本发明涉及嵌合抗原受体领域。具体来说，本发明涉及人源化cd-19嵌合抗原受体t淋巴细胞载体及其应用。
背景技术
血液系统恶性肿瘤和淋巴瘤在癌症中较为常见，在中国人中发病率分别为2.76人/10万和6.91人/10万，粗略估计每年发病人数约为3.7万和9.3万。大多数患者用传统的化疗、放疗均无法治愈，骨髓/外周血干细胞移植被认为是治愈血液肿瘤的有效途径，对髓系血液肿瘤疗效较好，而b细胞急性淋巴细胞白血病移植后长期缓解率不到10％，且骨髓配型困难，费用高，移植后需常年服用免疫抑制剂。
最近几年，car-t细胞在血液肿瘤和淋巴瘤治疗中获得了突破性进展，为治愈癌症带来了希望。2011年car-t首次被用于治疗一例难治性急性淋巴细胞白血病患者获得成功，残留病灶消失，随访至今仍未复发。随后短短几年内，多家研究机构与生物医药公司在该领域进行了大量研究，证实该疗法在血液病治疗中效果优异，某些血液病治疗的完全缓解率可达到90％以上。国内多家研究机构和医院、生物公司也开始开展car-t治疗技术，并取得了良好的疗效，但较国外报道尚存在一定差距。
在目前报道的car-t治疗技术中ctl019在血液肿瘤治疗临床试验中取得了超过90％的完全缓解率，被美国fda正式批准应用于临床治疗，这是人类历史上的一个里程碑事件。cd19在多种b细胞恶性血液肿瘤细胞、b细胞淋巴瘤及部分髓系白血病细胞表面表达，包括非何杰金病、急性淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病等，除b细胞外，cd19一般不在正常组织表达，因为成为免疫治疗的良好靶点。基于这一认识，利用识别cd19的单链抗体经基因工程技术与人类t细胞受体胞内区激活信号cd3ζ链接，同时链接上系统刺激信号分子4-1bb、cd28等，构建了嵌合抗原受体，通过细胞融合或电转等方式将car转移到患者的t细胞上构建car-t细胞，从而突破mhc限制性，经体外扩增后，回输到患者体内，在b细胞/肿瘤细胞表面的cd19抗原后，在体内增殖、活化，靶向性杀伤肿瘤细胞；协同刺激因子的存在增强了t细胞增殖能力和增加了细胞因子的释放，增强了杀伤肿瘤细胞的效应。因此，car-t技术被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。
随着对肿瘤认识的加深和基因工程技术的发展，car-t技术发展迅速。car-t为识别特异性肿瘤相关抗原的单链抗体与免疫细胞激活结构构成的人工重组受体，经过三代的研发，现已发展到第四代技术。第一代car-t技术仅含单链可变区域与t细胞激活信号cd3ζ；第二代和第三代增加1-2个协同刺激信号分子4-1bb、ox-40、cd28等；第四代则增加了转基因免疫调节剂来重塑肿瘤微环境。目前三代技术已开始运用于临床，而四代技术仍在研发阶段。
car-t技术在肿瘤治疗中取得了举世瞩目的成就，但仍需进一步进行优化以提高安全性，主要技术难点：1)寻找严格的肿瘤特异性分子标识，预防靶向及脱靶毒性：工程改造t细胞的抗原杀伤肿瘤细胞，致肿瘤细胞裂解而导致溶瘤综合征，以及car-t靶向于正常组织表面表达的靶点导致的脱靶效应，如靶向b细胞表面靶点如cd19时，在清除白血病细胞同时，也清除正常b细胞，从而导致b细胞删除(b细胞无能)。临床试验中已出现因靶向错误导致的死亡病例。所有的靶向毒性均是由于改造的t细胞无法区别表达靶向抗原的正常细胞和肿瘤细胞所致。在设计car结构的过程中，筛选高亲和力的car-t，并研究其对靶蛋白之外的其他抗原表位的识别十分必要。2)突破肿瘤微环境，降低复发率：目前已开展的试验中，虽然应答率和完全缓解率都保持在很高的水平，残留病灶清除效果较好，但患者的复发率仍时有发生。2015年诺华公司ctl019临床试验报告治疗后完全缓解率在90％以上，约有25％的病例在1年内复发。3)细胞因子风暴(crs)控制：基因修饰的t细胞回输后，大量肿瘤细胞的破坏导致短时间内细胞因子大量释放，引起惊人的炎症反应，导致高热、低血压甚至器官衰竭。car-t细胞临床应用中存在的问题，寻找特异性抗原、突破肿瘤抑制性微环境、抑制临床治疗中细胞因子风暴成为当前肿瘤免疫治疗的难点。
技术实现要素：
发明目的
针对现有cd19car-t技术存在的难点，本发明提供了一种人源化cd-19嵌合抗原受体t淋巴细胞载体，具有多靶向功能，增强靶向cd19抗原转基因t细胞特异性，克服肿瘤微环境抑制免疫细胞功能，控制临床治疗中细胞因子风暴的作用。
技术方案
本发明的技术方案在于提供一种人源化cd-19嵌合抗原受体t淋巴细胞载体，其特征在于：包含编码cd19单抗、核小体组蛋白单抗和fnedb单抗的单链可变区基因的质粒载体。
所述的编码cd19单抗单链可变区基因的核苷酸序列，为:
所述的编码核小体组蛋白单抗单链可变区基因的核苷酸序列，为：
所述编码fnedb单抗单链可变区基因的核苷酸序列，为：
所述载体为慢病毒载体。所述人源化cd-19嵌合抗原受体t淋巴细胞载体在制备cart细胞中的用途。也用于转导t淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞。其应用在于治疗肿瘤。优选治疗恶性淋巴瘤药物中的复发、难治和骨髓移植配型不成功的血液肿瘤和淋巴瘤。
本发明的技术方案，在新一代car-t分子构建关键技术基础上构建人源化cd-19嵌合抗原受体t淋巴细胞载体：通过选择特异性肿瘤抗原构建新型含核小体抗体的car-t分子；引入了仅在肿瘤新生血管上表达的纤连蛋白额外结构域b(fibronectinextradomainb，fnedb)的识别序列，增加肿瘤微环境特异抗体到car-t分子上，实现突破肿瘤抑制性微环境。采用弱化抗原和识别抗原表达差异，达到控制临床治疗中细胞因子风暴的要求；优化载体，增加自杀基因，增加了转化效率。
有益效果
本发明的有益效果在于：(1)本发明构建的病毒载体修饰的免疫细胞疗法，具有弱抗原性和自我消除的优点，以达到在临床中控制毒副作用的目的。通过构造弱抗原化优点，以达到在临床中控制毒副作用的目的。通过构造弱抗原化car受体，不易引起人的排异反应。另外设计医疗方案可用药物将转基因t细胞消除，其它项目开发的载体无此功能。新的疗法避免了通常转基因t-细胞杀伤正常细胞的毒副作用。(2)本发明构建的病毒载体修饰的免疫细胞增加针对肿瘤微环境特有靶点，且修饰的免疫细胞含多种免疫细胞成分，可突破抑制性微环境的限制。(3)car修饰免疫细胞后稳定性强。本发明构建的病毒载体修饰的免疫细胞的关键包括规模生产融合基因转化载体的gmp流程，生产过程的检验、产品测试，病人t细胞转化的gmp流程等细节。其中，病人的t细胞转化技术比较关键。本发明高效地转化人t细胞。而且转基因t细胞无需大规模扩增。
本发明构建的病毒载体半数细胞感染剂量ccid50＝1.75×105，则滴度约为1.2×105pfu/ml。对cd19阳性的nalm6，raji细胞的体外杀伤率为100％。临床试验结果显示，输入本发明构建的t病淋巴细胞后，患者的完全缓解率在60％以上，生存期延长，生活质量得到提高；在试验的100名患者中未出现肿瘤溶解综合征、细胞因子释放综合征和慢病毒感染。
本发明将技术费用成本降低到15-20万/例左右，不高于或低于骨髓移植的20-30万/例，降低患者及医保的医疗支出；本发明制定的car-t技术具有规范性，操作简单的特点，可向各大医院，包括基层医院进行推广。
附图说明
图1本发明car-t19分子及载体构建示意图。
图2本发明构建载体的病毒滴度测定。
图3本发明构建的cd19-cart对不同细胞杀伤试验结果(a)nalm6(cd19阳性)，(b)raji(cd19阳性)，(c)k562(cd19阴性)，(d)原代白血病细胞，*p<0.05，**p<0.01，n＝3。
图4抽取10名患者回输本发明构建载体的cd19car-t细胞后il-6，tnf-α等细胞因子，以及c-反应蛋白(crp)和乳酸脱氢酶(ldh)的水平变化。(a)il-6，(b)tnf-α，(c)crp，(d)ldh。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该理解，下述实施例仅是为了用于说明本发明，并不对发明内容进行限定。
实施例中所用原料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或制得。
实施例1.
构建anti-nucleosome-fnedb-cd19car基因
(1)anti-nucleosome-fnedb-cd19car基因的设计：该序列由cd19的scfv基因(seqidno1)，fnedb的scfv基因(seqidno3)，核小体(seqidno2)的scfv基，胞浆区片4-1bb(enst00000374478)，cd3zeta基因(enst00000392122)，和car结构基因cd8序列(enst00000283635)连接而成，两条基因序列之间通过40-50nt核苷酸序列连接，并在序列的两端分别引入hindⅲ和ecori限制酶切位点。
(2)所设计的anti-nucleosome-fnedb-cd19car基因由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所设计的基因在公司提供的质粒hf392上。
(3)根据genebank库中的基因序列，设计anti-nucleosome-fnedb-cd19car基因的引物，上游引物p1(5′-cttaagcctatgcaggtccaactgca-3′)和下游引物p2(5′-ctgaattcctagcgagttgca-3′)。以质粒hf392为模板，p1和p2为扩增引物，反应条件为：92℃2min；98℃30s，50℃1min，70℃1min，共30个循环扩增序列。得到的pcr产物经hindⅲ和ecori酶切后，进行凝胶电泳，回收胶。测序正确后(上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列分析)，得到anti-nucleosome-fnedb-cd19car基因。
实施例2
构建anti-nucleosome-fnedb-cd19car慢病毒表达载体
(1)构建anti-nucleosome-fnedb-cd19carfnedb慢病毒表达载体：
将anti-nucleosome-fnedb-cd19car基因片段克隆到慢病毒载体pcdnatm3.1(+)上，选用的插入酶切位点是nhei/bamhi。用rpmi1640+10％fbs培养293t细胞。待细胞90％融合后，用lipo2000混合转染质粒，转染293t细胞。转染方法按照invitrogen厂商的标准操作，质粒有：表达质粒，pmdlg/prre，prsv-rev，pmd2.0g，将质粒按照摩尔比混合。24-48小时后收获慢病毒上清。然后加clontech的lenti-xconcentrator，混合后1500g，4℃。离心45min，去除上清，获取慢病毒沉淀，即anti-nucleosome-fnedb-cd19car慢病毒表达载体构建成功。
(2)病毒滴度检测：
采用稀释计数法测定病毒滴度：293t细胞在10cm培养皿中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用3mld-hank溶液洗涤细胞两次；加入1mltrypsin-edta溶液，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置3-5分钟；加入2ml含10％fbs的dmem培养基，吹打细胞形成单细胞悬液；将3×104细胞/孔的浓度接种于96孔板，混匀后37℃5％二氧化碳继续培养24小时；将构建的anti-nucleosome-fnedb-cd19car慢病毒载体原液10ul，用10％fbs的dmem培养液10倍连续稀释10个滴度，移去细胞培养液，加入稀释后的病毒液0.1ml，同时建立对照，37℃5％二氧化碳过夜；吸去96孔板中的稀释病毒液，每孔加入100ul10％fbs的dmem培养液，37℃5％二氧化碳过夜；通过荧光显微镜计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度，如图3所示，x轴为lg(稀释倍数)，y轴为效应比率(％)，标准曲线公式为y＝-10.748x+106.34，r2＝0.9765，根据标准曲线计算出本发明构建的病毒半数细胞感染剂量ccid50＝1.75×105，则滴度约为1.2×105pfu/ml。
实施例3
anti-nucleosome-fnedb-cd19car慢病毒表达载体的细胞杀伤实验：
(1)制备car-t细胞：
采集50-60ml患者静脉血；离心，2000rpm，10min，吸取血浆，56℃水浴30min；用pbs将血沉淀稀释一倍，加入20ml淋巴细胞分层液上，离心，2000rpm，20min；收集白细胞层细胞，pbs洗涤3次，然后使用台盼蓝细胞计数；gt-551培养液重悬细胞，选择anti-cd3单克隆抗体包被的培养瓶，转移细胞，并加入500u/mlril-2，置于37℃、5％co2孵箱中培养。培养细胞第2天，加入200μl本发明实施例2得到的慢病毒载体与2μl1×10-6u鱼精蛋白，共培养12小时后换液，并加入500u/mlril-2；培养第4天，移入培养瓶继续培养，得到cart-19细胞。
(2)细胞杀伤实验
采用calcein释放实验测定本发明的慢病毒表达载体转染cart-19细胞分别对nalm6(cd19阳性)，raji(cd19阳性)，k562(cd19阴性)和原代白血病细胞杀伤作用。
具体方法如下：以本发明的慢病毒表达载体转染cart-19细胞(简称为cart-19细胞)作为效应细胞；nalm6(cd19阳性)，raji(cd19阳性)，k562(cd19阴性)和原代白血病细胞作为靶细胞进行实验；分组：1：cart-19组；2：非转染t细胞组；3：空白组；4：靶细胞组。步骤：先将靶细胞用5μmol/lcalceinam37℃水浴30min进行标记；按e/t比例：50/1、25/1、12.5/1、6.25/1、3.13/1、1.56/1，原代白血病细胞效靶比为25：1，(空白组不添加靶细胞)加入圆底96孔培养板中，靶细胞和效应细胞各100μl/孔，每个比例3复孔。效-靶细胞作用96孔培养板在37℃5％co2培养箱孵育4h后，3000r/min离心5min，将上清移入新的孔中。用荧光测量仪检测上清的荧光值(fi)，激发光为485nm，发射光为538nm。在板式荧光扫描仪上定量测定活细胞内的荧光强度，与靶细胞对照孔(代表细胞100％存活)比较。即可计算效应细胞杀伤靶细胞百分比。
计算本发明的慢病毒表达载体转染cart-19对不同效应细胞；nalm6(cd19阳性)，raji(cd19阳性)，k562(cd19阴性)和原代白血病细胞的杀伤率。
结果显示：cart-19细胞相对于非转染的t细胞对k562细胞没有杀伤优势(p>0.05)。但是，在nalm6，raji细胞中，相比于非转染的t细胞组，cart-19细胞具有显着细胞毒性作用(p<0.01)，表明来自病人cart-19细胞能够特异性的杀伤cd19阳性的细胞。同时，当cart-19细胞与靶细胞原代白血病细胞按25：1，50：1共培养6h后，同样发现cart-19细胞可以杀伤原代白血病细胞(p<0.05)。
实施例4
用人b细胞淋巴瘤移植瘤模型检测本发明的慢病毒表达载体转染cart-19对小鼠生存期的影响。
6-8w龄nsg免疫缺陷小鼠，小鼠随机分成2组，雌雄各半，每组10只。(1)非感染t细胞组；(2)本发明的慢病毒表达载体转染cart-19(简称为cart-19细胞)组。建立人b细胞淋巴瘤移植瘤模型，在接种淋巴瘤细胞后的第7天，尾静脉注射cart-19细胞(1×107细胞，200ul/只)或非感染t细胞。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，cart-19细胞可有效地保护荷瘤小鼠，生存率为70.0％。
实施例5
anti-nucleosome-fnedb-cd19car慢病毒表达载体临床试验：
(1)临床试验的目标：采用本发明的慢病毒表达载体治疗100例复发、难治和骨髓移植配型不成功的血液肿瘤和淋巴瘤患者：确定anti-nucleosome-fnedb-cd19car慢病毒表达载体转导的car-t细胞(以下简称为car-t细胞)是否安全。
(2)治疗方案：100例符合纳入标准的患者，经治疗后，每4周进行健康评估，并采血分析car-t细胞存在情况，分析骨髓和淋巴结中car-t细胞的状况。6个月后，每3个月检查一次。2年后改为常规的电话随访。
治疗终止：发生下述问题，需及时终止治疗；①发生与预期相反事件；②从患者获得的细胞体外处理过程生产car-t细胞转化效率、纯度、活性等未达到回输要求；③新出现恶性肿瘤转移灶。
(3)试验对象选择
纳入标准：恶性肿瘤细胞表达cd19表型的白血病和淋巴瘤患者中复发和难治性患者，用现有治疗方法治疗预计寿命在3个月到2年之间，符合下述条件①年龄>18岁；②既往接受≥两线方案化疗；③没有条件接受造血干细胞移植或造血干细胞/骨髓移植后复发；④无重要脏器衰竭，血液检测白细胞水平满足要求；⑤有可测量的靶病灶。所有患者在参与治疗签署相关伦理学文件。在本试验开展2年后纳入标准将进行调整，增加早期和中期患者。排除标准：①怀孕和哺乳期妇女；②存在未能有效控制的感染；③活动性乙肝/丙肝患者，hiv感染者；④中枢神经系统转移；⑤以往曾接受过基因疗法治疗；⑥同期接受类固醇系统性治疗；⑦治疗前可行性评估淋巴细胞转化率小于30％，或转化后淋巴细胞扩增低于5倍；⑧存在未能有效控制的异常情况者。患者募集和筛选：患者可来源于医院内或院外，资源参加，参与本试验的患者血液检测需有足够的t细胞数目，并能被携带car-t的慢病毒载体转化和体外扩增，开始前2周进行pbmc的采集和检测。志愿参加的患者在参加试验前必须明白本试验存在一定的风险。试验对象退出：①患者失访；②研究团队认为患者病情不适合继续治疗；③患者依从性差；④患者怀孕或取消所签署的伦理学文件；⑤恶性肿瘤快速进展，需要采取其他治疗方式控制病情；⑥出现严重副作用；⑦技术性问题或其他原因造成治疗不能继续。提前退出试验对象的资料收集和随访：对提前退出的已经接受car-t细胞治疗的患者，需随访收集毒性、免疫反应及长期的毒副作用。
(4)car-t细胞的制备：制备方法同实施例3。
(5)car-t细胞质量控制：
①输注前进行t细胞计数，检测cars基因转导效率，cd4+和cd8+的比率；②检测细胞表型：ccr7-/cd45ra-为效应记忆性细胞；ccr7+/cd45ra-为中央记忆性细胞；③检测杀伤功能：脱颗粒作用，分别与cd19表达和cd19缺失的细胞系共培养后，检测cd107a的表达水平，靶细胞数量改变情况；④检测体外共培养时主要细胞因子表达水平：il-2、tnf-α、ifn-γ；⑤细菌、真菌、支原体及内毒素检测，结果应呈阴性。
(6)car-t细胞的回输：①car-t细胞输注前预处理方案：pbmc采集后第二天使用环磷酰胺与氟达拉滨方案预处理。②car-t细胞输注数量：car-t细胞可一次性输入，也可分2-3次输入，输注car-t细胞在106-107/kg之间。
(7)细胞输注安全性评价：
①肿瘤溶解综合征评价：针对部分患者对car-t细胞非常敏感，大量肿瘤细胞坏死可能会发生肿瘤溶解综合征。以血肌酐、尿素氮及尿酸为评价指标，评价本发明制备的car-t细胞诱发肿瘤溶解综合征的安全性。
结果如表1。抽取10名患者回输后第1天血肌酐、尿素氮及尿酸的结果显示，在这10位患者中有1位患者的肌酐略超出正常范围，但并未引起肿瘤溶解综合征。一般情况下，在输注细胞后会常规给予水化、碱化尿液治疗，预防肿瘤溶解综合征。
表1抽取10名患者血肌酐、尿素氮及尿酸的结果
②细胞因子释放综合征(crs)：好发于输注后第4天～第15天。常见表现：发热、寒战、纳差、乏力等。严重表现：血氧饱和度下降，低血压、需要呼吸机支持等。以输注前和输注后第7和21患者的血氧饱和度和血压，以及il-6，tnf-α等细胞因子，以及crp和ldh水平变化为评价指标，评价本发明制备的car-t细胞诱发细胞因子释放综合征的安全性。
表2抽取10名患者血氧饱和度和血压的变化
抽取10名患者治疗前和输注后第7、21天血氧饱和度和血压的结果如表2显示。il-6，tnf-α等细胞因子，以及crp和ldh的水平变化图4。抽取的10名患者回输注后第7天il-6，tnf-α，以及crp和ldh的水平都升高，尤其是4号病人的crp和ldh均较高，回输注后第21天il-6，tnf-α，crp和ldh的指标普遍下降。这10位患者未出现低血压和血氧饱和度下降，均未发生细胞因子释放综合征。尽管如此，仍需要观察血压和血氧饱和度，以及il-6，tnf-α，crp和ldh等指标。
如出现细胞因子释放综合征采取对症治疗；对于出现严重表现的患者可以给予tnfα拮抗剂，一周内可重复给药一次。或者其进口制剂依那西普(etanercept)；一周内可重复给药一次。注意使用时，以低剂量开始，因为两药均有后续的免疫抑制作用。
③慢病毒感染风险：由于体外培养获得抗cd19car-t细胞过程中采用慢病毒作为载体，因此患者接受细胞治疗后可能有感染慢病毒的风险。但慢病毒作为载体已经应用20余年，已成功治疗多种遗传性疾病患者，并有患者已经随访十年以上，尚未发现有慢病毒感染病例。慢病毒载体已经通过20项以上临床实验核准，因此多年的经验证实感染慢病毒的风险很低。
由此可见，发明制备的car-t细胞未诱发细胞因子释放综合征、肿瘤溶解综合征，且病毒毒性较低，因此具有较高的安全性。
序列表
<110>山东省医学科学院附属医院，江苏艾洛特生物科技有限公司
<120>一种人源化cd-19嵌合抗原受体t淋巴细胞载体及其应用
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1380
<212>dna
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>1
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<211>2014
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<400>2
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