含量为26.3%；非糖杂质含量为13.5%；2～7糖总量为54.9%，褐藻寡糖总含量高达81.2%。